荷斯坦奶牛乳腺干細(xì)胞的成神經(jīng)誘導(dǎo)鑒定及催乳素對其增殖活性的影響

劉迎春，陳鈺萌，韓哲先，高　峰，周歡敏

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018； 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)生物制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018)

動(dòng)物的乳腺是一種能夠反復(fù)經(jīng)歷發(fā)育、功能分化和退化的組織，早在胚胎期乳腺就己經(jīng)開始發(fā)育[1]。奶牛的乳腺發(fā)育經(jīng)過胚胎期、青春期前、青春期后、妊娠期、泌乳期及干乳期6個(gè)時(shí)期[2]，這一過程是奶牛泌乳性能發(fā)揮的決定性過程。然而在乳腺的生長發(fā)育過程中，乳腺干細(xì)胞(Mammary stem cells, MSCs)對于青春期、妊娠期、泌乳期和泌乳衰退期的乳腺生長與重建具有重大意義[3]。乳腺干細(xì)胞由多種類型的上皮細(xì)胞組成，生長發(fā)育于動(dòng)物的乳腺之中的一種處于靜止期的，未分化的細(xì)胞，其特點(diǎn)為自我增殖、自我更新和多向分化。其可以分化為所有類型的乳腺細(xì)胞[4]，特別是具有向不同胚層來源細(xì)胞跨越分化的能力，跨越分化的研究，更有助于揭示細(xì)胞分化的機(jī)制。同時(shí)，乳腺干細(xì)胞的增殖對乳腺的生長、分化和再生也有十分重要的作用，尤其是在動(dòng)物妊娠期、泌乳期和泌乳衰退周期中[5]，是研究器官形成、細(xì)胞分化研究的理想模型。近年來的研究顯示[6]，激素、生長因子、細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)組分是干細(xì)胞分化增殖所必須的。乳腺的泌乳功能同樣依賴激素的調(diào)控，尤其是催乳素(Prolactin，PRL)的調(diào)控作用[7]。催乳素是一種蛋白質(zhì)激素，由垂體前葉腺嗜酸細(xì)胞分泌，與其受體結(jié)合后，引發(fā)催乳素介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[8]，從而促進(jìn)乳腺發(fā)育，發(fā)動(dòng)并維持泌乳[9]。但是，催乳素如何促進(jìn)奶牛乳腺干細(xì)胞向乳腺細(xì)胞發(fā)育分化，完成乳腺生長與重建的機(jī)理仍不清楚。由于干細(xì)胞在體外經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)后具有跨胚層分化的能力[10]，所以體外誘導(dǎo)法也是鑒定干細(xì)胞的常用方法。因此，本研究在已分離純化的荷斯坦奶牛乳腺干細(xì)胞基礎(chǔ)上，利用體外誘導(dǎo)法來誘導(dǎo)乳腺干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞，旨在鑒定分離純化得到的荷斯坦奶牛乳腺干細(xì)胞具有跨胚層分化的能力，即多向分化潛能；并用催乳素刺激乳腺干細(xì)胞，以探討催乳素對其增殖的最適濃度，以期為催乳素調(diào)控乳腺干細(xì)胞在奶牛乳腺重建過程及泌乳性能的最大發(fā)揮提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

本實(shí)驗(yàn)室提供的已分離純化的P3代荷斯坦奶牛乳腺干細(xì)胞[11]。DMEM/F12(SH30023.01B)、胎牛血清(FBS，SV30087.01)、PBS(SH30256.01B)均購自 HyClone 公司；青霉素(00212226)、鏈霉素(03032507)均購自華北制藥公司；胰蛋白酶(T4799)、催乳素(268615-1G)均購自 Sigma 公司；Insulin-Transferrin-Selenium(907606)購自Gibco公司；β-巰基乙醇(MB0338)購自BBI公司。尼氏染色試劑盒(DK0021)購自北京雷根生物公司；MTT (T0793)、二甲基亞砜(DMSO，0231)均購自Amresco公司。

1.2　方法

1.2.1乳腺干細(xì)胞的復(fù)蘇自液氮中取出P3代乳腺干細(xì)胞，迅速放到37 ℃水浴鍋中，鑷子夾住凍存管震蕩，直至凍存液溶解后拿出。75%酒精擦凈管口后，迅速移進(jìn)超凈工作臺，吸出細(xì)胞凍存液，移到1.5 mL離心管，1 500 r·min-1離心5 min，棄除上清液，用干細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM/F12 +10%FBS +1%PS+EGF 20 ng·mL-1+ ITS 10 μL·mL-1)重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中，移入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2乳腺干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)待細(xì)胞長到70%～80%融合時(shí)，酶消化法傳代培養(yǎng)。棄掉培育細(xì)胞時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)液，加適量的有雙抗(青霉素+鏈霉素)的PBS溶液清洗2遍后，棄掉，向培養(yǎng)皿中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，待消化1～5 min，向培養(yǎng)皿中加入等體積培養(yǎng)液，停止消化。將上述細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入1.5 mL的離心管中，1 500 r·min-1離心5 min，棄除上清，干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)(細(xì)胞計(jì)數(shù)板法，細(xì)胞數(shù)/mL=4個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4×(104·mL-1)。

1.2.3乳腺干細(xì)胞成神經(jīng)誘導(dǎo) 取上述傳代的細(xì)胞接種于12孔板中；顯微鏡觀察待細(xì)胞貼壁生長為50%～60%融合的時(shí)候，隨機(jī)分為對照組和試驗(yàn)組，試驗(yàn)組加入神經(jīng)預(yù)誘導(dǎo)液(DMEM/F12 +10%FBS +1 mmol·L-1β-巰基乙醇)，對照組加入普通培養(yǎng)液(DMEM/F12 +10%FBS +1%PS)，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)24 h。24 h后，取適量PBS，清洗1遍，試驗(yàn)組加入神經(jīng)誘導(dǎo)液(DMEM/F12 +10%FBS +3 mmol·L-1β-巰基乙醇)，對照組不變，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液1次，每天注意在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞生長形態(tài)的變化，并使用尼氏染色，試劑盒染色，鑒定神經(jīng)細(xì)胞。

1.2.4乳腺干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞特異表達(dá)基因鑒定神經(jīng)微管蛋白Ⅲ(β-TubulinⅢ)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)為神經(jīng)細(xì)胞的特異表達(dá)基因，利用Priemer 5.0軟件設(shè)計(jì)合成引物，并由生工生物工程(上海)有限公司合成(表1)。首先用RNAiso Plus裂解已誘導(dǎo)的乳腺干細(xì)胞，然后提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過PCR體系和1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

表1神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記基因引物序列

Table1Theprimerssequenceofmarkergeneinneuralcell

基因Gene引物序列(5'-3')Primersequence產(chǎn)物長度/bpLengthGenBank序列號GenBankNo.退火溫度/℃Annealingtemperatureβ-TubulinIIIF:ACACGGACGAGACCTACTGCR:CGAACATCTGCTGGGTGAG300MM_001077127.160NSEF:GGCAATGAACGAGATGGTCTR:GTGGCTCTCAATCGCTCTTC309XM_005215370.360

1.2.5乳腺干細(xì)胞活力的檢測按照2×103·孔-1的密度將細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待干細(xì)胞生長貼壁后，隨機(jī)的分為對照組和催乳素處理組。設(shè)定催乳素0(對照組)、100、300、500、700 ng·mL-15個(gè)濃度梯度進(jìn)行處理，每個(gè)濃度設(shè)定8個(gè)復(fù)孔，每個(gè)培養(yǎng)孔為1 個(gè)重復(fù)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h；在培養(yǎng)結(jié)束前4 h，各培養(yǎng)孔加入 MTT(5 mg·mL-1) 20 μL; 4 h后，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO) 200 μL以溶解沉淀，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm 波長處檢測各孔的吸光度值(OD)。

細(xì)胞相對增殖率(Relative growth rate，RGR)=(試驗(yàn)組 OD490 nm/對照組 OD490 nm)×100%。

1.2.6數(shù)據(jù)分析采用SAS 9.4一般線性模型進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為差異顯著。

2　結(jié)　果

2.1　乳腺干細(xì)胞的傳代與復(fù)蘇

將解凍后的乳腺干細(xì)胞培養(yǎng)2 d，顯微鏡下，觀察細(xì)胞貼壁后，有明顯鋪路石狀生長的細(xì)胞即為乳腺干細(xì)胞；高倍鏡下發(fā)現(xiàn)乳腺干細(xì)胞的細(xì)胞核較大，呈多核狀態(tài)，占細(xì)胞大部分位置，即核質(zhì)比大，可見細(xì)胞有明顯的幼稚細(xì)胞的狀態(tài)(圖1)。

A.100×;B. 400×圖1　乳腺干細(xì)胞的傳代與復(fù)蘇(2 d)Fig.1　Passage and recovery of mammary stem cells (2 d)

2.2　乳腺干細(xì)胞成神經(jīng)誘導(dǎo)

乳腺干細(xì)胞中加入神經(jīng)預(yù)誘導(dǎo)液，放入CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h，有大部分乳腺干細(xì)胞都漂浮在培養(yǎng)基中，并且死亡，部分細(xì)胞開始慢慢變圓，也有堆積成細(xì)胞簇的現(xiàn)象，細(xì)胞兩極伸出細(xì)長突起，狀似雙極神經(jīng)元細(xì)胞，尼氏染色呈陽性(圖2A)，對照組細(xì)胞尼氏染色，可以從倒置顯微鏡中觀察到乳腺干細(xì)胞中有少許尼氏顆粒的存在，但沒有看到細(xì)胞明顯的分化成桿狀，樹突狀類型的神經(jīng)細(xì)胞(圖2A′)；更換正式神經(jīng)誘導(dǎo)液，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，可以明顯的觀察到有桿狀，樹突狀的神經(jīng)細(xì)胞，經(jīng)尼氏染色呈陽性(圖2B)，對照組尼氏染色后有少許尼氏顆粒的存在，仍沒有看到細(xì)胞明顯的分化(圖2B′)；神經(jīng)細(xì)胞繼續(xù)誘導(dǎo)24 h，有更多的細(xì)胞旁邊延伸出突起，細(xì)胞周圍出現(xiàn)微管樣結(jié)構(gòu)有所增加，經(jīng)尼氏染色呈陽性(圖2C)，對照組尼氏染色后仍只有少許尼氏顆粒的存在，細(xì)胞未分化成桿狀，樹突狀類型的神經(jīng)細(xì)胞(圖C′)。

A.誘導(dǎo)24 h；A′.未誘導(dǎo)24 h；B.誘導(dǎo)48 h；B′.未誘導(dǎo)48 h；C.誘導(dǎo)72 h；C′.未誘導(dǎo)72 h A. MSCs were induced 24 h; A′. MSCs were not induced 24 h; B. MSCs were induced 48 h；B′. MSCs were not induced 48 h; C. MSCs were induced 72 h；C′. MSCs were not induced 72 h圖2　乳腺干細(xì)胞成神經(jīng)誘導(dǎo)(100×)Fig.2　Mammary stem cells(MSCs)were induced into neurocyte(100×)

2.3　乳腺干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記基因鑒定

RT-PCR法檢測神經(jīng)細(xì)胞特異表達(dá)基因β-TubulinⅢ和NSE都呈現(xiàn)陽性結(jié)果，利用特異性引物擴(kuò)增目的基因片段，電泳顯示條帶清晰且單一，無非特異擴(kuò)增，圖3結(jié)果表明,β-TubulinⅢ的片段大小約為300 bp，NSE的片段大小約為309 bp，與設(shè)計(jì)的片段大小符合。

圖3　乳腺干細(xì)胞成神經(jīng)誘導(dǎo)(基因檢測)Fig.3　Mammary stem cells were induced into neurocyte (Gene detection)

2.4　催乳素對乳腺干細(xì)胞增殖的影響

不同濃度催乳素對乳腺干細(xì)胞相對增殖率(RGR)的影響見表2。催乳素處理組(除700 ng·mL-1組外)RGR顯著高于對照組(P<0.05)，100 ng·mL-1處理組顯著高于其他各組(P<0.05)。結(jié)果表明，與對照組相比較，催乳素組可顯著促進(jìn)乳腺干細(xì)胞的增殖，其中100 ng·mL-1組的增殖活性最高。

3　討　論

乳腺干細(xì)胞是一種成體干細(xì)胞，具有多向分化潛能及自我更新能力[12]。研究發(fā)現(xiàn)，處于不同發(fā)育時(shí)期的動(dòng)物乳腺中都存在一定比例的干細(xì)胞，正是這些干細(xì)胞對組織自穩(wěn)態(tài)的維持和乳腺的生長與重建有很重要的作用[13]，但是目前人們對乳腺干細(xì)胞的了解并不多。在乳腺干細(xì)胞存在于一部分基底細(xì)胞的前期認(rèn)識基礎(chǔ)上[14]，前人曾經(jīng)嘗試回答乳腺干細(xì)胞的分化潛能問題。筆者將荷斯坦奶牛的乳腺干細(xì)胞在體外分離和培養(yǎng)并研究[15]，檢測其多向分化潛能，這就是鑒定干細(xì)胞的一個(gè)重要的判斷標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)加入神經(jīng)誘導(dǎo)液后，乳腺干細(xì)胞由緊密排列的鋪路石狀變?yōu)殚L梭型，且生長均一。隨著誘導(dǎo)時(shí)間不斷增長，能夠發(fā)現(xiàn)有類神經(jīng)元細(xì)胞，經(jīng)過尼氏染色后呈陽性。經(jīng)過誘導(dǎo)后的乳腺干細(xì)胞可以表達(dá)一些神經(jīng)元細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異標(biāo)志物[16]：NSE和β-tubulinⅢ。RT-PCR技術(shù)鑒定基因的表達(dá)量，結(jié)果呈陽性表達(dá)。由此表明，在本研究條件下培養(yǎng)細(xì)胞，乳腺干細(xì)胞可表達(dá)其多向分化潛能，可以向多數(shù)不同的細(xì)胞組織定向分化。

表2不同濃度催乳素對奶牛乳腺干細(xì)胞相對增殖率的影響

Table2EffectofdifferentconcentrationsofprolactinonRGRofmammarystemcell

項(xiàng)目Item催乳素/(ng·mL-1)Prolactin0100300500700SEMP值PvalueRGR1.00±0.04c1.38±0.03a1.25±0.02b1.19±0.06b1.12±0.02bc0.05580.0546

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同或無小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)

Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)

乳腺的發(fā)育及泌乳都需要激素的調(diào)控。催乳素在促進(jìn)哺乳動(dòng)物的乳腺發(fā)育和維持泌乳等方面發(fā)揮重大作用[17-18]。催乳素對奶牛乳腺的發(fā)育及泌乳的研究已經(jīng)取得了一些成果。E.H.Wall等[19]研究表明，給奶牛外源注射少量的催乳素，產(chǎn)奶量增加；P.Lacasse等[20]研究發(fā)現(xiàn)，無論單胃動(dòng)物還是反芻動(dòng)物，催乳素都可以促進(jìn)其乳腺的發(fā)育和泌乳[21]。催乳素不僅可以通過激素系統(tǒng)間接地調(diào)節(jié)乳腺的發(fā)育，也可以通過與乳腺上皮細(xì)胞的催乳素受體結(jié)合直接調(diào)節(jié)乳腺的發(fā)育[22]。田青等[23-24]研究表明，胰島素、催乳素和氫化可的松能促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖。邢媛媛等[25]研究結(jié)果表明，低濃度催乳素能夠促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的增殖，而高濃度(1 000 ng·mL-1)催乳素對乳腺上皮細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制效應(yīng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同濃度的催乳素對乳脂和乳蛋白的合成調(diào)控有一定的關(guān)系，即低濃度時(shí)催乳素促進(jìn)合成。100～300 ng·mL-1的濃度作用效果最好，而高濃度(1 000 ng·mL-1) 的催乳素對奶牛乳腺的乳脂和乳蛋白的合成產(chǎn)生一定的抑制作用。因?yàn)槿橄俑杉?xì)胞對于青春期、妊娠期、泌乳期和泌乳衰退期的乳腺生長與重建等都具有重要意義，筆者認(rèn)為催乳素也會(huì)對乳腺干細(xì)胞的增殖產(chǎn)生一定的作用。將催乳素作用于乳腺干細(xì)胞，并利用 MTT 法檢測其對乳腺干細(xì)胞增殖活性的影響，旨在初步探討催乳素對于乳腺干細(xì)胞的作用意義。結(jié)果表明，催乳素能夠促進(jìn)乳腺干細(xì)胞的增殖。另外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在選取不同濃度的催乳素刺激乳腺干細(xì)胞的情況下，100 ng·mL-1催乳素處理組乳腺干細(xì)胞增殖活性顯著高于0、300、500、700 ng·mL-1刺激組，說明低濃度時(shí)乳腺干細(xì)胞的活力較好，即且100 ng·mL-1為荷斯坦奶牛乳腺干細(xì)胞增殖的最適濃度。由此證明了催乳素可以促進(jìn)乳腺干細(xì)胞增殖，為促進(jìn)乳腺干細(xì)胞在體外繼續(xù)增殖，并分化為正常的乳腺細(xì)胞提供理論支持，這對于乳腺干細(xì)胞的臨床應(yīng)用有重要意義。

本研究條件下可證明體外分離和培養(yǎng)的荷斯坦奶牛的乳腺干細(xì)胞具有多向分化潛能，且催乳素刺激后，增殖活性顯著增強(qiáng)，為進(jìn)一步研究乳腺干細(xì)胞在體內(nèi)外的分化和擴(kuò)增提供基本的理論依據(jù)。以期為催乳素調(diào)控乳腺干細(xì)胞在奶牛乳腺重建過程及泌乳性能的最大發(fā)揮提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

4　結(jié)　論

在本研究條件下，體外分離培養(yǎng)的荷斯坦奶牛乳腺干細(xì)胞經(jīng)特定誘導(dǎo)可以定向分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，具有分化神經(jīng)細(xì)胞的能力，說明乳腺干細(xì)胞的多向分化潛能。催乳素可促進(jìn)乳腺干細(xì)胞增殖，且100 ng·mL-1為增殖的最適濃度。

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