川藏地區(qū)牦牛牛病毒性腹瀉病毒分子流行病學(xué)調(diào)查及分離鑒定

陳新諾，肖　敏,3，阮文強(qiáng)，覃思楠，岳　華,2，湯　承,2，張　斌，2*

(1. 西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；2. 國(guó)家民族事務(wù)委員會(huì)青藏高原動(dòng)物疫病防控創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，成都 610041；3. 四川省龍日種畜場(chǎng)，紅原 624400)

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)屬單股正鏈RNA病毒，與豬瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)和邊界病病毒(border disease virus, BDV)同屬黃病毒科(Flaviviridae)、瘟病毒屬(Pestivirus)[1-2]。BVDV作為其中重要的病毒之一，在國(guó)內(nèi)外廣泛存在，且宿主廣泛，包括牛、羊、山羊、豬、牦牛、鹿和駱駝等[3-4]。 BVDV進(jìn)入宿主機(jī)體后可造成持續(xù)性感染與免疫抑制，持續(xù)感染動(dòng)物的血清抗體為陰性，但卻終身帶毒并排毒，因此對(duì)養(yǎng)牛業(yè)及其他動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)均造成了巨大的危害[5-6]。BVDV最重要特征是其遺傳的多樣性[7-8]，基于細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE)，可將BVDV分為兩組生物型，致細(xì)胞病變型(cytopathic biotype, cp)和非致細(xì)胞病變型(noncytopathic biotype，ncp)。在BVDV基因組中，E2基因是瘟病毒的重要保護(hù)性抗原編碼的基因，在瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因中變異較大，代表著毒株的遺傳特性，而5′-UTR和Npro基因均是瘟病毒最保守的基因，因此5′-UTR、Npro和E2常用于瘟病毒及BVDV的遺傳多樣性分析。根據(jù)5′-UTR將BVDV分為兩個(gè)不同的遺傳物種，即BVDV-1型和BVDV-2型[9-10]。BVDV-1型可進(jìn)一步分為1a～1u亞型，BVDV-2型可進(jìn)一步分為2a～2d亞型[10-13]。近年來(lái)，四川、西藏等地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查顯示，BVDV流行范圍廣泛[14-15]，新型亞型的鑒定明顯增加，BVDV基因組的遺傳多樣性發(fā)生了顯著變化[10,16]。然而，牦牛BVDV毒株的分離鑒定及針對(duì)牦牛BVDV系統(tǒng)的遺傳進(jìn)化研究尚屬空白。因此在本研究中，我們系統(tǒng)調(diào)查了2016年川藏部分地區(qū)腹瀉牦牛糞便BVDV的發(fā)病率和主要亞型，并分離培養(yǎng)出牦牛兩株BVDV-1a和1d亞型毒株。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

1.1.1樣本及細(xì)胞系從四川和西藏地區(qū)共收集30至60日齡的腹瀉牦牛的糞便樣本，共計(jì)149份。取材地點(diǎn)情況：西藏自治區(qū)，N27°38′31.34″, E89°02′27.94″，海拔4 284 m；四川省，N31°32′31.03″，E101°40′07.82″，海拔 3 605 m。本研究所用的細(xì)胞MDBK(Madin-Darby bovine kidney)由本實(shí)驗(yàn)室保存，BVDV標(biāo)準(zhǔn)毒株 OregonC24V 購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.1.2主要試劑與儀器QuickTaqHS DyeMix購(gòu)自TOYOBO東洋紡生物科技有限公司；MarkerⅡ、PrimeScriptTMRT試劑盒均購(gòu)自大連寶生物公司；Tirzol試劑盒(RNAiso Plus)購(gòu)于上海英駿生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司，異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的兔抗羊IgG購(gòu)自美國(guó)Abbkine公司，含DAPI的Fluoroshield固定劑購(gòu)自美國(guó)Abbkine公司。BVDV多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)VMRD公司。高速離心機(jī)5804購(gòu)自Eppendor公司;普通PCR儀、核酸蛋白電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)VersaDoc2000為Bio-Rad公司產(chǎn)品。OLMPS IX71型熒光顯微鏡購(gòu)自TOKYO公司。

1.1.3引物參照文獻(xiàn)[10，17]中引物序列，合成BVDV的特異性引物BVDV-P1～BVDV-P6用于擴(kuò)增5′-UTR、Npro來(lái)進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查及分子分型。根據(jù)GenBank上已發(fā)表的BVDVE2基因序列，應(yīng)用Primer Premier 6軟件設(shè)計(jì)特異性引物BVDV-P7和BVDV-P8(BVDV-P7：AAYGTGCCACRAHACWGC；BVDV-P8：TRCCCATCATSACYAYTTCYC)對(duì)E2基因進(jìn)行擴(kuò)增和序列分析。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2　方法

1.2.1總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄將糞便樣品按1∶5加入滅菌生理鹽水研磨，經(jīng)反復(fù)凍融后，取上清液加入青霉素/鏈霉素(0.1 mg·mL-1)混勻，以3 000 r·min-1離心20 min，取上清液。參照上海英駿生物科技有限公司Trizol試劑盒(RNAisoPlus)說(shuō)明書，提取牦牛BVDV總RNA。取處理后的樣本懸液500 μL加入 700 μL的Trizol，室溫靜置10 min；加入200 μL氯仿，強(qiáng)烈振蕩15 s室溫靜止5 min；4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min，取上清液；加入等體積的異丙醇充分顛倒混勻，室溫靜置10 min；4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min，棄上清液，加入1 mL 75%(經(jīng)DEPC處理過(guò)的滅菌水配制)乙醇；4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，用 15 μL經(jīng)DEPC處理過(guò)的無(wú)菌水溶解沉淀，-70 ℃保存?zhèn)溆?。利用PrimeScriptTMRT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并置于-20 ℃待用。

1.2.2BVDV的RT-PCR擴(kuò)增與檢測(cè)以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：QuickTaqHS DyeMix 5 μL，上下游引物均為10 pmol·L-1各0.5 μL，cDNA模板1 μL，加ddH2O 3 μL；PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸8 min，4 ℃保存，取擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠核酸電泳和凝膠成像掃描儀進(jìn)行檢測(cè)與分析。擴(kuò)增片段膠回收，連接pMD19-T載體后，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選重組質(zhì)粒，送由上海生工生物有限公司測(cè)序。

1.2.3進(jìn)化關(guān)系分析應(yīng)用DNAStar、CLUSTAL W 軟件將測(cè)序樣本的序列與GenBank中已公布的BVDV參考序列進(jìn)行多序列比較， 使用MEGA 6.06軟件以Neighbor-Joining法(Bootstrap 值為1 000)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4細(xì)胞及病毒的分離培養(yǎng)細(xì)胞瓶中用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)MDBK細(xì)胞12 h，使細(xì)胞生長(zhǎng)致單層細(xì)胞后，將處理后的樣本感染細(xì)胞24 h，同時(shí)接種BVDV OregonC24V標(biāo)準(zhǔn)毒作為陽(yáng)性對(duì)照組和不接種病毒的MDBK做陰性空白對(duì)照組，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)并觀察細(xì)胞狀態(tài)。待細(xì)胞病變后空泡面積達(dá)50%以上后收毒。細(xì)胞培養(yǎng)物于-80 ℃反復(fù)凍融3次后10 000 r·min-1離心10 min，上清移至離心管中放入-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5間接免疫熒光檢測(cè)待細(xì)胞培養(yǎng)板上的細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，棄去維持液并用PBS(pH為7.4)洗滌3次，每次3 min。每孔加入80%冰丙酮 1 mL，在4 ℃條件下固定10 min左右，棄掉丙酮后用PBS洗滌3次。每孔加入1∶300稀釋的一抗(BVDV多克隆抗體)1 mL，37 ℃孵育45 min。一抗孵育結(jié)束后用PBS洗滌3次，再加1∶1 000稀釋的FITC標(biāo)記的兔抗羊IgG二抗，每孔1 mL，37 ℃孵育45 min。二抗孵育結(jié)束后再用PBS洗滌5次以上，滴加含有DAPI的封片液，室溫孵育10 min使用吸水紙吸取殘留液體后直接在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核周邊有無(wú)綠色熒光出現(xiàn)，判定標(biāo)準(zhǔn)如下：(-)無(wú)綠色熒光；(+)綠色熒光較弱，但清楚可見；(++)綠色熒光明亮；(+++～++++)綠色熒光閃亮。待檢樣本特異性綠色熒光強(qiáng)度達(dá)“++”以上，而各種對(duì)照顯示為(±)或(-)，即可判定為陽(yáng)性。

1.2.6病毒毒價(jià)測(cè)定將“1.2.4”中細(xì)胞培養(yǎng)物用細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液做連續(xù)10倍梯度稀釋，從10-3稀釋到10-13，依次吸取病毒液100 μL 接種到長(zhǎng)滿單層MDBK細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每一個(gè)稀釋度接種8個(gè)培養(yǎng)孔，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐天觀察并記錄病變情況，同時(shí)設(shè)立未接毒的正常細(xì)胞作對(duì)照，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50，計(jì)算方法：距離比例=(高于50%的百分?jǐn)?shù)-50%)/(高于50%的百分?jǐn)?shù)-低于50%的百分?jǐn)?shù))；TCID50的對(duì)數(shù)=高于50% 的最高稀釋對(duì)數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對(duì)數(shù)

2　結(jié)　果

2.1　2016年川藏地區(qū)牦牛BVDV分子流行病學(xué)調(diào)查

根據(jù)引物BVDV-P1、BVDV-P2進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示149份出現(xiàn)腹瀉癥狀牦牛的糞便樣品中，有29份擴(kuò)增出了特異性條帶，部分樣品的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1。川藏地區(qū)腹瀉牦牛糞便中BVDV陽(yáng)性檢出率為19.46%(95%CI=13.4%～26.7%)，西藏地區(qū)牦牛BVDV陽(yáng)性檢出率為27.14%(95%CI=17.2%～39.1%)，四川地區(qū)牦牛BVDV陽(yáng)性檢出率為12.66%(95%CI=6.2%～22.0%)。

M．DNA markerⅡ；P1～P3.陽(yáng)性對(duì)照；N1～N3.陰性對(duì)照；1～4. 5′-UTR RT-PCR產(chǎn)物(230 bp)；5～8.Npro RT-PCR產(chǎn)物(440 bp)；9～12. E2 RT-PCR產(chǎn)物(1 223 bp)M．DNA markerⅡ；P1-P3．Positive control；N1-N3．Negative control；1-4. The RT-PCR product (230 bp) of 5′-UTR; 5-8. The RT-PCR product (440 bp) of Npro; 9-12. The RT-PCR product (1 223 bp) of E2圖1　BVDV RT-PCR部分?jǐn)U增結(jié)果Fig.1　Partial amplified results of BVDV by RT-PCR

2.2　遺傳進(jìn)化分析

為了解2016年川藏地區(qū)牦牛BVDV主要的流行亞型及遺傳進(jìn)化情況，我們從西藏和四川兩個(gè)地區(qū)隨機(jī)選擇“2.1”中RT-PCR呈陽(yáng)性的樣本10份(5份來(lái)自西藏地區(qū)腹瀉牦牛，5份來(lái)自四川地區(qū)腹瀉牦牛),根據(jù)5′-UTR、Npro和E2基因的特異性引物(BVDV-P1～BVDV-P8)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增、測(cè)序。分別在230、440和1 223 bp處可見特異性擴(kuò)增條帶, 部分樣品的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1。將產(chǎn)物進(jìn)行回收克隆測(cè)序后結(jié)果顯示10個(gè)樣本均為BVDV-1型。將測(cè)序所得序列與GenBank中公布的11株BVDV 進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示，根據(jù)5′-UTR基因測(cè)序所得10株測(cè)序株之間的核苷酸相似性為86.6%～100%，與其他BVDV毒株5′-UTR基因的核苷酸相似性為69.1%～90.9%。Npro基因測(cè)序株之間的核苷酸和氨基酸序列相似性分別為72.8%～100%和74.7%～99.3%，與其他BVDV毒株Npro基因序列的核苷酸和氨基酸相似性分別介于74.9%～87.5%和82.3%～89.0%之間。E2基因測(cè)序結(jié)果顯示10株測(cè)序株之間的核苷酸和氨基酸相似性分別為68.2%～99.9%和66.8%～99.5%，與其他BVDV毒株E2基因序列的核苷酸和氨基酸相似性分別介于68.2%～97.8%和67.4%～96.0%。系統(tǒng)發(fā)育樹表明，西藏腹瀉牦牛糞便樣本(BB8、FB4、FB6、JB8和EB3)和四川腹瀉牦牛糞便樣本L8與BVDV-1d菌株10JJ-SKR更為密切相關(guān)，Z1、Z3、Z6和Z10分離株均與BVDV-1a菌株GS5在同一分支上(圖2)，研究結(jié)果表明10株BVDV陽(yáng)性樣本分別屬于BVDV-1a(n=4)和BVDV-1d(n=6)。

2.3　病毒的分離及鑒定

將RT-PCR呈陽(yáng)性的糞便樣本處理后接種于事先培養(yǎng)好的MDBK細(xì)胞中，盲傳7代后，BVDV-1a SWU-Z10和BVDV-1d SWU-L8兩個(gè)樣本在70 h左右出現(xiàn)與BVDV OregonC24V陽(yáng)性對(duì)照相同的典型的細(xì)胞病變，病變初期細(xì)胞出現(xiàn)圓縮的現(xiàn)象，逐漸出現(xiàn)拉網(wǎng)狀并開始脫落，正常MDBK細(xì)胞陰性對(duì)照沒(méi)有發(fā)生病變(圖3)，初步確定分離到了兩株CP型BVDV。按Reed-Muench法對(duì)兩株分離株的效價(jià)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果顯示，該兩株分離株SWU-Z10和SWU-L8第9代細(xì)胞毒的TCID50·100 μL-1分別為10-8. 11和10-5.81。通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)，顯微鏡下觀察可見，兩株分離株SWU-Z10和SWU-L8以及陽(yáng)性對(duì)照 OregonC24V毒株的細(xì)胞膜內(nèi)均出現(xiàn)了明亮的特異性綠色熒光，而陰性對(duì)照則未出現(xiàn)綠色熒光，說(shuō)明成功分離到SWU-Z10和SWU-L8兩株BVDV CP型毒株。

3　討　論

牦牛多生存于海拔3 000 m及以上的青藏高原地區(qū)，是典型的高原物種之一，具有“高原之舟”之稱。牦牛廣泛分布于中國(guó)青藏高原地區(qū)(西藏、青海、四川、云南等地區(qū))及其相鄰的高原地區(qū)。我國(guó)牦牛資源較為豐富、牦牛數(shù)量較多，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)有1 300多萬(wàn)頭牦牛，占世界牦牛總數(shù)的90%以上[18]。在青藏高原地區(qū)，牦牛作為最重要的高原生存物種之一，具有產(chǎn)肉、產(chǎn)奶、皮革和絨毛生產(chǎn)等多方面的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[19]。

標(biāo)記黑點(diǎn)的是測(cè)序株The sequencing strain is marked as a black spot圖2　基于5′-UTR(a)、Npro(b)和E2序列(c)的10株測(cè)序株的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2　Phylogenetic analysis of 10 sequencing strains based on 5′-UTR (a), Npro (b) and E2 sequence (c)

BVDV是導(dǎo)致牦牛腹瀉的重要病原，牦牛感染BVDV后可導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量下降，牛奶品質(zhì)差，繁殖力降低，生長(zhǎng)遲緩和繼發(fā)感染其他疾病。據(jù)調(diào)查該病在我國(guó)大部分地區(qū)廣泛存在，牛群中有相當(dāng)一部分是BVDV的攜帶者[20]。根據(jù)近年來(lái)的BVDV流行病學(xué)調(diào)查顯示，四川、西藏等地區(qū)均有不同程度的BVDV感染。筆者實(shí)驗(yàn)室通過(guò)PCR檢測(cè)從2013年青藏高原地區(qū)的20份腹瀉牦牛糞便樣品中病毒流行情況，BVDV陽(yáng)性率為15%，檢測(cè)2015年青藏地區(qū)腹瀉牦牛222份糞便樣品，BVDV陽(yáng)性率為20%[14]。本研究中川藏地區(qū)牦牛糞便BVDV的陽(yáng)性檢出率為19.46%，與之前的報(bào)道[10,14,17，21]大致相同，四川地區(qū)陽(yáng)性率有所降低。分析可能是因?yàn)闃颖静杉貐^(qū)差異以及我們研究所用的樣本為腹瀉牦牛的糞便，而之前文獻(xiàn)報(bào)道的樣本多為牦牛血清。

A. 接毒細(xì)胞細(xì)胞膜出現(xiàn)綠色熒光；B. DAPI染細(xì)胞核；C. A和B的結(jié)合圖；D.陰性對(duì)照(MDBK細(xì)胞)。OregonC24V、SWU-Z10和SWU-L8在MDBK細(xì)胞中引起典型的致細(xì)胞病變作用A．Green fluorescence occur in membrane of infected MDBK cells；B. Nucleus dyed by DAPI；C. Merged Fig. of A and B；D. Negative control (MDBK cells). OregonC24V, SWU-Z10 and SWU-L8 cause typical cytopathic effects in MDBK cells圖3　通過(guò)IFA檢測(cè)相關(guān)毒株感染MDBK細(xì)胞中的BVDV抗原Fig.3　Detection of BVDV antigen in MDBK cell infected with BVDV strains by IFA

在BVDV基因組中，E2糖蛋白編碼區(qū)通常被認(rèn)為是最不保守的區(qū)域之一，因此，該蛋白也被認(rèn)為是BVDV分型的依據(jù)之一，其抗原的變異導(dǎo)致BVDV可很好的適應(yīng)環(huán)境的變化，這種特性也導(dǎo)致了BVDV疫苗的免疫失效，且也是畜群感染BVDV后出現(xiàn)持續(xù)性感染的重要原因[22-23]。同時(shí)，作為BVDV的一個(gè)重要特征，亞型往往是群體特有的，不同的地區(qū)可能流行不同的亞型[24]。因此，在防控時(shí)必須認(rèn)識(shí)到BVDV分離株的變異性。據(jù)國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道，BVDV-1a、1b和2a在美國(guó)為主要的流行亞型[25]，歐洲許多國(guó)家主要流行BVDV-1a、1b、1d、1e和1f[11, 26]。日本和韓國(guó)主要流行BVDV-1b[27-28]，澳大利亞則主要流行BVDV-1c[29]。中國(guó)的主要亞型是BVDV-1b和1m[30]。BVDV-1b、1q和1m是中國(guó)青藏高原西藏和青海地區(qū)牦牛的主要BVDV亞型[17]。本研究中，我們根據(jù)E2基因設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)檢測(cè)呈陽(yáng)性的樣本進(jìn)行E2基因擴(kuò)增、測(cè)序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并結(jié)合5′-UTR和Npro所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示5株西藏腹瀉牦牛樣本與10JJ-SKR毒株相似性較高，均為BVDV-1d亞型，但是5株樣本單獨(dú)聚為一個(gè)分支，5株四川腹瀉牦牛樣本中1株屬BVDV-1d亞型，4株與GS5毒株相似性較高，屬BVDV-1a亞型，而GS5毒株與標(biāo)準(zhǔn)毒株OregonC24V同源。結(jié)果也進(jìn)一步說(shuō)明不同的地區(qū)所流行的主要亞型是不同的，因此應(yīng)該因地制宜地制定防控方案。

本研究從四川腹瀉牦牛糞便樣本中分離兩株病毒，經(jīng)病毒分離培養(yǎng)、RT-PCR與間接免疫熒光方法鑒定，確定兩株病毒均為CP型BVDV，并命名為SWU-Z10和SWU-L8，根據(jù)Reed-Muench法測(cè)定兩株病毒TCID50·100 μL-1分別為10-8.11和10-5.81，可見，兩株病毒的毒力相差很大，經(jīng)分析原因可能有以下幾點(diǎn)：(1)樣本采集地區(qū)差異。川藏地區(qū)由于地理、文化和經(jīng)濟(jì)等多種因素導(dǎo)致牦牛的養(yǎng)殖多屬于小型養(yǎng)殖或散養(yǎng)，而BVDV的傳播具有地域差異[30]，因此可能導(dǎo)致兩株分離株存在明顯的毒力差異。(2)通過(guò)同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示SWU-Z10屬于BVDV-1a亞型，與BVDV-1a標(biāo)準(zhǔn)毒株OregonC24V和NADL的同源關(guān)系較近，位于同一分支上，而BVDV OregonC24V和NADL毒株均為毒力較強(qiáng)的CP型BVDV標(biāo)準(zhǔn)毒株。(3)SWU-Z10樣本采集于四川地區(qū)腹瀉十分嚴(yán)重的牦牛，該牦牛臨床癥狀明顯，有排血便的現(xiàn)象。因此，我們也將在下一步的研究中著重研究?jī)芍瓴《镜闹虏⌒约爸虏×Φ认嚓P(guān)問(wèn)題。

4　結(jié)　論

對(duì)四川和西藏部分高原地區(qū)采集的149份臨床腹瀉牦牛糞便開展牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)分子流行病學(xué)調(diào)查，BVDV陽(yáng)性檢出率為19.46%。隨機(jī)取10份陽(yáng)性樣本，5′-UTR、Npro和E2基因分析結(jié)果表明10份樣本為BVDV-1型，包括BVDV-1a(n=4)和1d(n=6)亞型。成功分離鑒定出2株致細(xì)胞病變型BVDV，分別屬于牦牛BVDV-1a和1d亞型，命名為SWU-Z10和SWU-L8。川藏部分高原地區(qū)牦牛存在BVDV感染，BVDV-1a和1d為牦牛感染的主要亞型。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]LANYON S R, HILL F I, REICHEL M P, et al. Bovine viral diarrhoea: pathogenesis and diagnosis[J].VetJ, 2014, 199(2): 201-209.

[2]韓玉霞, 孟露萍, 孫志華, 等. 不同生物型BVDV感染對(duì)MDBK細(xì)胞類泛素基因轉(zhuǎn)錄水平的影響[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2015, 36(12): 11-17.

HAN Y X, MENG L P, SUN Z H, et al. Effects of different biological-types of Bovine Viral Diarrhea Virus infection on SUMO gene transcription levels in MDBK cells[J].ProgressinVeterinaryMedicine, 2015, 36(12): 11-17. (in Chinese)

[3]BACHOFEN C, VOGT H R, STALDER H, et al. Persistent infections after natural transmission of bovine viral diarrhoea virus from cattle to goats and among goats[J].VetRes, 2013, 44: 32.

[4]TAO J, LIAO J H, WANG Y, et al. Bovine viral diarrhea virus (BVDV) infections in pigs[J].VetMicrobiol, 2013, 165(3-4): 185-189.

[5]HELAL M A, OKAMATSU H, TAJIMA M. Bovine viral diarrhea virus infection in a dairy herd with high prevalence of persistently infected calves[J].JpnJVetRes, 2012, 60(2-3): 111-117.

[6]PINIOR B, FIRTH C L, RICHTER V, et al. A systematic review of financial and economic assessments of bovine viral diarrhea virus (BVDV) prevention and mitigation activities worldwide[J].PrevVetMed, 2017, 137: 77-92.

[8]COUVREUR B, LETELLIER C, COLLARD A, et al. Genetic and antigenic variability in bovine viral diarrhea virus (BVDV) isolates from Belgium[J].VirusRes, 2002, 85: 17-28.

[10]DENG M L, JI S K, FEI W T, et al. Prevalence study and genetic typing of bovine viral diarrhea virus (BVDV) in four bovine species in China[J].PLoSOne, 2015, 10(4): e0134777.

[11]GIAMMARIOLI M, CEGLIE L, ROSSI E, et al. Increased genetic diversity of BVDV-1: recent findings and implications thereof[J].VirusGenes, 2015, 50(1): 147-151.

[12]ZEMKE J. Characterization of recombinant BVDV-2 vaccine prototypes based on packaged replicons and replication competent deletion mutants[D]. LMU München: Tier?rztliche Fakult?t, 2010.

[13]張倩, 陶潔, 張東, 等. 國(guó)內(nèi)新型基因2型牛病毒性腹瀉病毒研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào), 2017, 25(1): 80-86.

ZHANG Q, TAO J, ZHANG D, et al. Research progress of genotype 2 bovine viral diarrhea virusin China[J].ChineseJournalofVeterinaryParasitology, 2017, 25(1): 80-86. (in Chinese)

[14]陳新諾, 張朝輝, 徐林, 等. 青藏高原牦牛感染BVDV和BEV的分子流行病學(xué)調(diào)查[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2016, 37(9): 35-38.

CHEN X N, ZHANG C H, XU L, et al. Investigation on molecular epidemiology of BVDV and BEV infections in yaks of Qinghai-Tibetan Plateau[J].ProgressinVeterinaryMedicine, 2016, 37(9): 35-38. (in Chinese)

[15]何美琳, 張煥容, 王永, 等. 川西北牦牛3種病毒性腹瀉病血清學(xué)調(diào)查[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2014, 41(3): 248-251.

HE M L, ZHANG H R, WANG Y, et al. Serological survey on three viral diarrhea diseases of yaks in Northwest Sichuan Province[J].ChineseJournalofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine, 2014, 41(3): 248-251. (in Chinese)

[16]KUTA A, POLAK M P, LARSKA M, et al. Predominance of bovine viral diarrhea virus 1b and 1d subtypes during eight years of survey in Poland[J].VetMicrobiol, 2013, 166(3-4): 639-644.

[17]GONG X W, LIU L H, ZHENG F Y, et al. Molecular investigation of bovine viral diarrhea virus infection in yaks (Bosgruniens) from Qinghai, China[J].VirolJ, 2014, 11: 29.

[18]拜彬強(qiáng), 郝力壯, 柴沙駝, 等. 牦牛肉品質(zhì)特性研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(17): 290-296.

BAI B Q, HAO L Z, CHAI S T, et al. Progress in understanding meat quality characteristics of yak[J].FoodScience, 2014, 35(17): 290-296. (in Chinese)

[19]李齊發(fā), 趙興波, 劉紅林, 等. 牦牛分類地位研究概述[J]. 動(dòng)物分類學(xué)報(bào), 2006, 31(3): 520-524.

LI Q F, ZHAO X B, LIU H L, et al. A review of the research on taxonomic status in yak (Poephagus)[J].ActaZootaxonomicaSinica, 2006, 31(3): 520-524. (in Chinese)

[20]范晴, 謝芝勛, 謝志勤, 等. 牛病毒性腹瀉病毒抗原捕獲ELISA方法的建立[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2015, 36(2): 4-2.

FAN Q, XIE Z X, XIE Z Q, et al. Development of antigen capture ELISA of detection bovine viral diarrhea virus[J].ProgressinVeterinaryMedicine, 2015, 36(2): 4-2. (in Chinese)

[21]GAO J F, LIU M Y, MENG X R, et al. Seroprevalence of bovine viral diarrhea infection in Yaks (Bosgrunniens) on the Qinghai-Tibetan Plateau of China[J].TropAnimHealthProd, 2013, 45(3): 791-793.

[22]KALAYCIOGLU A T. Bovine viral diarrhoea virus (BVDV) diversity and vaccination. A review[J].VetQ, 2007, 29(2): 60-67.

[23]PECORA A, MALACARI D A, PEREZ AGUIRREBURUALDE M S, et al. Development of an APC-targeted multivalent E2-based vaccine against bovine viral diarrhea virus types 1 and 2[J].Vaccine, 2015, 33(39): 5163-5171.

[24]OSTACHUK A. Bovine viral diarrhea virus structural protein E2 as a complement regulatory protein[J].ArchVirol, 2016, 161(7): 1769-1782.

[25]RIDPATH J F, LOVELL G, NEILL J D, et al. Change in predominance ofBovineviraldiarrheavirussubgenotypes among samples submitted to a diagnostic laboratory over a 20-year time span[J].JVetDiagnInvest, 2011, 23(2): 185-193.

[27]ABE Y, TAMURA T, TORII S, et al. Genetic and antigenic characterization of bovine viral diarrhea viruses isolated from cattle in Hokkaido, Japan[J].JVetMedSci, 2016, 78(1): 61-70.

[28]OEM J K, CHUNG J Y, ROH S, et al. Characterization and phylogenetic analysis ofBovineviraldiarrheavirusin brain tissues from nonambulatory (downer) cattle in Korea[J].JVetDiagnInvest, 2010, 22(4): 518-523.

[29]LANYON S R, REICHEL M P. Bovine viral diarrhoea virus (‘pestivirus’) in Australia: to control or not to control[J].AustVetJ, 2014, 92(8): 277-282.

[30]王煒. 牛主要呼吸道病毒病血清學(xué)調(diào)查、牛病毒性腹瀉病毒分離株鑒定及疫苗研究[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2014.

WANG W. Serosurvey of major bovine respiratory viruses and identification of BVDV isolates and vaccine development[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2014. (in Chinese)