體外法探究果寡糖對(duì)豬后腸微生物代謝苯丙氨酸和色氨酸的影響

慕春龍，馬梅蕾，何香玉，朱偉云

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物實(shí)驗(yàn)室，江蘇省消化道營(yíng)養(yǎng)與動(dòng)物健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095)

苯丙氨酸(Phe)和色氨酸(Trp)屬于芳香族氨基酸，是人和動(dòng)物體的必需氨基酸，對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育和新陳代謝都發(fā)揮著重要作用。此外，腸道共生的微生物具有利用苯丙氨酸和色氨酸的能力[1-2]。研究指出，日糧中大量苯丙氨酸和色氨酸能夠逃避小腸內(nèi)酶及腸液的消化到達(dá)結(jié)腸經(jīng)微生物代謝利用，產(chǎn)生苯乙酸、吲哚和3-甲基吲哚(糞臭素)等物質(zhì)[3]。其中，糞臭素能夠經(jīng)腸壁吸收進(jìn)入血液循環(huán)，一部分糞臭素儲(chǔ)存在脂肪和肌肉組織，影響豬肉品質(zhì)；另一部分經(jīng)肝代謝隨糞尿排到體外，嚴(yán)重污染環(huán)境[4]。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加果寡糖(Fructo-oligosaccharides，F(xiàn)OS)可以改變動(dòng)物腸道微生態(tài)區(qū)系和發(fā)酵模式，進(jìn)而影響吲哚和糞臭素的產(chǎn)生[5-6]。豬不同腸道部位微生物組成存在差異，回腸、盲腸和結(jié)腸中優(yōu)勢(shì)菌群不同[7-8]，然而關(guān)于后腸不同部位吲哚和糞臭素產(chǎn)生量的研究相對(duì)較少。

本試驗(yàn)研究了外源添加苯丙氨酸、色氨酸、果寡糖對(duì)后腸微生物發(fā)酵液中吲哚和糞臭素的影響，比較后腸微生物對(duì)其利用的差異。這為提高豬肉品質(zhì)，降低豬體外糞臭素污染和后腸氮營(yíng)養(yǎng)素利用提供參考數(shù)據(jù)和理論支持。

1　材料與方法

1.1　食糜接種物及厭氧培養(yǎng)液制備方法

回腸、盲腸和結(jié)腸的食糜樣品取自于4頭健康的杜×長(zhǎng)×大育肥豬。分別采集3個(gè)腸段的中段內(nèi)容物，混勻，稱量。用37 ℃預(yù)熱的滅菌磷酸鹽緩沖液9∶1進(jìn)行稀釋。將混合液經(jīng)四層無(wú)菌紗布濾過(guò)至充滿CO2的血清瓶中。厭氧培養(yǎng)基及其制備參考Z.L.Dai等[1]的方法，分裝82 mL至血清瓶，再加入1 mL果寡糖母液(0.5 和0.75 g·mL-1)，115 ℃滅菌15 min。氨基酸培養(yǎng)基需將10 mL氨基酸母液注入血清瓶中使終濃度為10 mmol·L-1。接種前將1 mL維生素溶液和1 mL還原劑溶液注入培養(yǎng)基，37 ℃預(yù)熱30 min。

1.2　試驗(yàn)設(shè)計(jì)

每種氨基酸均按3 × 3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，即分別添加0、0.5、0.75 g果寡糖和接種5 mL 腸道(回腸、盲腸、結(jié)腸)稀釋液于含有10 mmol·L-1單一氨基酸(Phe或Trp)37 ℃預(yù)熱的培養(yǎng)基中。每個(gè)處理組設(shè)置4個(gè)重復(fù)。將所有血清瓶置于37 ℃恒溫水浴鍋培養(yǎng)24 h。

1.3　豬后腸發(fā)酵液發(fā)酵指標(biāo)測(cè)定

體外培養(yǎng)24 h后冰水浴終止發(fā)酵，參照M.Weatherburn[9]的方法改進(jìn)后測(cè)定NH3-N濃度；參照H.P.S.Makkar等[10]改進(jìn)方法測(cè)定菌體蛋白MCP濃度；參照Z(yǔ).L.Dai等[11]方法測(cè)定氨基酸濃度。參照Y.X.Yang等[12]的方法測(cè)定吲哚和糞臭素的含量。

1.4　豬后腸發(fā)酵液總菌DNA的提取和Real-time PCR

參照W.Y.Zhu等[13]的方法，采用珠磨法(bead-beating)及酚-氯仿-異戊醇抽提發(fā)酵液樣品基因組DNA。根據(jù)S.E.Denman等[14]的方法采用Real-time PCR對(duì)發(fā)酵液樣品進(jìn)行總菌的絕對(duì)定量。

1.5　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

發(fā)酵指標(biāo)等試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2012整理后，利用SPSS 17.0 進(jìn)行多因素方差分析，用 Duncan法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以“平均值(Mean)”表示，以P<0.05作為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2　結(jié)　果

2.1　FOS對(duì)豬不同腸段發(fā)酵液中Phe和Trp降解率的影響

發(fā)酵液中Phe和Trp降解率變化如圖1。Phe發(fā)酵結(jié)果顯示，不同腸段細(xì)菌對(duì)于Phe的利用率不同，盲腸>結(jié)腸>回腸。不同F(xiàn)OS添加量對(duì)Phe的利用不同，在盲腸組中，添加0.75 g FOS可使發(fā)酵液中Phe降解率顯著低于0.5 g FOS組(P<0.05)。Trp發(fā)酵結(jié)果顯示，不同腸段細(xì)菌對(duì)于Trp的利用率不同，回腸>結(jié)腸和盲腸。不同F(xiàn)OS添加量對(duì)Trp的利用不同，在不同腸段發(fā)酵液中添加0.75 g FOS可使發(fā)酵液中Trp降解率顯著低于0和0.5 g FOS組(P<0.05)。統(tǒng)計(jì)分析表明，F(xiàn)OS和腸段對(duì)發(fā)酵液中Trp降解率存在顯著的交互作用(P<0.05)。

2.2　FOS對(duì)豬不同腸段發(fā)酵液中氨基酸發(fā)酵特性的影響

發(fā)酵液中NH3-N和MCP濃度變化見(jiàn)表1。Phe發(fā)酵結(jié)果顯示，F(xiàn)OS和腸段均顯著影響發(fā)酵液中NH3-N和MCP濃度，并有顯著交互作用(P<0.05)。FOS顯著降低回腸和結(jié)腸NH3-N濃度(P<0.05)，且結(jié)腸NH3-N減少量大于回腸；FOS可顯著升高盲腸和結(jié)腸MCP濃度(P<0.05)，且結(jié)腸MCP增加量大于盲腸。Trp發(fā)酵結(jié)果顯示，F(xiàn)OS和腸段均顯著影響發(fā)酵液中NH3-N和MCP濃度(P<0.05)。FOS顯著降低回腸和盲腸NH3-N濃度，而結(jié)腸NH3-N濃度顯著低于回腸和盲腸(P<0.05)；FOS顯著升高盲腸和結(jié)腸MCP濃度(P<0.05)，且盲腸MCP增加量大于結(jié)腸，在回腸組中添加0.5 g FOS可引起 MCP濃度上升。另外，F(xiàn)OS和腸段對(duì)Trp發(fā)酵液中MCP存在顯著交互作用(P<0.05)。

圖1　FOS對(duì)豬不同腸段發(fā)酵液中苯丙氨酸和色氨酸消失率的影響Fig.1　The effects of FOS on degradation rate of Phe and Trp in fermentation broths of pig different intestinal segments in vitro

2.3　FOS對(duì)豬不同腸段發(fā)酵液中吲哚和糞臭素濃度的影響

不同腸段發(fā)酵液中吲哚和糞臭素濃度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。Phe和Trp發(fā)酵中，回腸中均沒(méi)有糞臭素產(chǎn)生。Phe體外發(fā)酵中，所有腸段均沒(méi)有吲哚產(chǎn)生，僅盲腸和結(jié)腸有少量糞臭素產(chǎn)生，且FOS和腸段均顯著影響糞臭素濃度，F(xiàn)OS可顯著升高糞臭素濃度(P<0.05)，添加0.75 g FOS盲腸和結(jié)腸糞臭素濃度分別為 20.58 和83.13 mg·L-1。同時(shí)，所有處理中結(jié)腸糞臭素濃度均顯著高于盲腸(P<0.05)。Trp體外發(fā)酵中，F(xiàn)OS對(duì)發(fā)酵液中吲哚濃度變化影響顯著(P<0.05)，回腸吲哚濃度顯著高于盲腸和結(jié)腸(P<0.05)，其吲哚濃度可高達(dá)1 016.83 mg·L-1。FOS顯著降低發(fā)酵液中糞臭素濃度(P<0.05)，且結(jié)腸糞臭素濃度顯著低于盲腸(P<0.05)，添加0.75 g FOS可使發(fā)酵液中盲腸和結(jié)腸糞臭素濃度分別降低201.93和305.66 mg·L-1。綜合比較Phe和Trp發(fā)酵結(jié)果可知，F(xiàn)OS對(duì)糞臭素的產(chǎn)生存在劑量效應(yīng)。另外，F(xiàn)OS和腸段對(duì)發(fā)酵液中糞臭素濃度存在交互作用(P<0.05)。

表1FOS對(duì)豬不同腸段發(fā)酵液中氨氮、微生物蛋白、吲哚和糞臭素濃度的影響

Table1TheeffectsofFOSonconcentrationsofNH3-N,MCP,indoleandskatoleinfermentationbrothsofpigdifferentintestinalsegmentsinvitro

項(xiàng)目Item果寡糖/(g·mL-1)FOS氨氮/(mg·L-1)NH3-N微生物蛋白/(mg·L-1)MCP吲哚/(mg·L-1)Indole糞臭素/(mg·L-1)SkatolePheTrpPheTrpPheTrpPheTrp回腸Ileum01.952.1491.8494.61-1016.83--0.51.912.0997.55103.8-961.01--0.751.912.0595.3297.64-1051.27--盲腸Cecum01.992.17104.9590.50-773.6111.57502.040.51.982.01113.55116.50-796.549.25492.880.751.912.05118.23117.51-842.0120.58300.11結(jié)腸Colon01.981.95114.1489.61-783.6360.64533.120.51.791.82153.8699.79-797.2573.45425.570.751.781.84157.51102.38-751.2483.13227.46SEM0.0150.0214.211.745-22.327.3527.61P值P-value果寡糖FOS<0.01<0.01<0.01<0.01-<0.01<0.01<0.01腸段Segment<0.01<0.01<0.01<0.01-0.347<0.01<0.01果寡糖×腸段FOS×Segment0.0180.530<0.01<0.01-0.094<0.01<0.01

-. 該指標(biāo)含量未檢測(cè)到

-. No detection

2.4　FOS對(duì)豬不同腸段發(fā)酵液中總菌數(shù)量的影響

不同腸段發(fā)酵液中的總菌數(shù)量見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示， Phe體外發(fā)酵中，F(xiàn)OS對(duì)回腸總菌數(shù)量無(wú)顯著影響；不同劑量FOS處理引起盲腸中總菌數(shù)量先下降再升高，0.75 g FOS組顯著高于0.5和 0 g FOS組(P<0.05)；FOS能夠降低結(jié)腸總菌數(shù)量，0.75 和0.5 g FOS組顯著低于 0 g FOS組(P<0.05)。不添加FOS和添加0.5 g FOS處理組，發(fā)酵液中總菌數(shù)量存在如下關(guān)系：結(jié)腸>回腸>盲腸，添加0.75 g FOS處理組為結(jié)腸>盲腸>回腸。Trp發(fā)酵結(jié)果顯示，添加不同劑量FOS將引起回腸總菌數(shù)量先下降后上升，盲腸總菌數(shù)量不存在劑量效應(yīng)，添加0.5和0.75 g FOS使結(jié)腸總菌數(shù)量顯著升高(P<0.05)。無(wú)FOS添加時(shí)，發(fā)酵液中總菌數(shù)量存在如下關(guān)系：結(jié)腸>盲腸>回腸；添加不同劑量的FOS都將導(dǎo)致發(fā)酵液中總菌數(shù)量表現(xiàn)為：結(jié)腸>盲腸和回腸。

圖2　FOS對(duì)豬不同腸段發(fā)酵液中總菌數(shù)量的影響Fig.2　The effects of FOS on numbers of total bacteria in fermentation broths of pig different intestinal segments in vitro

3　討　論

3.1　果寡糖對(duì)豬不同腸段體外發(fā)酵液中Phe和Trp降解率的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，不同腸段細(xì)菌對(duì)于Phe的利用率不同，依次為盲腸>結(jié)腸>回腸，而不同腸段細(xì)菌對(duì)于Trp的利用率依次為回腸>結(jié)腸和盲腸。對(duì)Phe和Trp利用的這種差異，可能與不同腸段微生物組成不同有關(guān)。馬梅蕾等[15]發(fā)現(xiàn)，不同芳香族氨基酸的腸道代謝菌具有差異性，本結(jié)果與之相一致。Z.L.Dai等[1]基于16S rRNA基因的分子技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，小腸細(xì)菌利用及代謝氨基酸有一定的細(xì)菌種屬特異性，而Y.X.Yang等[2]發(fā)現(xiàn)，不同腸道區(qū)室微生物對(duì)氨基酸的代謝不同，這與本研究結(jié)果相一致。

后腸中的Phe和Trp可以被細(xì)菌代謝利用，使氨基酸的降解率降低。本研究發(fā)現(xiàn)，添加0.75 g FOS可使盲腸發(fā)酵液中Phe降解率顯著低于0.5 g FOS組。各腸段添加0.75 g FOS可使發(fā)酵液中Trp降解率顯著低于0 和0.5 g FOS組。這可能是由于添加碳水化合物后使后腸微生物減少對(duì)氨基酸的分解代謝，更多的用于合成菌體蛋白。L.P.Zhou等[16]和Y.Sun等[17]在豬日糧中添加抗性淀粉的研究中發(fā)現(xiàn)，后腸中可發(fā)酵碳水化合物增加，微生物對(duì)氨基酸的發(fā)酵降低，微生物的組成發(fā)生改變。R.Pieper等[18]在仔豬的研究中發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果，日糧中可發(fā)酵碳水化合物(非淀粉多糖、寡糖和FOS)等不能被胃和小腸消化酶分解，直接進(jìn)入大腸作為微生物發(fā)酵底物，從而降低后腸微生物發(fā)酵蛋白產(chǎn)生的毒性物質(zhì)，改變了菌群的發(fā)酵模式。羅玉衡等[19]在豬日糧中添加高水平豌豆纖維的研究發(fā)現(xiàn)，盲腸的微生物群落結(jié)構(gòu)組成改變，從而改變后腸的發(fā)酵方式。本研究表明，增加后腸可發(fā)酵碳水化合物，后腸微生物會(huì)更多趨向于利用碳水化合物，降低對(duì)Phe或Trp的發(fā)酵。

3.2　果寡糖對(duì)豬不同腸段體外發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的影響

飼料中含有一些消化率較低的蛋白質(zhì)飼料，由于不能被豬小腸消化，進(jìn)入后腸在微生物的發(fā)酵下產(chǎn)生一些有害的氣體或化合物。蛋白質(zhì)或含氮化合物在大腸中被細(xì)菌發(fā)酵，產(chǎn)生氨氮、MCP、吲哚等代謝產(chǎn)物[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OS可以顯著降低Phe(回腸和結(jié)腸)組、Trp(回腸和盲腸)組發(fā)酵液中NH3-N濃度，且Trp(回腸和盲腸)組存在劑量效應(yīng)。其原因可能是添加FOS使得C和N平衡，促進(jìn)腸道細(xì)菌合成菌體蛋白，減少NH3-N的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，添加FOS可顯著升高盲腸和結(jié)腸發(fā)酵液中MCP濃度。這一結(jié)果說(shuō)明FOS可以促進(jìn)盲腸和結(jié)腸細(xì)菌利用Phe和Trp合成菌體蛋白，且不受FOS添加量的影響。綜合比較發(fā)酵液中NH3-N和MCP測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OS對(duì)NH3-N與MCP的影響作用具有腸段差異性。且添加0.5 g FOS可使Phe和Trp更多的合成菌體蛋白。

吲哚和糞臭素是豬后腸微生物降解色氨酸的主要代謝產(chǎn)物。本研究發(fā)現(xiàn)，在Trp體外發(fā)酵液中FOS能夠降低盲腸組和結(jié)腸組發(fā)酵液中糞臭素濃度，且存在劑量效應(yīng)，這與前人的研究結(jié)果相一致[5]。同時(shí)添加FOS還可以促進(jìn)發(fā)酵液中吲哚的生成。但是，在本研究中發(fā)酵液中吲哚濃度不受FOS添加的影響，其原因可能是Trp可利用量較高。本研究中Trp添加量為10 mmol·L-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以往體外試驗(yàn)中250 μmol·L-1Trp添加量[1]。色氨酸在大腸桿菌和梭菌的參與下生成吲哚-3-乙酸，然后經(jīng)過(guò)梭菌和乳酸桿菌轉(zhuǎn)化生成糞臭素[21-22]。因此，本研究中FOS可能抑制了吲哚-3-乙酸的脫羧作用和色氨酸的降解，減少了糞臭素的生成，對(duì)吲哚生成途徑無(wú)調(diào)控作用。這與前人在動(dòng)物日糧中添加發(fā)酵型碳水化合物減少動(dòng)物腸道中色氨酸降解的結(jié)果相一致[23]。Phe體外發(fā)酵中僅盲腸和結(jié)腸有少量糞臭素生成，且FOS促進(jìn)了糞臭素的形成。其原因可能是腸道中大量微生物能夠利用FOS發(fā)酵產(chǎn)生SCFA等為微生物提供能量，使得微生物有較多的碳源用于合成Trp，進(jìn)而導(dǎo)致Phe發(fā)酵中糞臭素的產(chǎn)生。因此可知，本研究中Phe和Trp發(fā)酵產(chǎn)生糞臭素的機(jī)理存在差異。另外，本研究發(fā)現(xiàn)Phe和Trp發(fā)酵中回腸均沒(méi)有糞臭素產(chǎn)生，僅Trp(回腸)組中有大量吲哚生成，這可能是由于回腸中不存在色氨酸及糞臭素產(chǎn)生菌。

3.3　果寡糖對(duì)豬不同腸段發(fā)酵液中總菌數(shù)量的影響

有研究表明，F(xiàn)OS能顯著提高糞樣中菌群多樣性[24-26]。本研究中，F(xiàn)OS對(duì)不同腸段微生物體外發(fā)酵液中總菌數(shù)量的影響顯著，其原因可能與不同腸段內(nèi)微生物種類及數(shù)量不同有關(guān)。FOS添加量及腸段微生物菌落結(jié)構(gòu)的差異引起組間總菌數(shù)量上的差異。Phe發(fā)酵試驗(yàn)組中，F(xiàn)OS顯著降低結(jié)腸總菌數(shù)量。有研究報(bào)道，葡萄糖和FOS作為不同碳源類型影響氨基酸向菌體生成或代謝利用的轉(zhuǎn)化[27]。隨著腸段后移葡萄糖可利用量也逐漸降低，導(dǎo)致FOS添加后細(xì)菌總菌數(shù)量降低。Trp發(fā)酵過(guò)程中，F(xiàn)OS顯著升高結(jié)腸總菌數(shù)量，這和以往研究結(jié)果相一致[28]。添加FOS降低發(fā)酵液中糞臭素含量，減少糞臭素對(duì)微生物菌群的危害作用，進(jìn)而引起結(jié)腸總菌數(shù)量的增加。但是，隨著FOS添加量的上升，回腸總菌數(shù)量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，這可能是由于添加FOS影響了發(fā)酵液中C、N比例，并且改變了腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，引起細(xì)菌發(fā)酵類型改變，最終導(dǎo)致組間總菌數(shù)量的差異。

4　結(jié)　論

本研究表明，后腸添加可發(fā)酵果寡糖，后腸微生物會(huì)更趨向于利用果寡糖，降低對(duì)Phe或Trp的發(fā)酵。果寡糖能夠降低糞臭素的產(chǎn)生量, 卻對(duì)吲哚產(chǎn)生沒(méi)有影響，提示其可降低色氨酸向糞臭素的轉(zhuǎn)化；外源添加果寡糖對(duì)苯丙氨酸和色氨酸發(fā)酵特性的影響不同。

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