細粒棘球絳蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因的克隆、表達及診斷價值的初步評價

吳茂迪，宋星桔，閆　敏，陽愛國，郭　莉，王　凝，謝　躍，古小彬，楊光友*

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，成都 611130；2. 四川省動物疫病預防控制中心，成都 610041)

細粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)的中絳期幼蟲(細粒棘球蚴)寄生于人和動物的肝和肺等組織器官引起細粒棘球蚴病(cystic echinococcosis, 又稱囊性包蟲病)，是一種重大的人獸共患病[1-4]，該病呈世界性分布，我國是高發(fā)國家之一，主要在內(nèi)蒙古、新疆、青海、西藏、寧夏、四川、甘肅等省份流行[5]。包蟲病嚴重危害人體健康，同時給畜牧業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，給人類帶來許多公共衛(wèi)生問題。我國已將該病列為《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃》(2012—2020年)優(yōu)先防治和重點防范的動物疫病。

半胱氨酸蛋白酶抑制劑是半胱氨酸蛋白酶類可逆性緊密結(jié)合抑制劑。根據(jù)半胱氨酸蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)將其分為4個大家族，即Ⅰ型(the stefin)、Ⅱ型(the cystatin)、Ⅲ型(the kininogen)和Ⅳ型(the fetuin)[6-7]。其中，Ⅱ型cystatin屬于分泌性蛋白，在N末端有信號肽序列，該家族蛋白一般分泌到細胞外參與外源蛋白的調(diào)節(jié)[8]。在對寄生性線蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑的研究中發(fā)現(xiàn)該酶對宿主具有干預抗原呈遞過程，調(diào)節(jié)細胞因子生成，活化巨噬細胞等作用[9-11]。因此，它在線蟲逃避宿主免疫應答和適應寄生生活中發(fā)揮著重要作用[12]。在絳蟲上，李君君等[13]對豬帶絳蟲的cystatin進行了三級結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)域能與半胱氨酸蛋白酶活性位點結(jié)合來發(fā)揮抑制作用。

目前有關(guān)于細粒棘球絳蟲cystatin的研究，尚未見有報道。本研究對細粒棘球絳蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Eg-cystatin)的基本特性進行分析與蟲體組織定位，并通過間接ELISA初步評價其診斷價值，為今后該蛋白質(zhì)的功能研究提供重要資料。

1　材料與方法

1.1　蟲體與實驗動物

細粒棘球蚴包囊來自于自然感染的綿羊肝，樣本采自青海省的某屠宰場。在無菌條件下，使用一次性注射器反復吹打后抽取包囊囊液，并分離生發(fā)層，囊液經(jīng)3 000 r·min-1離心5 min，用滅菌生理鹽水和PBS分別洗滌3次，獲得細粒棘球蚴原頭蚴。成蟲由四川農(nóng)業(yè)大學寄生蟲病研究中心提供。兩只9周齡(2.5 kg)雌性新西蘭大白兔購自成都達碩實驗動物中心。

1.2　生物信息學分析

Eg-cystatin全長核酸序列下載自細粒棘球絳蟲基因組數(shù)據(jù)庫GeneDB (EgrG_000849600) (http://www.genedb.org/)。以在線軟件SignalP 4.1 server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和ExPaSy (http://www.expasy.org/) 分別對Eg-cystatin的信號肽、理化參數(shù)、保守結(jié)構(gòu)域、糖基化和磷酸化位點進行預測。以推導出的氨基酸序列找出同源序列，并用Clustal X 1.83 軟件進行比對。

用DNAMAN比較同源基因的相似性。

用MEGA 5.05軟件采用鄰接法構(gòu)建進化樹，并進行系統(tǒng)進化分析。

1.3　Eg-cystatin的克隆、表達與純化

以除去信號肽序列的Eg-cystatin序列為模板設(shè)計一對特異性引物(上游5′-CCGGAATTCAGACAGCAAGAGCGCAGCGT-3′，下劃線為EcoRⅠ酶切位點；下游5′-ACGCGTCGACTAGGGCTGTGGGGTCTTGAT-3′，下劃線為SalⅠ酶切位點)。從cDNA中擴增出Eg-cystatin序列，將擴增產(chǎn)物連接到pET28a(+)質(zhì)粒上并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中。細胞在1 mmol·L-1IPTG下37 ℃誘導5 h，離心收集菌體沉淀，用超聲破碎儀超聲裂解重組菌。重組蛋白質(zhì)以Ni2+親和層析的方法進行純化。純化后的蛋白質(zhì)濃度用BCA蛋白試劑盒進行測定。

1.4　血清

24份健康綿羊血清采自細粒棘球蚴病的非流行區(qū)，并通過剖檢確定無帶科絳蟲感染；24份自然感染細粒棘球蚴的綿羊血清、12份自然感染腦多頭蚴的綿羊血清、3份自然感染細頸囊尾蚴綿羊血清以及7份自然感染細頸囊尾蚴山羊血清均采自四川省。以上陽性血清均經(jīng)剖檢確認，為單一的帶科絳蟲感染。

1.5　兔抗 rEg-cystatin-IgG

將純化后的rEg-cystatin蛋白分別與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑按照 1∶1 比例混合制備乳劑苗，對兩只新西蘭兔進行三次皮下注射免疫，每次免疫間隔兩周，第一次用弗氏完全佐劑和200 μg重組蛋白質(zhì)皮下注射免疫，后兩次均用弗氏不完全佐劑和200 μg重組蛋白質(zhì)皮下注射免疫。收集血清，用Hitrap蛋白A親和層析純化。

1.6　免疫印跡和免疫熒光定位

重組蛋白質(zhì)與原頭蚴裂解液分別進行12%SDS-PAGE凝膠電泳，再將凝膠分別轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。經(jīng)5%脫脂牛奶封閉后，分別以綿羊陽性、陰性血清和兔高免血清、對照血清對重組蛋白質(zhì)進行孵育；以重組蛋白質(zhì)高免血清和對照血清對原頭蚴裂解液進行孵育。經(jīng)洗滌后，以HRP標記的兔抗綿羊二抗對重組蛋白質(zhì)進行孵育；并以HRP標記的山羊抗兔二抗對原頭蚴裂解產(chǎn)物進行孵育。最后在顯色底物作用下進行顯色觀察。

取原頭蚴、生發(fā)層和成蟲制備切片，經(jīng)脫蠟、脫水處理后，用重組蛋白質(zhì)高免血清4 ℃孵育過夜。反復洗滌切片后，以FITC標記的山羊抗兔熒光二抗對蟲體進行顯色，并在熒光顯微鏡下進行觀察。

1.7　ELISA的建立和評估

用建立的間接ELISA分別對7份山羊細頸囊尾蚴陽性血清、3份綿羊細頸囊尾蚴陽性血清以及12份綿羊腦多頭蚴血清進行檢測，檢測其交叉反應。

臨床檢測用24份陰性血清建立的間接ELISA方法分別對24份細粒棘球蚴病陰性綿羊血清和24份細粒棘球蚴病陽性綿羊血清進行，檢測臨界值判斷該方法的可靠性。按照特異性=真陰性血清數(shù)/(真陰性血清數(shù)+假陽性血清數(shù))；敏感性=真陽性血清數(shù)/(真陽性血清數(shù)+假陰性血清數(shù))；符合率=(真陽性血清數(shù)+真陰性血清數(shù))/(真陽性血清數(shù)+真陰性血清數(shù)+假陽性血清數(shù)+假陰性血清數(shù))，計算出特異性、敏感性及符合率。所有血清樣品評價批間變異和批內(nèi)變異的變異系數(shù)(CV)。每個樣品包被三個板檢測批間CV，并在每個板內(nèi)進行三個重復檢測批內(nèi)CV。

2　結(jié)　果

2.1　Eg-cystatin基因的擴增與生物信息學分析

Eg-cystatin(EgrG_000849600)基因全長825 bp，編碼274個氨基酸，預測相對分子質(zhì)量為30.8 ku。經(jīng)氨基酸序列預測，發(fā)現(xiàn)在第18和第19個氨基酸之間有信號肽存在，切除信號肽后長度為256個氨基酸，預測相對分子質(zhì)量為28.9 ku，等電點為5.7，無糖基化位點，存在磷酸化位點。氨基酸序列分析顯示Eg-cystatin含有cystatin結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域包括Q-X-V-X-G保守序列，靠近N端的甘氨酸殘基，PW發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。序列比對結(jié)果顯示，Eg-cystatin與多房棘球絳蟲cystatin相似性最高，達到80.66%，與豬帶絳蟲、牛帶絳蟲以及亞洲帶絳蟲的cystatin相似性為72.20%～75.91%，與馬來絲蟲、日本血吸蟲、剛地弓形蟲相似性極低(圖1)。進化樹結(jié)果顯示，在蠕蟲上，Eg-cystatin與多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis)、微小膜殼絳蟲(Hymenolepisnana)、豬帶絳蟲(Taeniasolium)、牛帶絳蟲(Taeniasaginata)以及亞洲帶絳蟲(Taeniaasiatica)等寄生蟲的cystatin屬于同一支(圖2)。

2.2　重組蛋白質(zhì)的表達與免疫印跡

除去信號肽的Eg-cystatin蛋白質(zhì)在SDS-PAGE下顯示為單一條帶，大小約為33 ku，符合預期大小[加上pET28a (+)質(zhì)粒所表達的His標簽蛋白]。免疫印跡顯示，rEg-cystatin能被兔抗rEg-cystatin-IgG和細粒棘球蚴病陽性綿羊血清識別(圖3)，且為單一條帶，陰性對照無條帶，說明Eg-cystatin具有較好的免疫原性。以兔抗rEg-cystatin-IgG識別原頭蚴粗蛋白質(zhì)提取液，顯示有單一條帶，大小與天然蛋白質(zhì)相近(30.8 ku)。

2.3　Eg-cystatin在細粒棘球絳蟲各生活史階段的定位

利用免疫熒光技術(shù)，以兔抗rEg-cystatin抗體來測定Eg-cystatin在細粒棘球絳蟲各生活史階段的定位。結(jié)果顯示，Eg-cystatin分布于原頭蚴的表皮以及頂突鉤上，廣泛分布于成蟲蟲體的內(nèi)部，蟲卵與表皮上也有少量分布，生發(fā)層廣泛分布(圖4)。

Q-X-V-X-G活性位點用黑字綠底表示。N端保守的甘氨酸殘基用白字藍底表示。PW發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)用黑字紅底表示。信號肽用藍色括弧表示。GenBank登陸號：E.granulosus cystatin (GenBank: EUB63448.1), E. multilocularis cystatin (GenBank: CDS40893.1), T.solium cystatin (GenBank: AIM55117.1), T.saginata cystatin (GenBank: AIM55120.1), T.asiatica cystatin (GenBank: AIM55123.1), H.microstoma cystatin (GenBank: CDS28976.1), B.malayi cystatin (GenBank: XP_001895476.1), S.japonicum cystatin (GenBank: ACU68954.1), and T.gondii cystatin (GenBank: ABR26639.1)The Q-X-V-X-G motif is shown in black letters with a green background. A conserved glycine residue in the N-terminal region is marked as a white letter on a blue background. The P-W hairpin loop in the C-terminal region is marked in black letters with a red background. The signal peptide is marked with the blue bracket. GenBank accession numbers: Echinococcus granulosus cystatin (GenBank: EUB63448.1), Echinococcus multilocularis cystatin (GenBank: CDS40893.1), Taenia solium cystatin (GenBank: AIM55117.1), Taenia saginata cystatin (GenBank: AIM55120.1), Taenia asiatica cystatin (GenBank: AIM55123.1), Hymenolepis microstoma cystatin (GenBank: CDS28976.1), Brugia malayi cystatin (GenBank: XP_001895476.1), Schistosoma japonicum cystatin (GenBank: ACU68954.1), and Toxoplasma gondii cystatin (GenBank: ABR26639.1)圖1　Eg-cystatin氨基酸序列比對Fig.1　Amino acid sequence analysis of Eg-cystatin

2.4　ELISA

間接ELISA結(jié)果顯示，抗原最佳質(zhì)量濃度為0.8 μg·孔-1，最佳血清稀釋度為1∶320。在最適濃度下，得出臨界值為0.427。用建立的間接ELISA分別對綿羊抗腦多頭蚴血清和山羊抗細頸囊尾蚴陽性血清進行檢測，結(jié)果顯示有8個血清與綿羊腦包蟲血清有交叉反應，有7個血清與細頸囊尾蚴有交叉反應，因此，其存在嚴重的交叉反應。用24份綿羊細粒棘球蚴病陽性血清和24份陰性血清對建立的間接ELISA方法進行臨床檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有5個假陽性和4個假陰性，特異性為79.1%，敏感性為83.3%，符合率僅為81.25%(圖5)。批內(nèi)重復性試驗結(jié)果顯示，板內(nèi)的變異系數(shù)介于1.332%～1.589%，平均值為1.495%，板間變異系數(shù)介于2.318%～4.095%，平均值為3.282%。板內(nèi)與板間系數(shù)均<10%，表明該方法重復性好。

3　討　論

半胱氨酸蛋白酶抑制劑是一類在生物體內(nèi)廣泛存在的能夠可逆性地抑制半胱氨酸蛋白酶的抑制劑超家族[16]。半胱氨酸蛋白酶抑制劑不僅能特異性抑制半胱氨酸蛋白酶的活性，而且是寄生蟲產(chǎn)生的重要免疫調(diào)節(jié)分子[12]。近年來，cystatin備受研究者的關(guān)注，在寄生蟲領(lǐng)域中，研究得比較深入的是有關(guān)線蟲cystatin調(diào)控宿主的免疫反應方面[9-12]。此外，日本血吸蟲cystatin被證明有誘導M2巨噬細胞極化，促進TNF-α和IL-6產(chǎn)生的作用[17]。華支睪吸蟲的stefin位于腸上皮，并發(fā)現(xiàn)其能調(diào)節(jié)和加工組織蛋白酶F的活性，防止內(nèi)源性半胱氨酸蛋白酶對寄生蟲造成傷害[18]； cystatin也發(fā)現(xiàn)存在于大片吸蟲雄蟲的睪丸、射精管及精液中，與射精和受精過程相關(guān)，這表明半胱氨酸蛋白酶抑制劑在大片吸蟲的生殖周期中有重要的調(diào)節(jié)作用[19]。

物種名稱后為該序列的GenBank登錄號GenBank accessing numbers were given after the species name圖2　Eg-cystatin基因系統(tǒng)進化樹(NJ樹)Fig.2　The phylogenetic (neighbor-joining) tree of Eg-cystatin

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1.加IPTG誘導大腸桿菌BL21表達重組Eg-cystatin；2.純化后的重組Eg-cystatin；3.重組Eg-cystatin與高免血清孵育；4. 重組Eg-cystatin與對照兔血清孵育；5. 重組Eg-cystatin與自然感染細粒棘球蚴的綿羊血清孵育；6. 重組Eg-cystatin與健康羊血清孵育；7.原頭蚴裂解液與兔重組Eg-cystatin高免血清孵育；8. 原頭蚴裂解液與對照兔血清孵育M. Protein molecular weight marker; 1. Lysate of IPTG-induced E. coli BL21 (DE3) expressing recombinant E. granulosus cystatin (rEg-cystatin); 2. Purified rEg-cystatin; 3. Purified rEg-cystatin probed with anti-rEg-cystatin rabbit serum; 4. Purified rEg-cystatin probed with native rabbit serum; 5. Purified rEg-cystatin probed with the serum of E. granulosus infected sheep; 6. Purified rEg-cystatin probed with native sheep serum; 7. Endogenous Eg-cystatin from protoscoleces (PSCs) probed with anti-Eg-cystatin rabbit serum; 8. The total protein extract of PSCs probed with native rabbit serum圖3　SDS-PAGE鑒定及Western blot分析Fig.3　SDS-PAGE and Western blot analysis

Teg. 表皮；IB. 蟲體內(nèi)部。標尺：50 μmTeg. Tegument; IB. Inner body. Scale bars: 50 μm圖4　Eg-cystatin蛋白在各時期蟲體上的免疫熒光定位Fig.4　Immunofluorescence localization of Eg-cystatin in different stages of E. granulosus

A.ELISA進行交叉反應分析；B. ELISA進行臨床試驗。實線代表cut-off值為0.427A. The cross-reaction of the iELISA; B. Clinical trial of the iELISA. The bold horizontal line indicates the cut-off value, which was 0.427圖5　重組Eg-cystatin間接ELISA分析Fig.5　Indirect ELISA using rEg-cystatin as the antigen

本研究從細粒棘球絳蟲中擴增出cystatin，并對其進行生物信息學的預測與分析，發(fā)現(xiàn)Eg-cystatin有信號肽，提示該蛋白很可能在細胞外實現(xiàn)其抑制半胱氨酸蛋白酶的活性，同時可能發(fā)揮重要的調(diào)控功能，這與先前報道的大多數(shù)cystatin家族蛋白屬于分泌蛋白結(jié)果相一致[20]。序列分析顯示Eg-cystatin包含典型的半胱氨酸蛋白酶抑制劑保守活性位點：(1)PW位點;(2)Q-X-V-X-G區(qū)域;(3)靠近N端的G位點。二級和三級結(jié)構(gòu)預測發(fā)現(xiàn)Eg-cystatin都具有保守的中心1個α-螺旋，周圍環(huán)繞5個反平行的β折疊的片層結(jié)構(gòu)區(qū)，這幾個保守結(jié)構(gòu)域共同構(gòu)成一個楔形結(jié)構(gòu)，與蛋白酶的活性位點結(jié)合，形成酶-抑制劑復合物從而發(fā)揮抑制活性。A. J. Guo[8]對蠕蟲的半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族進行了結(jié)構(gòu)域進化分析，結(jié)果顯示絳蟲的半胱氨酸蛋白酶抑制劑獨立形成一個分支，暗示絳蟲的cystatin可能在演化過程中已經(jīng)形成了一個新的進化支，這與本研究中進化樹分析的結(jié)果一致。以上結(jié)果均說明Eg-cystatin屬于cystatin家族，為深入了解Eg-cystatin的功能奠定了基礎(chǔ)。

本研究通過對Eg-cystatin進行免疫熒光定位，發(fā)現(xiàn)在成蟲和幼蟲時期均有表達，提示該基因與蟲體生命活動息息相關(guān)。絳蟲直接通過皮層吸收營養(yǎng)物質(zhì)[21]，Eg-cystatin定位于原頭蚴的表皮以及頂突鉤上，推測其可能與原頭蚴的營養(yǎng)物質(zhì)吸收有關(guān)。有研究報道cystatin在寄生蟲逃避宿主免疫應答和適應寄生生活中起著重要的作用[9-12]，由于原頭蚴入侵終末宿主后通過頂突上的鉤吸附在宿主腸壁上，因此原頭蚴可能通過分泌cystatin調(diào)節(jié)宿主的免疫反應而發(fā)揮免疫逃避作用。同時，宿主腸道內(nèi)含有大量的消化酶，免疫組化結(jié)果顯示cystatin在細粒棘球絳蟲的成蟲表皮及內(nèi)部均有廣泛分布，該蛋白質(zhì)可能與抑制宿主蛋白酶參與免疫反應及保護蟲體免受宿主消化酶的消化有關(guān)。

目前可用于家畜包蟲病免疫學診斷的抗原研究尚有限[22-24]，篩選敏感、特異、易于生產(chǎn)的診斷抗原是目前包蟲病防控的重點方向之一[22]。從包囊液提取的8-kDa抗原B具有很高的靈敏度和特異性(>90%)[25-26]，但是該天然抗原很難純化以及規(guī)?；拇罅可a(chǎn)[27]。而重組抗原具有特異性強、易純化和成本低等優(yōu)點[28]。目前已報道重組抗原Eg-DHFR、Eg-Grx1的特異性與敏感性較高，交叉反應率低，可作為診斷抗原候選[29-30]。同時也發(fā)現(xiàn)一些重組蛋白抗原的靈敏度與特異性較低，不適合作為診斷抗原[31-32]。雖然Eg-cystatin屬于分泌蛋白，但在本試驗中經(jīng)間接ELISA評估，其特異性為79.1%，敏感性為83.3%，同山羊細頸囊尾蚴病血清、綿羊細頸囊尾蚴病血清和綿羊腦包蟲病血清交叉反應率為68.2%。因此，提示rEg-cystatin蛋白不適合作為綿羊細粒棘球蚴病的診斷抗原。

4　結(jié)　論

原核表達細粒棘球絳蟲Eg-cystatin重組蛋白。該蛋白質(zhì)含有一個N端信號肽以及cystatin結(jié)構(gòu)域，是典型的2型半胱氨酸蛋白酶抑制劑，進化樹分析顯示Eg-cystatin屬于絳蟲cystatin Ⅱ型。該蛋白質(zhì)主要分布在原頭蚴的表皮和頂突鉤，生發(fā)層，成蟲蟲體內(nèi)部和蟲卵。間接ELISA評估Eg-cystatin蛋白不適合作為綿羊細粒棘球蚴病的診斷抗原候選。

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