豬繁殖與呼吸綜合征病毒類NADC30株CHsx1401感染性克隆的構(gòu)建

卞　婷，周　磊，宋江偉，蓋新娜，郭　鑫，韓　軍，楊漢春

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動物流行病學(xué)重點實驗室，北京 100193)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是影響全球養(yǎng)豬業(yè)的一種重要病原[1-2]。PRRSV為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，歸類于套式病毒目、動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬[3]。國際病毒分類委員會(ICTV)最新的分類顯示，動脈炎病毒科有5個屬，PRRSV歸類于豬動脈炎病毒屬(Porartevirus)(https://talk.ictvonline.org/ictv-reports/ictv_online_report/)。PRRSV基因組全長約15 kb[4-5]，至少包含有12個開放閱讀框(opening reading frames, ORFs)[6-7]。基于基因組序列及抗原特性的差異，PRRSV被分為兩大基因型，即歐洲型(基因1型)和北美洲型(基因2型)[8-10]，兩大基因型毒株間核苷酸相似性僅為60%左右[11-12]。迄今為止，PRRSV感染及其造成的疫情仍未得到很好的控制，仍然在許多國家流行，尤其是變異或新毒株的出現(xiàn)經(jīng)常導(dǎo)致疫病的暴發(fā)和再流行[13-16]。

自20世紀90年代中期PRRSV在我國被確認以來，已成為嚴重影響我國養(yǎng)豬業(yè)的主要病原之一[17]，尤其是2006年出現(xiàn)的高致病性PRRSV(HP-PRRSV)的廣泛流行給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[15, 17]。近年來，基因2型PRRSV的類NADC30毒株在我國出現(xiàn)[18-19]，并造成許多地區(qū)豬場PRRS疫情的暴發(fā)[19-21]。該類毒株的非結(jié)構(gòu)蛋白2(Nsp2)編碼區(qū)存在與2008年美國分離株NADC30相同的缺失模式[22]，并且已有文獻報道該類毒株與國內(nèi)高致病性毒株存在基因重組現(xiàn)象[23]。作為影響中國養(yǎng)豬業(yè)的一類新的PRRSV毒株，研究其致病機制為臨床疫情的控制提供依據(jù)顯得尤為重要，而反向遺傳操作技術(shù)是研究PRRSV變異與演化及分子致病機制的一個重要工具。因此，本研究旨在構(gòu)建本實驗室于2014年分離獲得的類NADC30毒株CHsx1401的感染性克隆，以期為深入研究該類毒株的變異與演化以及與其他毒株致病性差異的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1病毒和細胞PRRSV 培養(yǎng)所需傳代細胞 MARC-145，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動物流行病學(xué)重點實驗室保存。原代豬肺泡巨噬細胞(pulmonary alveolar macrophages，PAMs)從4周齡SPF仔豬肺泡灌洗液中獲得，保存于液氮中備用。類NADC30毒株CHsx1401，分離于我國山西省某暴發(fā) PRRS 的豬場[19]，其全序組序列已測定并被GenBank(KP861625)收錄。

1.1.2載體和菌株pJET1.2克隆載體試劑盒購于Fisher Scientific公司(Waltham, MA, USA)。改造后的 pWSK-29 低拷貝質(zhì)粒，用于全長感染性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動物流行病學(xué)重點實驗室保存。大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli) Trans10、DMT 感受態(tài)購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.3主要試劑KOD 高保真 PCR 擴增酶購于東洋紡上海生物科技有限公司；GIBCOTMOpti-MEM?I Reduced Serum Medium、GIBCOTMRPM/MINI 1640與GIBCOTMDMEM以及 Lipofectamine LTX and plus reagents均購自Fisher Scientific公司；DNA/RNA 提取試劑盒、dNTPs、TIANamp DNA/RNA kit、Fast Site-Directed Mutagenesis Kit 點突變試劑盒及 Trans15K Marker均購于全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒 Wizard?Plus Midipreps DNA Purification System、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和 T4 DNA 連接酶均購于 Promega公司(Madison, WI, USA)；DNA 瓊脂糖膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司；所有限制性內(nèi)切酶均購于NEB公司(北京，中國)。PRRSV N蛋白單克隆抗體由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動物流行病學(xué)重點實驗室制備并保存。異硫氰酸熒光素(FITC)-羊抗小鼠 IgG購自中杉金橋生物有限公司(北京，中國)。

1.2　方法

1.2.1PRRSV CHsx1401基因組片段cDNA的擴增基于PRRSV CHsx1401的全基因組序列，將其基因組分為四個片段(A、B、C、D)，分別設(shè)計RT-PCR擴增引物(表1)。取200 μL PRRSV CHsx1401 F8代病毒液，用DNA/RNA 提取試劑盒提取病毒RNA，將提取的病毒基因組RNA分別用設(shè)計的擴增各片段的下游引物AR、BR、CR、DR進行反轉(zhuǎn)錄，然后進行PCR擴增。

表1擴增PRRSV基因組cDNA片段和回復(fù)突變所用引物

Table1PrimersusedforamplificationofcDNAfragmentsofPRRSVgenomeandreversemutations

引物aPrimer位置bPosition序列(5'-3')cSequence長度/ntLengthAF1-24GGCGCATTTAAATACCGTCTATGACGTATAGGTGTTGGCTCTA(SwaⅠ)3156AR3126-3156GCGGCGCACCGGTGTGTGGGGCATCATCACAAACCCG(SgrAⅠ)BF3149-3175GGCGCATTTAAATAGCCACCGGTGCTCTCTGTAGGTGCGGAGA(SwaⅠ,SgrAⅠ)4164BR7288-7312CGGCTAGCAGTTTAAACACTGCTCCTT(NheⅠ)CF7307-7330CTAGCTAGCCGCCAGCGGCTTGACCCG(NheⅠ)4283CR11562-11589TTTCTGGCGCGCCCGAAACGCTTCATTGTAATC(AscⅠ)DF11582-11612TTTCGGGCGCGCCAGAAAGGGAAGATTTATAGAGCC(AscⅠ)3498DR14990-15021GCGCGCCTTAATTAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-TTTTTTTTTTTTAATTTCGGCCGCATGGTTCTCGCCAATTAAAT(PacⅠ)A-Mu-F2819-2848GCTGCTCTTTGTCGAGCGTAGAGATCACAC6130A-Mu-R2809-2838TACGCTCGACAAAGAGCAGCTTGATGACACB-Mu-F3714-3743TGTTGGTTTGTTCAAGCCTGTATCCGACCC7138B-Mu-R3704-3733CAGGCTTGAACAAACCAACAGCAAAAGCCAC-Mu-F8555-8584TTGTGCTGAGGATCACCTACCGTCGTATGT7257C-Mu-R8545-8574GTAGGTGATCCTCAGCACAAGCAAGCTCATD-Mu-F12076-12104AGCGAGGCCACGCTGTCTCGCATTAGTAG6472D-Mu-R12065-12094GAGACAGCGTGGCCTCGCTCACCACCTGTT

a. F表示上游引物，R表示反轉(zhuǎn)錄引物或下游引物，Mu表示回復(fù)突變所用引物；b. 數(shù)字表示在CHsx1401(KP861625)基因組中的位置；c. 括號中加下劃線部分表示由PCR引入的限制性內(nèi)切酶，加粗字母表示回復(fù)突變的核苷酸

a. F represents a forward PCR primer, R represents reverse transcription or a reverse PCR primer, Mu represents the primers used for reverse mutations;b. Numbers refer to the nucleotide position within the genome of CHsx1401 (GenBank accession No. KP861625);c.Restriction enzyme sites introduced by PCR are underlined and indicated in parenthesis. The letters in boldface show the reverse mutated nucleotides

1.2.2全長cDNA克隆構(gòu)建策略參照先前PRRSV感染性克隆構(gòu)建的策略和方法[24]，構(gòu)建CHsx1401毒株的全長cDNA克隆。在低拷貝質(zhì)粒pWSK-29中插入CMV啟動子和丁型肝炎病毒核酶，將CHsx1401全長分為四個片段，在A片段5′端加入SwaⅠ酶切位點，在A片段的3′端及B片段的5′端加入SwaⅠ和SgrAⅠ兩個酶切位點，同時在D片段 3′末端加入Ploy(A)和PacⅠ酶切位點(表1)。利用PCR方法將CHsx1401基因組11582位處T同義突變?yōu)镚引入一個全長單一酶切位點AscⅠ,該酶切位點既可以用于連接C和D片段，又可以作為拯救病毒的遺傳標記(圖1)。RT-PCR擴增各片段后分別連接至pJET1.2載體，構(gòu)建中間質(zhì)粒，測序無誤后通過各片段兩端的酶切位點將片段切下后按 DCBA 的順序依次連接到 pWSK-29，構(gòu)建全長cDNA質(zhì)粒。

圖1　pWSK-CHsx1401構(gòu)建策略Fig.1　Construction strategy of pWSK-CHsx1401

1.2.3中間質(zhì)粒的構(gòu)建PRRSV CHsx1401基因組中擴增片段產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定后回收目的條帶，將回收產(chǎn)物連接至pJET1.2載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans10感受態(tài)，37 ℃過夜培養(yǎng)后挑選菌落進行PCR鑒定，將菌落PCR鑒定為陽性的克隆，送公司測序。如果存在突變點，則使用Fast Site-Directed Mutagenesis Kit 點突變試劑盒進行回復(fù)突變。

1.2.4全長cDNA克隆質(zhì)粒的構(gòu)建及測序鑒定用兩端的PacⅠ和AscⅠ將連接于pJET1.2載體上的D片段切下，再經(jīng)T4連接酶連于pWSK29載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans10感受態(tài)細胞，用D片段引物 DF 和 DR 鑒定選取陽性克隆接種含有200 mL LB/Amp+培養(yǎng)基，28 ℃ 150 r·min-1搖振培養(yǎng)20 h后，提取質(zhì)粒。C片段的酶切以及連接方法與D片段方法相同。由于B片段插入的兩個限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)條件不同，需分別進行單酶切后再連接到已構(gòu)建好的pWSK29-SDC載體中。A片段與B片段相似，同樣需分別進行單酶切后再連入已構(gòu)建好的pWSK29-SDCB載體中，最后對構(gòu)建好的陽性克隆進行全基因組測序以確保序列的準確性。

1.2.5病毒拯救及鑒定將生長旺盛的MARC-145細胞經(jīng)胰酶消化，以約 106·mL-1的細胞濃度培養(yǎng)于6孔細胞培養(yǎng)板，每孔2 mL。置于含有 5% CO2細胞培養(yǎng)箱，37 ℃條件下培養(yǎng)，當細胞長滿至70%～80%時進行轉(zhuǎn)染。用LTX脂質(zhì)體將全長cDNA克隆轉(zhuǎn)染至MARC-145細胞，96 h后收取全部細胞培養(yǎng)液置于-80 ℃，反復(fù)凍融2次后在MARC-145細胞連續(xù)傳代2次。用間接免疫熒光和RT-PCR及序列測定對P3代拯救病毒進行鑒定。

1.2.6體外增殖動態(tài)按常規(guī)方法，將親本病毒與拯救病毒按MOI為0.01分別接種MARC-145細胞和PAMs，分別于感染后12、24、36、48、60、72、84 h收取細胞培養(yǎng)液，測定病毒TCID50。

2　結(jié)　果

2.1　PRRSV NADC30-like毒株CHsx1401基因組片段的擴增及中間質(zhì)粒的構(gòu)建

用表1中設(shè)計的擴增 CHsx1401 全基因組的四個片段相應(yīng)引物，將病毒基因組RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用高保真酶進行 PCR 擴增，依次獲得病毒基因組的A、B、C 和D 四個擴增片段，與預(yù)期大小(分別為3 156、4 164、4 283和3 498 bp)相符(圖2)。在A片段5′端加入SwaⅠ酶切位點，在A片段的3′端及B片段的5′端加入SwaⅠ和SgrAⅠ兩個酶切位點，同時在D片段3′末端加入Ploy(A)和PacⅠ酶切位點。在C 片段3′端使用 PCR 進行同義突變引入一個單一酶切位點AscⅠ，用于C、D 片段的連接和區(qū)分親本病毒與拯救病毒的遺傳標記。A、B、C、D 四個片段的 PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳切取相應(yīng)大小的片段，膠回收后連接到平末端克隆載體pJET1.2，分別構(gòu)建出中間質(zhì)粒pJET-A、pJET-B、pJET-C和pJET-D。對各中間質(zhì)粒進行測序鑒定發(fā)現(xiàn)各片段均有由PCR擴增非特異性引入的1個突變點，分別為nt2838位的A突變?yōu)镚，nt3733位的G突變?yōu)锳，nt8574位C突變?yōu)門和nt12094位C突變?yōu)門。利用表1中設(shè)計的引物以及點突變試劑盒，對突變位點進行回復(fù)突變。

圖2　NADC30-like CHsx1401全基因組片段RT-PCR擴增Fig.2　Amplification of four fragments of NADC30-like CHsx1401 genome by RT-PCR

2.2　CHsx1401全長cDNA克隆的構(gòu)建

將改造后的低拷貝質(zhì)粒pWSK29和pJET-D分別進行AscⅠ/PacⅠ雙酶切，回收相應(yīng)片段進行連接，轉(zhuǎn)化Trans10感受態(tài)細胞。37 ℃ 過夜培養(yǎng)后，用D片段擴增引物 DF/DR對菌落進行 PCR 鑒定，選取陽性菌落進行擴大培養(yǎng)和質(zhì)粒提取，質(zhì)粒命名為pWSK-SD。將 pWSK-SD和pJET-C分別進行NheⅠ/AscⅠ雙酶切，回收相應(yīng)片段，轉(zhuǎn)化后用PCR篩選陽性克隆，再經(jīng)擴大培養(yǎng)和質(zhì)粒提取，獲得質(zhì)粒pWSK-SDC。用相同方法依次連接B片段和A片段，最終構(gòu)建出CHsx1401 的全長cDNA克隆質(zhì)粒 pWSK-SDCBA，全長質(zhì)粒經(jīng)序列測定驗證正確后，命名為 pWSK-CHsx1401。

2.3　病毒拯救及鑒定

將全長cDNA克隆質(zhì)粒pWSK-CHsx1401轉(zhuǎn)染MARC-145 細胞，并傳代。結(jié)果表明，第二代即可觀察到典型的 PRRSV 細胞病變(CPE)，拯救病毒命名為RvCHsx1401。將拯救病毒 P3 代接種96孔培養(yǎng)板的 MARC-145 細胞，培養(yǎng)48 h 后用預(yù)冷的無水乙醇固定，用 PRRSV N蛋白單克隆抗體進行免疫熒光染色。結(jié)果表明，拯救病毒感染細胞呈現(xiàn)特異性熒光染色(圖3)。將 P3 代拯救病毒培養(yǎng)上清進行 RT-PCR及測序鑒定，確證了遺傳標記的存在。

圖3　拯救病毒的免疫熒光鑒定Fig.3　Identification of the rescued virus by indirect immunofluorescence assay

2.4　拯救病毒全基因組序列測定

對P3代拯救病毒的全基因組序列進行測定。結(jié)果表明，拯救病毒RvCHsx1401的基因組序列無堿基突變，與親本病毒序列相似性為100%。

2.5　拯救病毒傳代穩(wěn)定性鑒定

將拯救病毒在MARC-145細胞上連續(xù)傳10代，對3、5、7、9和10代病毒的滴度進行了測定。結(jié)果表明，拯救病毒均可在MARC-145細胞上穩(wěn)定傳代，毒價介于105～107.5TCID50·mL-1。同時對各代病毒的遺傳標記區(qū)域進行測序分析，顯示遺傳標記穩(wěn)定存在，未發(fā)生突變。

2.6　拯救病毒體外增殖特性

在MARC-145及原代PAMs上的生長曲線顯示(圖4)，拯救病毒RvCHsx1401的增殖動態(tài)與親本病毒CHsx1401相似，僅在MARC-145細胞上各時相的病毒滴度略低于親本病毒，但無顯著性差異。

3　討　論

反向遺傳操作技術(shù)即感染性克隆技術(shù)，是研究RNA病毒基因組結(jié)構(gòu)與基因功能以及致病機制必不可少的技術(shù)平臺。PRRSV作為一種影響全球養(yǎng)豬業(yè)的重要RNA病原，其感染性克隆技術(shù)已廣泛應(yīng)用于其基因功能、復(fù)制及分子致病機制等多個領(lǐng)域的研究[24-26]。

圖4　拯救病毒在MARC-145細胞(A)和原代PAM(B)上的生長曲線Fig.4　Growth curves of the rescued virus RvCHsx1401 in MARC-145 cells (A) and in primary PAMs (B)

PRRSV嚴重危害我國養(yǎng)豬生產(chǎn)，其變異與演化快速，毒株多樣性不斷攀升，新毒株以及重組毒株出現(xiàn)的頻率持續(xù)增高[27]。近幾年，屬于基因2型譜系1的類 NADC30 毒株在我國廣泛流行，成為我國的優(yōu)勢流行毒株之一。最新的流行病學(xué)調(diào)查顯示，無論豬場免疫何種減毒活疫苗，一旦受到該毒株感染，豬群均會發(fā)病[28]。已有研究表明，類NADC30毒株CHsx1401對仔豬具有中等毒力，感染仔豬呈現(xiàn)體溫升高、呼吸道癥狀和肺組織病變，且目前使用的豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗免疫均不能有效抵抗該毒株的感染[29]。此外，該毒株與我國其他毒株以及疫苗病毒頻繁重組[30]，加劇了PRRSV的防控難度。顯而易見，類NADC30毒株的致病性不同于我國基因2型譜系8的高致病性毒株，且差別很大。因此，研究該類毒株的致病機制以及與我國毒株致病性差異的分子機制十分必要，同時分析其與我國毒株的重組特性與分子機制對于我國養(yǎng)豬生產(chǎn)中PRRSV感染的控制有重要的意義。

本研究成功構(gòu)建出類NADC30代表性毒株CHsx1401的感染性cDNA克隆，且拯救出與親本毒體外增殖動態(tài)基本一致、傳代穩(wěn)定的克隆病毒。我們將進一步利用類NADC30毒株的感染性cDNA克隆，與我國高致病性毒株進行基因片段的置換，構(gòu)建嵌合病毒，進而分析相關(guān)基因在不同毒株間致病性差異方面的作用和生物學(xué)意義。

4　結(jié)　論

成功構(gòu)建出PRRSV類NADC30毒株CHsx1401的感染性克隆，拯救病毒的體外增殖特性與親本病毒基本一致，為進一步研究該毒株的變異與演化以及致病的分子機制奠定基礎(chǔ)。

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