捻轉(zhuǎn)血矛線蟲脂肪酶基因表達與生物學(xué)特性分析

周麗娜，胡孟娟，孫　偉，李祥瑞，徐立新，宋小凱，嚴若峰

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京 210095)

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchuscontortus)為毛圓科血矛屬線蟲，是反芻獸常見的胃腸道寄生性線蟲，該寄生蟲長期寄生于反芻動物皺胃黏膜，吸食宿主血液[1]，造成感染動物胃腸組織受到嚴重破壞，患畜表現(xiàn)嚴重貧血、衰弱，甚至死亡[2]，這給我國畜牧業(yè)發(fā)展帶來很大經(jīng)濟損失[3-4]。

目前，對該病的防控仍停留在化藥驅(qū)殺階段，然而，耐藥性蟲株的產(chǎn)生已嚴重影響藥物效力[5]，這迫使人們嘗試探究免疫學(xué)方法防治該病，因此，發(fā)掘新的具有強免疫原性或發(fā)育調(diào)節(jié)作用的潛在靶標是發(fā)展更有效防治該病方法的前提。

本實驗室孫偉博士[6]和其他研究者[7]的報道顯示，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲脂肪酶(Lipase)是一類催化合成和分解長鏈脂肪酸酯的酶，與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲發(fā)育調(diào)節(jié)相關(guān)，且其前18個氨基酸是信號肽區(qū)域，這預(yù)示Lipase為分泌型蛋白。據(jù)報道，一些分泌型蛋白酶、脂肪酶和C類凝集素同系物與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染和調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答密切相關(guān)[8]。本文對脂肪酶進行了克隆表達及相關(guān)生物學(xué)特性研究，以期為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的防治提供新靶標。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

1.1.1試驗動物和蟲體健康山羊，購自南京某山羊養(yǎng)殖場；雌性標重清潔大鼠，購自揚州大學(xué)實驗動物中心；捻轉(zhuǎn)血矛線蟲三期幼蟲由本實驗室保存。山羊經(jīng)人工感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲第三期幼蟲，21 d后收集糞便，一方面進行孵化得到新的三期幼蟲，另一方面利用食鹽水密度梯度法收集蟲卵，感染35 d后剖殺，從其皺胃挑取并收集成蟲。

1.1.2主要試驗試劑TRIzol?Reagent試劑購自Invitrogen公司；Total RNA Kit Ⅰ購自大連寶生物工程有限公司；脂肪酶(Lipase)活性試劑盒、Cy3標記山羊抗大鼠IgG(H+L)、DAPI染色液購自碧云天公司；HiScriptTMQ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)試劑盒、AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix試劑盒購自南京諾唯贊公司。

1.2　試驗方法

1.2.1PCR新鮮捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲10條左右，加入1 mL TRIzol低溫充分研磨蟲體，按Inviotrgen TRIZOL說明書步驟依次操作，提取RNA，然后按照說明書進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。

依據(jù)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲lipase基因序列(GenBank登錄號HQ44439.1)，顯示ORF序列全長918 bp，共編碼305個氨基酸，并進行蛋白質(zhì)預(yù)測分析。去除信號肽，用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，P1:5′-CGGAATTCTATTCAGACTCGTTGGCGAGG-3′；P2:5′-CGAGCTCTCA-TTCGGGCATTACCTCAAA-3′。EcoRⅠ和SacⅠ分別為上下游引物酶切位點，引物由通用生物公司合成。

以成蟲cDNA為模板，以上序列為引物進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.2Lipase基因的克隆擴大PCR反應(yīng)體系并回收產(chǎn)物，連接克隆載體pMD-19T，轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，挑單克隆，提取質(zhì)粒，并雙酶切鑒定，陽性克隆送至通用生物公司測序，測序結(jié)果顯示正確者命名為pMD-19T-Lipase，并應(yīng)用DNAStar軟件翻譯擴增出的實際序列，NCBI在線比對，應(yīng)用MEGA6完成進化樹分析。

1.2.3原核表達載體的構(gòu)建同時雙酶切pMD-19T-Lipase陽性質(zhì)粒和pET-32a(+)表達載體，回收目的片段，連接重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)中，挑單克隆，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定并選取陽性測序，測序顯示正確者為pET-32a(+)-Lipase。

1.2.4表達產(chǎn)物的分析和融合蛋白的獲得選取構(gòu)建成功的重組菌接種于含氨芐霉素(工作濃度為50 μg·mL-1)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)，采用IPTG(工作濃度0.1 mmoL·L-1)誘導(dǎo)表達，確定表達峰值時間。

擴大體系同上操作，誘導(dǎo)培養(yǎng)至表達峰值，收集誘導(dǎo)后菌體，超聲破碎，將上清和包涵體進行SDS-PAGE，確定表達產(chǎn)物的分布情況。

參照說明書使用His蛋白純化柱對表達產(chǎn)物進行純化，將純化好的蛋白質(zhì)于含梯度尿素的復(fù)性緩沖液進行復(fù)性，得到融合蛋白質(zhì)，根據(jù)說明書測定蛋白質(zhì)濃度，除菌分裝，于-70 ℃凍存。

1.2.5抗血清的制備取兩只SD大鼠，200 μg融合蛋白質(zhì)與等量的弗氏完全佐劑充分乳化，首次免疫；兩周后等量蛋白質(zhì)加等體積弗氏不完全佐劑充分乳化，再次免疫大鼠；每間隔一周進行三免和四免，與二免相同；四免一周后眼眶下靜脈采血，分離血清并分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆?。純化?2a蛋白進行相同操作，采血作為陰性對照。

1.2.6融合蛋白質(zhì)的抗原特性分析取適量融合蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE電泳后，進行轉(zhuǎn)印，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜上；5%脫脂奶粉封閉過夜；TBST清洗多次，以感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲山羊的血清作為一抗(1∶100稀釋)，未感染山羊的血清作為陰性對照，37 ℃孵育1 h；TBST清洗膜數(shù)次，以兔抗山羊IgG-HRP作為二抗(1∶5 000稀釋)，37 ℃避光孵育1 h；TBST清洗膜數(shù)次，最后DAB避光顯色，拍照。

1.2.7融合蛋白質(zhì)酶活性檢測Lipase又稱甘油酯水解酶，根據(jù)脂肪酶活性檢測試劑盒說明書分別在不同溫度和pH值下進行以下反應(yīng)：

倍比稀釋試劑盒中底物，分別進行等量酶活測定，并在0、1、2、3、4 min時分別測定吸光值，建立底物濃度和最大反應(yīng)速度關(guān)系，計算該脂肪酶米氏常數(shù)。

1.2.8Lipase階段性表達量分析將捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的蟲卵、L3、雌蟲、雄蟲分別用Trizol法提取RNA(蟲卵用Total RNA Kit I試劑盒)，并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，即可利用前期驗證合適的引物(內(nèi)參基因和目的基因擴增Ct差值與模板濃度回歸線斜率絕對值<0.1)進行△△Ct方法[9]檢測lipase基因在該病原體各階段的表達量。

根據(jù)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲lipase基因和β-tubulin基因序列設(shè)計用于實時定量PCR的引物。送英濰捷基(上海)有限公司設(shè)計合成(表1)。

表1RT-PCR用引物

Table1TheprimersofRT-PCR

目的基因Targetgene引物名稱Primername引物序列(5'→3')Primersequences片段大小/bpLengthofthegeneβ-tubulinB1B2TGCTATGTTCCGTGGTCGTATGCGGCAGTCTTAACGTTGTTTGG116LipaseM1M2GCAGCGACGGTTTATGGTTCGTGAAAGGGTAGGCCCGATT113

用已驗證合適的引物分別擴增捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雌蟲、雄蟲、三期幼蟲和蟲卵β-tublin和lipase基因，記錄每次Ct平均值及RQ值，應(yīng)用SPSS軟件分析數(shù)據(jù)，用GraphPad軟件作圖。

1.2.9融合蛋白質(zhì)的組織定位將收集的成蟲取出，PBS沖洗干凈，雌雄分開，晾干后進行包埋，切片(一般片厚10 μm)，切下后快速貼合于預(yù)處理的防脫載玻片上，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

常溫下放置冰凍切片30 min，4 ℃預(yù)冷的丙酮固定10 min，然后干燥靜置；TBST清洗4次，用5%BSA封閉，4 ℃過夜；TBST清洗數(shù)次，以抗原蛋白質(zhì)免疫的大鼠血清為一抗(1∶100稀釋)，對照組加等量同稀釋倍數(shù)的空白大鼠血清，37 ℃孵育1 h；TBST清洗數(shù)次，以Cy3-山羊抗大鼠IgG為二抗(1∶500稀釋)，37 ℃避光孵育1 h；TBST清洗數(shù)次，DAPI室溫避光復(fù)染5 min，TBST清洗數(shù)次，最后滴加抗淬滅劑封片，盡快于激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

2　結(jié)　果

2.1　捻轉(zhuǎn)血矛線蟲lipase基因的克隆

2.1.1Lipase蛋白預(yù)測分析根據(jù)http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/預(yù)測分析蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示前18個氨基酸是信號肽區(qū)域(圖1)。

圖1　Hc-Lipase氨基酸序列分析Fig.1　Analysing of lipaseamino acid sequence

2.1.2Lipase基因克隆PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見864 bp處有一條特異性條帶(圖2A)，回收純化PCR產(chǎn)物，與載體pMD-19T連接，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后，得到大小約為864 bp的目的片段和2 800 bp左右的載體片段(圖2B)。

A. RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳；B. 重組質(zhì)粒pMD-19T-Lipase雙酶切鑒定；M. DNA相對分子質(zhì)量標準DL2000；1. RT-PCR擴增產(chǎn)物；2. 重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR Ⅰ和Sac Ⅰ雙酶切A. Agarose gel electrophoresis of lipase RT-PCR products; B. Identification of recombinant plasmid pMD-19T-Lipase by restriction enzyme digestion; M. DNA marker DL2000; 1. Products of RT-PCR; 2. Recombinant plasmid digested by double enzymes圖2　Lipase基因的克隆及鑒定Fig.2　Cloning and identification of lipase gene

2.2　捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Lipase多重分析

NCBI在線比對擴增片段的氨基酸序列，結(jié)果顯示與Haemonchuscontortus相似性達100%;與Dictyocaulusviviparous、Ancylostomaceylanicum、Ancylostomaduodenale相似性分別是65%、65%、61%；與秀麗隱桿線蟲類Caenorhabditisbriggsae、Caenorhabditisbrenneri、Caenorhabditisremanei、Caenorhabditiselegans相似性分別是65%、52%、 51%、 51%。

由進化樹分析結(jié)果(圖3)，可粗略估計這幾個同源性相近的線蟲在進化時間和地位上的相對性，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchuscontortus)Lipase與Dictyocaulusviviparous、Ancylostomaceylanicum、Ancylostomaduodenale共處于一個分支，因此可猜測四者在進化時間上相對其他線蟲更相近，同處于一個更近的進化地位。

圖3　捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Lipase氨基酸多重分析Fig.3　Multiple alignment of amino acid sequence of Hc-Lipase

2.3　捻轉(zhuǎn)血矛線蟲lipase基因的原核表達

構(gòu)建的pET-32a(+)-Lipase質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，結(jié)果顯示有一條5 900 bp左右的載體片段和一條約864 bp的目的片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖4)。

SDS-PAGE結(jié)果顯示，pET-32a(+)-Lipase表達產(chǎn)物為50 ku左右，且其表達量隨著誘導(dǎo)時間的延長不斷增高，并在誘導(dǎo)6 h時達到最高(圖5A)。誘導(dǎo)表達后的菌體破碎物顯示，目的蛋白質(zhì)主要以包涵體的形式存在，利用His蛋白純化柱純化得到目的蛋白質(zhì)，SDS-PAGE顯示純化效果較好(圖5B)。

M. DNA相對分子質(zhì)量標準DL2000；1. 重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR Ⅰ和Sac Ⅰ雙酶切M. DNA marker DL2000; 1. Recombinant plasmid digested by EcoR Ⅰ and Sac Ⅰ圖4　重組表達質(zhì)粒pET-32a(+)-Lipase的鑒定Fig.4　Identification of recombinant expression plasmid pET-32a(+)-Lipase

2.4　融合蛋白質(zhì)的抗原特性分析

Western blot檢測結(jié)果顯示，在50 ku左右有一條特異性條帶，而陰性對照沒有條帶出現(xiàn)(圖6)，說明Lipase蛋白具有良好的抗原特性，能被宿主免疫系統(tǒng)識別。

M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1～2. pET-32a(+)誘導(dǎo)0和5 h的裂解產(chǎn)物；3～9. pET-32a(+)-Lipase誘導(dǎo)表達0～6 h的細菌裂解產(chǎn)物；10. pET-32a(+)-Lipase誘導(dǎo)6 h后的裂解產(chǎn)物；11. 表達產(chǎn)物上清；12. 表達產(chǎn)物包涵體；13.純化后的目的蛋白質(zhì)M. Protein molecular weight marker; 1-2. pET-32a(+) induced by IPTG for 0 and 5 hours; 3-9. pET-32a(+)-Lipase induced by IPTG for 0-6 hours; 10. pET-32a(+)-Lipase induced by IPTG for 6 hours;11. Supernatant of expression products; 12. Precipitate of expression products; 13. Purification of target protein圖5　pET-32a(+)-Lipase的表達(A)與純化(B)Fig.5　Expression (A) and purification (B) of pET-32a(+)-Lipase

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1. 融合蛋白與感染山羊血清的Western blot分析；2. 陰性對照M. Protein molecular weight marker; 1. Fusion protein recognized by serum from infected goat as primary antibody; 2. Negative control圖6　融合蛋白質(zhì)的Western blot 分析Fig.6　Western blot analysis of fusion protein

2.5　融合蛋白的酶活性分析

2.5.1融合蛋白的酶活最適條件結(jié)果表明pET32a標簽蛋白可近似認為不具有脂肪酶活性，融合蛋白Lipase具有一定的脂肪酶活性，且酶促反應(yīng)最佳條件為37 ℃左右，pH為7左右(圖7)。

2.5.2融合蛋白Km結(jié)果顯示底物濃度(S)與反應(yīng)速度(v)雙倒數(shù)關(guān)系線方程為y=7.648 9x+67.867，因此該脂肪酶km值為0.118 mmol·L-1(圖8)。

2.6　Lipase階段性表達

結(jié)果顯示，內(nèi)參基因和目的基因△Ct與模板濃度關(guān)系回歸線方程式為y=0.046 2x+3.547 5，R2=0.104 1；斜率絕對值<0.1 (圖9)，因此引物符合要求，用此引物進行階段性探究，結(jié)果顯示Hc-Lipase具有階段性表達現(xiàn)象，且基因在雄蟲表達量最高，是雌蟲的7.522 343倍，三期幼蟲階段表達量最低是雌蟲的0.026 569倍，而在蟲卵階段表達量是雌蟲的4.968 598倍(圖10)。

圖7　溫度和pH對融合蛋白脂肪酶活性影響Fig.7　The effect of temperature and pH on the Lipase activity of fusion protein

圖8　底物濃度與反應(yīng)速度關(guān)系Fig.8　The relationship between substrate concentration and velocity

圖9　lipase基因引物有效性試驗結(jié)果Fig.9　The results of effectiveness of lipase primers

2.7　Hc-Lipase在蟲體的組織定位

結(jié)果顯示Hc-Lipase在雌蟲、雄蟲組織上均有表達，大多在蟲體表皮和腸腔表面，其他部位組織有少量表達。對照組未檢測出紅色熒光(圖11)。

P(Male)<0.01;P(L3)<0.001;P(Egg)<0.001圖10　lipase在各生活期的相對轉(zhuǎn)錄量Fig.10　The transcription of lipase gene in different life cycles

3　討　論

隨著防控捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的化學(xué)藥物的廣泛大量使用，使耐藥蟲株不斷出現(xiàn)，這給疾病的防治帶來巨大困難[10]，因此尋找新的藥物靶標和嘗試采用疫苗等免疫學(xué)手段防治捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病受到大家更廣泛的關(guān)注。從而，尋找具免疫保護性的蟲體特異性抗原成為探究新的防治方法必要前提[11]，眾多研究表明，Lipase(脂肪酶)是一類重要的分泌蛋白之一，且與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲發(fā)育調(diào)節(jié)相關(guān)，因此對該蛋白質(zhì)的深入研究有助于了解蟲體發(fā)育調(diào)節(jié)的作用機制，對篩選出新的可用于抗捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的潛在靶標具有重要意義。

本文選取捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Lipase進行克隆表達，在NCBI比對分析其氨基酸序列[12]，發(fā)現(xiàn)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Lipase與一些線蟲相關(guān)氨基酸有較高同源性，具有保守結(jié)構(gòu)域。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(H.contortus)與胎生網(wǎng)尾線蟲(Dictyocaulusviviparous)、錫蘭鉤口線蟲(Ancylostomaceylanicum)、十二指腸鉤口線蟲(Ancylostomaduodenale)脂肪酶相似性較高，且在同一個進化分支上，因此可粗略估計脂肪酶類進化中，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲在進化地位和時間上與這三者相對其他更接近[12-13]，與其保守序列的功能和關(guān)系需深入探究。

胞核結(jié)合DAPI(藍色)，靶蛋白集合Cy3(紅色)。A、B捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Lipase在雌雄成蟲定位情況； C：陰性對照組沒有靶蛋白熒光Nuclei were stained with DAPI (blue) and target protein with Cy3 (red). A, B. The Hc-Lipase positioning at male and female adult worm’s; C. No fluorescence was observed in control圖11　激光共聚焦分析捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Lipase在成蟲組織定位Fig.11　Localisation of Hc-Lipase in H. contortus adult worm by immunofluorescence assay

經(jīng)脂肪酶活性檢測可知，所純化的融合蛋白質(zhì)具有脂肪酶活性，在37 ℃、pH7條件下酶活性最高。據(jù)資料報道，水產(chǎn)動物刺參腸道內(nèi)脂肪酶的最適條件為40 ℃和pH7.5，葡萄球菌脂肪酶為40 ℃和pH6.8～7.5，米根霉類脂肪酶為40 ℃和pH8.5，假絲酵母類脂肪酶為37 ℃和pH7.4[14-17]，這說明不同物種脂肪酶最適條件不同，可推測與其分泌部位環(huán)境和所屬動物的習(xí)性有密切關(guān)系。Western blot 分析顯示，構(gòu)建的融合蛋白質(zhì)具有良好反應(yīng)原性[18]， Lipase對蟲體免疫的調(diào)節(jié)作用還需要進一步研究。

隨著實時定量PCR的應(yīng)用，很多研究證明RT-PCR對基因量檢測的優(yōu)越性和可靠性[19]，已有文章報道應(yīng)用此方法檢測線蟲某基因在生活周期階段性表達量[20-21]；同樣，本試驗采用△△Ct方法檢測顯示Hc-Lipase在雄蟲階段表達量最高。有關(guān)研究證明，抗原的組織表達量和其對蟲體免疫調(diào)節(jié)作用重要性有一定聯(lián)系[22]，因此Lipase可能是捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重要抗原之一，對其如何調(diào)節(jié)發(fā)育和免疫功能的機制還需探究。

S. H. Nagaraj等[23]報道稱mRNA的轉(zhuǎn)錄水平與蛋白質(zhì)的表達之間是相互獨立的兩個過程，因此本研究通過免疫組化的方法進一步分析了Lipase在雌蟲、雄蟲中的組織定位。免疫熒光技術(shù)的基礎(chǔ)是抗原抗體的反應(yīng)，利用已知的熒光抗體(抗大鼠Cy3抗體)直接與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲組織結(jié)合，具有簡單快捷、精度準確的特點。本試驗發(fā)現(xiàn)Hc-Lipase主要在蟲體表皮、腸腔表面及腸段組織表達，此結(jié)果證明Lipase是蟲體結(jié)構(gòu)組成的重要部分；且有研究證明，在蟲體(尤其是表皮、腸腔)表達較多的抗原物質(zhì)更可能與抗原分泌及寄生蟲感染有密切關(guān)聯(lián)，對免疫細胞功能也具有調(diào)節(jié)作用[24-25]，因此有理由認為Lipase與蟲體抗原性和分泌有關(guān)，也與病原體免疫逃避密切相關(guān)，在病原體免疫調(diào)節(jié)上具有重要地位。深入研究捻轉(zhuǎn)血矛線蟲脂肪酶的功能，對發(fā)現(xiàn)新的防治靶標具有重要意義。

4　結(jié)　論

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲脂肪酶基因序列具有一定保守性，但與其他線蟲脂肪酶在同源性和進化的時間、地位上有所不同；與脂肪代謝有關(guān)且具有較高的反應(yīng)原性；在蟲體分布較廣泛，尤其蟲體表面以及腸腔，且其表達具有一定階段性。推測該抗原蛋白可能參與蟲體發(fā)育、代謝和調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答等過程。

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