胰高血糖素樣肽-2對(duì)羔羊胃腸道重量、瘤胃發(fā)酵及小腸上皮發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

劉理想，孫大明，毛勝勇，劉軍花

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物研究室，南京 210095)

胰高血糖素樣肽-2(Glucagon-like peptide-2，GLP-2)是由33個(gè)氨基酸組成，腸L內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的一種腸上皮特異性生長(zhǎng)因子，其分泌受腸道營(yíng)養(yǎng)素[1]和營(yíng)養(yǎng)水平[2]的調(diào)控。GLP-2的功能包括促進(jìn)腸道發(fā)育、增強(qiáng)腸道屏障功能、增加血液流量及抗炎癥作用等[3]，而其中最主要的功能就是特異性地促進(jìn)腸黏膜生長(zhǎng)與損傷后修復(fù)[4]。大量研究發(fā)現(xiàn)，GLP-2可通過(guò)抑制隱窩細(xì)胞凋亡、促進(jìn)隱窩細(xì)胞增殖來(lái)增加絨毛高度和隱窩深度，從而刺激小腸上皮的生長(zhǎng)和發(fā)育[5]。對(duì)斷奶仔豬腸上皮細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的二肽基肽酶Ⅳ能夠促進(jìn)GLP-2對(duì)細(xì)胞增殖、代謝和細(xì)胞完整性的作用效果[6]。

基于GLP-2在維持其他物種(人、豬、大鼠和小鼠等)腸道穩(wěn)態(tài)中的重要作用，近年來(lái)人們開(kāi)始重視GLP-2在反芻動(dòng)物腸道發(fā)育中的作用。但相較人及單胃動(dòng)物上的研究，GLP-2在反芻動(dòng)物上的研究才剛剛起步。較早的研究發(fā)現(xiàn)，在代乳料和開(kāi)食料中添加丁酸鈉可以提高犢牛頸靜脈血漿中GLP-2的濃度[7]。近年來(lái)有研究在奶牛所有胃腸道組織都檢測(cè)到胰高血糖素GCG(GLP-2的前體物質(zhì))及GLP-2受體(GLP-2R)，尤其在小腸細(xì)胞中高度表達(dá)，證實(shí)了在反芻動(dòng)物胃腸道中同樣存在GLP-2信號(hào)系統(tǒng)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，日糧能量水平的增加可提高小腸GLP-2的分泌量，從而促進(jìn)小腸的發(fā)育，并提高葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體GLUT-2的表達(dá)量[8]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，皮下注射GLP-2可以促進(jìn)犢牛小腸黏膜的生長(zhǎng)及血液的流通[9]。近年來(lái)的研究結(jié)果也證實(shí)，GLP-2可作為藥物通過(guò)改善小腸黏膜細(xì)胞自我更新來(lái)緩解犢牛腹瀉[10]。最新研究進(jìn)展表明，甜味素可以通過(guò)刺激GLP-2分泌從而促進(jìn)犢牛小腸上皮的生長(zhǎng)發(fā)育[11]。基于以上研究背景可以看出，GLP-2系統(tǒng)存在于反芻動(dòng)物腸道中，并且其可促進(jìn)其腸道發(fā)育，但其中所涉及的分子機(jī)制并不清楚。

單胃動(dòng)物上的大量研究表明，GLP-2與小腸上皮的GLP-2R結(jié)合，刺激IGF-1的分泌，接著IGF-1結(jié)合IGF-1R，激活相應(yīng)的信號(hào)通路，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白和相應(yīng)的蛋白激酶來(lái)加快細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖[12]。反芻動(dòng)物同樣存在GLP-2系統(tǒng)，但其促進(jìn)小腸發(fā)育的機(jī)制是否與單胃動(dòng)物一致并不清楚。因此，本研究采用體外注射GLP-2試驗(yàn)，對(duì)羔羊小腸上皮Cyclins、CDKs、GCG、GLP-2R、IGF-1和IGF-1R mRNA表達(dá)進(jìn)行研究。研究結(jié)果將對(duì)深入認(rèn)識(shí)GLP-2調(diào)節(jié)羔羊小腸發(fā)育的分子機(jī)制具有重要意義。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)設(shè)計(jì)與動(dòng)物飼養(yǎng)

試驗(yàn)選擇10只體況良好，胎次一致，體重相近的新生羔羊(湖羊)，隨機(jī)分為兩組，每組5只。GLP-2組按50 μg·kg-1BW，每天分2次皮下注射GLP-2，間隔12 h, 連續(xù)注射14 d。對(duì)照組注射相應(yīng)體積的0.5%牛血清白蛋白(BSA)生理鹽水，注射時(shí)間同GLP-2組。牛血清白蛋白按1∶200的比例溶解在生理鹽水中，配置成0.5%的BSA生理鹽水溶液，GLP-2溶解于0.5%的BSA生理鹽水溶液(0.4 mg·mL-1)，現(xiàn)配現(xiàn)用。GLP-2由南京肽業(yè)生物科技有限公司合成，BSA購(gòu)自南京建成生物有限公司。10日齡時(shí)，羔羊開(kāi)始自由采食開(kāi)食料、苜蓿(18.09%粗蛋白, 26.06%粗纖維)和燕麥草(10.05%粗蛋白, 28.71%粗纖維)。試驗(yàn)期間，自由哺乳和飲水，每周最后一天于晨飼開(kāi)食料前稱量羔羊體重。羔羊28日齡時(shí)，對(duì)照組和GLP-2組分別皮下注射BSA和GLP-2。試驗(yàn)開(kāi)始前，兩組羔羊的體重沒(méi)有顯著差異((6.18±0.47) kgvs. (5.80±0.26) kg,P=0.504)。試驗(yàn)開(kāi)食料參考NRC(2007)[13]建議的綿羊羔羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制，開(kāi)食料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1開(kāi)食料組成與營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

Table1Ingredientandnutrientlevelsofthestarterdiet(drymatterbasis)

%

1.每千克預(yù)混料提供：維生素A 500 000 IU，維生素D 50 000 IU，維生素E 2 000 IU，F(xiàn)e 3.0 g，Zn 5.0 g，Cu 0.5 g，Mn 3.0 g，Co 0.1 g，I 50 mg，Se 40 mg；2.該數(shù)值是基于NRC(2007)[13]數(shù)據(jù)庫(kù)的計(jì)算值

1. Per kg premix contains: vitamin A 500 000 IU, vitamin D 50 000 IU, vitamin E 2 000 IU, Fe 3.0 g, Zn 5.0 g, Cu 0.5 g, Mn 3.0 g, Co 0.1 g, I 50 mg, Se 40 mg;2. The value is analyzed based on database of the NRC (2007)[13]

1.2　樣品采集

羔羊42日齡時(shí)，第一次注射2 h后進(jìn)行屠宰，屠宰前用含40單位肝素鈉的采血管采集頸靜脈血，于4 ℃ 3 000 r·min-1離心15 min后收集血漿，之后將其儲(chǔ)存在-20 ℃，待測(cè)血常規(guī)。屠宰后立即收集有代表性的瘤胃內(nèi)容物(至少200 mL)，四層無(wú)菌紗布過(guò)濾后立即測(cè)定pH，同時(shí)取過(guò)濾后的瘤胃液10 mL,分裝于2個(gè)5 mL的離心管，-20 ℃保存，待測(cè)揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度。屠宰后5 min之內(nèi)，將消化道分離稱量各器官重(瘤胃、瓣胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸)，采集十二指腸、空腸及回腸組織在冰的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)里清洗3次，將其組織剪成0.5 cm × 0.5 cm的小碎塊裝在2 mL的凍存管里置于液氮中保存，用于后續(xù)RNA的提取。

1.3　羔羊瘤胃及血液生理參數(shù)測(cè)定

用便攜式pH計(jì) (HI 9024C; HANNA Instruments，美國(guó)) 當(dāng)場(chǎng)測(cè)定瘤胃液pH。利用氣相色譜儀 (GC-14B, 島津, 日本; 毛細(xì)管柱: 30 m×0.32 mm×0.25 mm 膜厚度) 測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度，具體步驟參照秦為琳[14]的方法(柱溫為110 ℃，汽化室溫度為180 ℃，檢測(cè)器為180 ℃)。血漿葡萄糖濃度采用葡萄糖試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè))，利用葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶法測(cè)定。血漿GLP-2濃度根據(jù)GLP-2熒光酶免疫試劑盒(Phoenix Europe GmbH，德國(guó))操作說(shuō)明測(cè)定。血漿葡萄糖和GLP-2試劑盒的測(cè)量范圍分別是 3.89～6.11 mmol·L-1和0～10 000 pg·mL-1。

1.4　羔羊小腸上皮RNA的提取和cDNA的合成

取100 mg小腸上皮組織置于研缽中，倒入液氮快速充分研磨，按照Trizol試劑(TaKaRa，日本)的使用說(shuō)明提取小腸上皮組織總RNA。提取的總RNA使用Nano Drop分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度。所有樣品的吸收比例(OD260 nm/OD280 nm)都為1.8～2.0，證明RNA純度較高。用1.4%的瓊脂糖膠檢測(cè)RNA的完整性。將所有RNA濃度調(diào)整到1 μg·μL-1，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。用含基因組RNA酶的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrismScript RT reagent kit with gDNA Eraser(TaKaRa，日本))進(jìn)行cDNA的合成。

1.5　引物的合成和實(shí)時(shí)定量PCR

利用Q5 Real-time PCR儀(Applied Biosystems，美國(guó))對(duì)目的基因及內(nèi)參基因GAPDH進(jìn)行定量，GAPDH引物序列參照文獻(xiàn)[15]，實(shí)時(shí)定量PCR分析所用引物采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表2。用SYBR? Premix ExTaqTM(TaKaRa，日本)試劑盒進(jìn)行定量。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃，15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃，15 s。反應(yīng)體積20 μL：10 μL SYBR Premix ExTaq，0.4 μL ROX Reference Dye II, 10 μmol·L-1上下游引物各0.4 μL，2 μL樣品cDNA，6.8 μL無(wú)菌水。所有樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。目的基因的相對(duì)表達(dá)量以管家基因GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行校正，數(shù)據(jù)分析采用2-△△CT的方法。

表2本研究中所用引物序列

Table2Sequencesofprimerusedinthisstudy

基因名稱Genename基因IDGeneID引物序列(5'→3')Primersequence產(chǎn)物/bpProductsizeGCGNW_011943216.1F:CGGAAGAAGTCAACATCGTR:TAAAGTCTCGGGTAGCAAG119GLP-2RXM_004013306F:GGCCTACAGATACTGCCTGTCTR:GATGTAGTTACGTGTGCAGTGGA244IGF-1NM_001009774.3F:GCTCTCAACATCTCCCATCTCCR:CCCATTGCTTCTGAAGTGCAAA94IGF-1RNC_019475.2F:AGAAGATCACCATGAGCCGCR:TCACCGTCTTAATGGCCACC120CyclinANC_019478.2F:CTCTCCTATCACCGCCTGACR:CTTTGGGGTCCAAGTTCTGC144CyclinB1NM_001045872.1F:AGCGGATCCAAACCTTTGTAGTGR:CAATGAGGATGGCTCTCATGTTTC137CyclinD1NC_019478.2F:CCTGCCGTCCATGCGGAAR:GAACTTCACATCTGTGGCAC403CyclinEXM_015100542F:TGGCACCGATGTCTCTGTTCR:CCACACTGGCTTCTCACAGT114CDK1NM_174016.2F:CCAATAATGAAGTGTGGCCAGAAGR:AGAAATTCGTTTGGCAGGATCATAG164

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1.6　數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(means±SE)”表示。數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0中的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。采用GraphPad Prism 6.01 (www.graphpad.com) 軟件分析目的基因的mRNA表達(dá)量。P<0.05表示差異顯著。

2　結(jié)　果

2.1　注射GLP-2對(duì)羔羊體重的影響

如圖1所示，與對(duì)照組相比，GLP-2組羔羊出生重(P=0.947)、7日齡重(P=0.809)、14日齡重(P=0.845)、21日齡重(P=0.704)、28日齡重(P=0.504)、35日齡重(P=0.306)和42日齡重(P=0.224)無(wú)顯著變化。

2.2　GLP-2對(duì)羔羊器官重量的影響

如表3所示，與對(duì)照組羔羊相比，GLP-2組羔羊空腸重(P=0.083)和回腸重(P=0.060)有升高的趨勢(shì)，而瘤胃濕重(P=0.906)、瘤胃干重(P=0.585)、瓣胃濕重(P=0.804)、瓣胃干重(P=0.464)、十二指腸重(P=0.272)、盲腸重(P=0.540)及結(jié)腸重(P=0.295)無(wú)顯著變化。

圖1　注射GLP-2對(duì)羔羊體重的影響Fig.1　The effect of GLP-2 injection on body weight of lambs

表3注射GLP-2對(duì)羔羊器官重量的影響(n=5)

Table3EffectsofGLP-2injectiononorganweightoflambs(n=5)

項(xiàng)目Item對(duì)照組ControlgroupGLP-2組GLP-2groupP值P-value瘤胃濕重/kgWetweightofrumen0.81±0.040.80±0.030.906瘤胃干重/gDryweightofrumen130.80±9.69138.80±10.170.585瓣胃濕重/gWetweightofomasum15.05±2.2116.32±4.410.804瓣胃干重/gDryweightofomasum8.80±2.0210.85±1.720.464十二指腸重/gDuodenumweight11.15±1.6313.61±1.300.272空腸重/gJejunumweight170.20±13.87215.20±17.970.083回腸重/gIleumweight287.40±13.26330.60±14.620.060盲腸重/gCecumweight52.45±10.8961.00±7.730.540結(jié)腸重/gColonweight141.40±8.75174.00±27.720.295

濕重. 屠宰分離器官后直接稱重；干重. 去除內(nèi)容物后稱重

The wet weight of organs are directly weighed after separation of the organs; The dry weight of organs are weighed after removing the contents

2.3　注射GLP-2對(duì)羔羊瘤胃和血液參數(shù)的影響

如表4所示，與對(duì)照組羔羊相比，GLP-2組羔羊顯著升高了血漿GLP-2濃度(P=0.025)；GLP-2組羔羊瘤胃pH(P=0.624)、總VFA濃度(P=0.331)、乙酸濃度(P=0.169)、丙酸濃度(P=0.427)、丁酸濃度(P=0.164)、其他VFA濃度(P=0.970)、乙丙酸比(P=0.855)及血漿葡萄糖濃度(P=0.842)相對(duì)于對(duì)照組沒(méi)有顯著變化。

表4注射GLP-2對(duì)羔羊瘤胃發(fā)酵和血液參數(shù)的影響(n=5)

Table4EffectsofGLP-2injectiononrumenfermentationandbloodparametersoflambs(n=5)

項(xiàng)目Item對(duì)照組ControlgroupGLP-2組GLP-2groupP值P-value瘤胃參數(shù)RuminalparameterpH5.65±0.205.50±0.240.624總揮發(fā)性脂肪酸/(mmol·L-1)TotalVFA100.82±2.59104.79±2.830.331乙酸/(mmol·L-1)Acetate53.77±1.2056.81±1.620.169丙酸/(mmol·L-1)Propionate32.91±1.9134.99±1.590.427丁酸/(mmol·L-1)Butyrate11.02±0.459.87±0.600.164其他揮發(fā)性脂肪酸/(mmol·L-1)OtherVFA3.13±0.163.12±0.210.970乙丙酸比Acetate/Propionate1.65±0.081.63±0.070.855血液參數(shù)Bloodparameter血漿葡萄糖/(mmol·L-1)Plasmaglucose4.26±0.184.31±0.100.842血漿GLP-2/(pg·mL-1)PlasmaGLP-240.44±2.9850.47±2.070.025

其他揮發(fā)性脂肪酸=異丁酸+戊酸+異戊酸

Other VFA=Isobutyrate + Valerate + Isovalerate

2.4　注射GLP-2對(duì)羔羊小腸上皮周期蛋白mRNA表達(dá)的影響

如圖2A所示，與對(duì)照組相比，GLP-2注射顯著升高了十二指腸上皮CyclinB1(P=0.001)、CyclinD1(P=0.044)、CDK1(P=0.028)及CDK6(P=0.016)的mRNA表達(dá)，而CyclinA、CyclinE1、CDK2和CDK4的mRNA表達(dá)沒(méi)有顯著變化(P>0.05)；GLP-2組空腸上皮CyclinA(P=0.028)、CyclinB1(P=0.016)、CDK1(P=0.013)、CDK4(P=0.023)和CDK6(P=0.028)mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組，而CyclinD1、CyclinE1、CDK2的mRNA表達(dá)沒(méi)有顯著變化(P>0.05)；GLP-2注射顯著升高了回腸上皮CyclinA(P=0.025)、CyclinD1(P=0.001)、CDK2(P=0.013)、CDK4(P=0.020)的mRNA表達(dá)，而CyclinB1、CyclinE1、CDK1及CDK6的mRNA表達(dá)沒(méi)有顯著變化(P>0.05)。

2.5　注射GLP-2對(duì)羔羊小腸上皮GCG、GLP-2R、IGF-1及IGF-1R mRNA表達(dá)的影響

如圖2B所示，與對(duì)照組相比，GLP-2注射顯著升高了十二指腸上皮GCG(P=0.036)和IGF-1R(P=0.031)，空腸上皮GCG(P=0.049)、IGF-1(P=0.027)、IGF-1R(P=0.036)和GLP-2R(P=0.011)，回腸上皮GCG(P=0.025)、IGF-1(P=0.029)、IGF-1R(P=0.029)及GLP-2R(P=0.032)的mRNA表達(dá)；但對(duì)十二指腸上皮IGF-1(P=0.712)和GLP-2R(P=0.227)的mRNA表達(dá)沒(méi)有顯著影響。

3　討　論

本研究發(fā)現(xiàn)，皮下注射GLP-2并沒(méi)有影響羔羊的體重，與C.C.Taylor-Edwards等[9]在犢牛上的研究結(jié)果一致。這可能是由于試驗(yàn)動(dòng)物采食相同的日糧，能量攝入相同導(dǎo)致的。但相對(duì)于注射前，注射GLP-2后羔羊體重增加加快，一方面可能是由于GLP-2的作用，另一方面可能是受日齡增長(zhǎng)的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，GLP-2并沒(méi)有影響羔羊除小腸以外其他胃腸道的重量。C.C.Taylor-Edwards等[8]在牛前胃組織中檢測(cè)到GCG和GLP-2R mRNA的表達(dá)較低，但在小腸組織中表達(dá)較高。皮下注射GLP-2可能會(huì)使GLP-2經(jīng)過(guò)血液循環(huán)到達(dá)瘤胃，但由于瘤胃上皮缺乏GLP-2R的介導(dǎo)，無(wú)法啟動(dòng)相應(yīng)的下游通路，因此沒(méi)有影響羔羊瘤胃發(fā)育。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，GLP-2注射也沒(méi)有顯著影響羔羊瘤胃發(fā)酵，這可能與兩組羔羊采食相同的日糧有關(guān)。本研究中一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)是，GLP-2注射對(duì)羔羊空腸和回腸重量有增加的趨勢(shì)，這與在非反芻動(dòng)物中的發(fā)現(xiàn)類似[16]。這種增加可能是由于小腸隱窩細(xì)胞的增殖導(dǎo)致絨毛高度、隱窩深度和黏膜層的增加。GLP-2誘導(dǎo)小腸黏膜生長(zhǎng)在非反芻動(dòng)物中已有很多依據(jù)[17]，而在反芻動(dòng)物中的研究相對(duì)較少。

圖2　注射GLP-2對(duì)羔羊小腸上皮細(xì)胞周期蛋白和GCG、GLP-2R、IGF-1和IGF-1R mRNA表達(dá)的影響Fig.2　The effect of GLP-2 injection on mRNA expression of small intestinal epithelial cell cycle proteins and GCG, GLP-2R, IGF-1, IGF-1R of lambs

基于上述結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)GLP-2注射對(duì)羔羊小腸重量有增加的趨勢(shì)，接下來(lái)，我們將進(jìn)一步研究GLP-2促進(jìn)羔羊小腸發(fā)育的分子機(jī)制。單胃動(dòng)物上的許多研究表明，GLP-2具有促進(jìn)腸黏膜生長(zhǎng)發(fā)育，腸上皮隱窩細(xì)胞增殖的作用[18-19]，而小腸上皮細(xì)胞增殖又與細(xì)胞周期的變化密切相關(guān)。細(xì)胞周期的推進(jìn)主要受細(xì)胞周期蛋白(Cyclins)及其相關(guān)激酶(Cyclin dependent protein kinases, CDKs)的調(diào)控。細(xì)胞周期包括靜止期(G0期)、分裂間期(G1期、S期和G2期)和有絲分裂期(M期)[20]。研究發(fā)現(xiàn)，CyclinD1與CDK4或CDK6形成的復(fù)合物對(duì)于G1階段至關(guān)重要[21]，而G1階段是真核生物細(xì)胞分裂周期中的關(guān)鍵步驟。本試驗(yàn)中，GLP-2處理顯著升高了十二指腸上皮CyclinD1、CDK6的mRNA表達(dá)水平，空腸上皮CDK4及CDK6的mRNA表達(dá)水平和回腸上皮CyclinD1、CDK4的mRNA表達(dá)水平。這可能是由于注射GLP-2上調(diào)了小腸上皮CyclinD1、CDK4和CDK6的基因表達(dá)，使細(xì)胞周期G1期持續(xù)時(shí)間縮短，從而推進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖。CyclinA在S和G2/M階段扮演著重要角色[22]。在S期，CyclinA-CDK2復(fù)合物通過(guò)關(guān)鍵DNA復(fù)制因子的磷酸化驅(qū)動(dòng)染色體復(fù)制[23]。本研究中，GLP-2注射促使空腸上皮CyclinA和回腸上皮CyclinA、CDK2基因表達(dá)上調(diào)，這可能是GLP-2促進(jìn)了細(xì)胞周期過(guò)程中DNA復(fù)制。注射GLP-2使十二指腸上皮和空腸上皮CyclinB1和CDK1基因表達(dá)上調(diào)。據(jù)報(bào)道，哺乳動(dòng)物CyclinB1-CDK1復(fù)合物在G2后期發(fā)揮著重要作用[24]。CyclinE1-CDK2可以促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期[25]，但本試驗(yàn)中兩組小腸上皮的CyclinE1 mRNA的表達(dá)水平并沒(méi)有顯著差異。在一定程度上，小腸上皮細(xì)胞周期基因mRNA表達(dá)變化并不能完全反映細(xì)胞周期進(jìn)程變化。因此認(rèn)為，CyclinA、CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK4和CDK6是與腸道發(fā)育相關(guān)的重要基因。GLP-2可能通過(guò)上調(diào)這些基因的表達(dá)，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)小腸的發(fā)育。

GLP-2的生物活性不僅與分泌量有關(guān)，也與血液中活性GLP-2的比例有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，體外注射GLP-2，升高了血漿GLP-2濃度，這表明體外注射GLP-2可能誘導(dǎo)了羔羊自身GLP-2的分泌。此外，外源GLP-2注射可提高羔羊小腸上皮GCG、GLP-2R的mRNA表達(dá)量，表明外源注射的GLP-2可能通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)小腸，激活小腸GLP-2前體物質(zhì)(GCG)及其受體(GLP-2R)的表達(dá)。對(duì)小鼠的研究表明，GLP-2R主要在腸道的皮下肌成纖維細(xì)胞而非隱窩細(xì)胞表達(dá)[26]，這就暗示，GLP-2促進(jìn)腸道隱窩細(xì)胞增殖可能需要其他生長(zhǎng)因子的介導(dǎo)。之后一系列的研究結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了以上假說(shuō)。當(dāng)敲除小鼠的IGF-1R基因后，GLP-2促進(jìn)小腸隱窩細(xì)胞生長(zhǎng)的作用被完全消除[27]。皮下肌成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加GLP-2使得IGF-1的分泌量顯著增加[28]。以上結(jié)果證實(shí)，GLP-2刺激小腸隱窩細(xì)胞的增殖需要通過(guò)IGF-1介導(dǎo)[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，注射GLP-2使羔羊十二指腸上皮IGF-1R，空腸和回腸上皮IGF-1、IGF-1R的mRNA表達(dá)上調(diào)。這可能是當(dāng)GLP-2與GLP-2R結(jié)合后，促進(jìn)了羔羊小腸上皮IGF-1的表達(dá)和分泌，這和P.E.Dube等[27]的研究結(jié)果一致。J.Jasleen等[29]報(bào)道，在體外試驗(yàn)中，GLP-2處理腸上皮細(xì)胞系可以促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白A和D1的表達(dá)。E.E.Connor等[30]發(fā)現(xiàn)，牛的小腸中細(xì)胞周期蛋白D1和GLP-2R的表達(dá)呈正相關(guān)。許多研究證實(shí)，IGF-1能夠誘發(fā)CyclinD1表達(dá)的上調(diào)，之后與相應(yīng)的細(xì)胞周期依賴蛋白激酶CDK4和CDK6形成復(fù)合物而啟動(dòng)細(xì)胞增殖[31-32]。但是，IGF-1與IGF-1R結(jié)合后，必須通過(guò)相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，才能發(fā)揮其調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的功能。外源GLP-2注射導(dǎo)致羔羊小腸上皮IGF-1及IGF-1R表達(dá)上調(diào)，并且與小腸上皮細(xì)胞周期蛋白表達(dá)變化一致。這一結(jié)果暗示，GLP-2調(diào)節(jié)羔羊小腸上皮細(xì)胞周期的作用可能與IGF-1信號(hào)通路存在一定關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果將對(duì)深入認(rèn)識(shí)GLP-2調(diào)節(jié)羔羊小腸發(fā)育的分子機(jī)制具有重要意義。

4　結(jié)　論

皮下注射GLP-2對(duì)羔羊體重、胃腸道各器官重量和瘤胃內(nèi)環(huán)境都沒(méi)有顯著影響，但空腸重和回腸重有增加的趨勢(shì)，同時(shí)，升高了血漿中GLP-2濃度，促進(jìn)了小腸上皮發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，外源注射GLP-2可促進(jìn)羔羊的小腸發(fā)育。

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