KDM2B基因克隆及其在牦牛組織和卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中的表達(dá)研究

蔡雯祎，熊顯榮，陳　通，楊顯英，韓　杰，阿果約達(dá)，李　鍵

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

組蛋白修飾主要包括甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化和類泛素化修飾[1]，這些修飾作用影響了染色質(zhì)構(gòu)象并調(diào)控目的基因表達(dá)，還參與了調(diào)控發(fā)育和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)等細(xì)胞學(xué)進(jìn)程[2-3]。甲基化修飾是組蛋白共價(jià)修飾中最穩(wěn)定的，2004年第1個(gè)組蛋白的去甲基化酶LSD1 (Lysine specific demethylase 1)被發(fā)現(xiàn)前，組蛋白的甲基化一直被認(rèn)為是不可逆的[4]。之后組蛋白去甲基化酶陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，根據(jù)其酶活性功能基團(tuán)的差異可以分為兩大類：含Amino oxidase結(jié)構(gòu)域的賴氨酸特異性去甲基化酶(Lysine specific demethylase，LSD)家族與含Jumonji特征結(jié)構(gòu)域(Jumonji C domain，JmjC)的組蛋白去甲基化酶(Jumonji C domain containing histone demethylase, JHDM)家族。

JHDM1B也稱FBXL10，現(xiàn)在統(tǒng)一稱為KDM2B (Lysine-specific histone demethylase 2B)，屬于包含JmjC結(jié)構(gòu)域的去甲基化酶亞家族。Y.I.Tsukada等[5]通過甲基化酶生化分析和質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)是H3K36的去甲基化酶，后來又發(fā)現(xiàn)其不僅僅是H3K36me1/2的去甲基化酶也是H3K4me3的去甲基化酶[6-7]，而且在發(fā)育和疾病的發(fā)生中具有重要作用。KDM2B在人的胰腺癌中高表達(dá)，它通過分離轉(zhuǎn)錄抑制和激活程序控制腫瘤的發(fā)生[8]。KDM2B受Oct4與Sox2的直接調(diào)控，在小鼠胚胎干細(xì)胞中招募多梳抑制復(fù)合體的核心組件，并通過CXXC結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)與CPG島的形成抑制分化相關(guān)基因的表達(dá)[9]。KDM2B在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中通過抑制p19ARF、p15lnk4b和p16Ink4a3個(gè)基因位點(diǎn)來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和衰老[10]。KDM2B能夠與重編程關(guān)鍵基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄，在誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的重編程早期發(fā)揮功能，提高誘導(dǎo)效率[11]。在斑馬魚上的研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)胚胎中KDM2B 的水平可以減緩幼體出生后眼睛殘缺(Ocular coloboma)、心缺陷(Heart defects)、鼻孔閉鎖(Atresia of the choanae)、生長和發(fā)育遲緩(Reta-rdation of growth and development)、生殖器畸形(Genital anomalies)和耳朵畸形或耳聾(Ear malformations/deaf-ness)的CHARGE綜合癥狀[12]。T.Fukuda等[13]發(fā)現(xiàn)，在KDM2B敲除的小鼠中細(xì)胞的增殖和凋亡異常，會(huì)導(dǎo)致早期胚胎在神經(jīng)、腦、視網(wǎng)膜和尾巴等方面的發(fā)育缺陷。L.Lu等[14]在非洲爪蛙上也發(fā)現(xiàn)，敲除KDM2B后胚胎出現(xiàn)頭部結(jié)構(gòu)的萎縮和后部結(jié)構(gòu)的喪失，而且KDM2B通過調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路中β-Catenin的穩(wěn)定性來調(diào)控非洲爪蛙胚胎形成過程中前后體軸的形成。綜上，KDM2B對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、分化、衰老、腫瘤的形成以及胚胎的發(fā)育等都起到調(diào)控作用[15]。

牦牛是青藏高原地區(qū)的主要畜種，有“高原之舟”的美譽(yù)，但其繁殖力較低，大部分為兩年一胎或三年兩胎。目前還未見關(guān)于KDM2B基因在牦牛上的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)以牦牛卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體為研究對(duì)象，通過RT-PCR克隆得到KDM2B基因的序列，進(jìn)行生物信息學(xué)分析。并用qRT-PCR檢測KDM2B分別在不同時(shí)期卵母細(xì)胞及其對(duì)應(yīng)卵丘細(xì)胞中的表達(dá)水平，旨在為進(jìn)一步研究牦牛KDM2B基因功能及其在生理生殖過程中所發(fā)揮的作用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)樣品的采集

所有樣本均采自成都市青白江屠宰場，牦牛被屠宰后，迅速用無菌剪刀采集腦、小腸、腎、肺、脾、肝、心、胃、睪丸、肌肉、子宮和卵巢12種組織。無菌生理鹽水清洗，剪成小塊裝入凍存管，并在液氮中保存?zhèn)溆?。另外選擇3～5歲、體質(zhì)良好、體型相似的且處于非黃體期的健康雌性牦牛采集卵巢，沖洗后，放入含有雙抗的25 ℃生理鹽水中，在保溫壺中保存，并于2 h內(nèi)，送回實(shí)驗(yàn)室。

1.2　卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(Cumulus-oocyte complex，COCs)的收集與培養(yǎng)

加有雙抗的生理鹽水預(yù)熱后，沖洗牦牛卵巢3遍，選擇卵巢上直徑為3～8 mm的卵泡，用10 mL的一次性注射器(帶12號(hào)針頭)抽取卵泡液，置于90 mm的平皿中，輕輕搖勻，在體視顯微鏡下，收集COCs。挑選卵丘顆粒細(xì)胞3層以上、卵母細(xì)胞質(zhì)均勻且結(jié)構(gòu)致密，用卵母細(xì)胞成熟液清洗3次后，置于含3 mL成熟液的培養(yǎng)皿中，每個(gè)平皿放30個(gè)COCs，在含5.5%的CO2,38.5 ℃濕度飽和的培養(yǎng)箱中體外成熟培養(yǎng)。從卵巢取出來的卵丘細(xì)胞包裹緊密的COCs處于GV期，成熟12 h后，卵丘細(xì)胞松散處于MI期，成熟24 h后，能觀察到第一極體的排除，處于MII期。因此，分別在0、12和24 h獲得GV、MI和MII期3個(gè)時(shí)期的COCs，用0.5%透明質(zhì)酸酶將卵母細(xì)胞和卵丘顆粒細(xì)胞分離，進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3　試劑與培養(yǎng)液的配置

Trizol購自Invitrogen公司，DEPC購自天根生化科技有限公司，Single Cell-to-CTTM試劑盒購自Invitrogen公司，PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Premix TapTMDNA聚合酶、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒、pMD-19T載體、DNA Marker均購自TaKaRa公司，DNA膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司，胎牛血清(FBS)、Medium1培養(yǎng)基購自Gibco公司，促黃體素(LH)、促卵泡素(FSH)、雌二醇、丙酮酸鈉、谷氨酰胺購自Sigma公司，石蠟油購自Vitrolife公司，地衣紅購自上海源葉生物，其他無特殊說明的試劑均為國產(chǎn)分析純。卵母細(xì)胞成熟液：M199+10% FBS+0.01 μg·L-1FSH+0.01 μg·L-1LH+0.001 μg·L-1E2+0.02 ng·L-1EGF。

1.4　總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

根據(jù)Trizol法提取各個(gè)組織的總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測濃度和OD值。質(zhì)量符合要求的RNA樣品，按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，用GAPDH基因的特異性引物檢測cDNA的質(zhì)量，電泳出現(xiàn)亮條帶的cDNA放在-20 ℃保存?zhèn)溆?。將分離得到的不同時(shí)期的卵丘顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞,按照Single Cell-to-CTTM試劑盒說明書直接合成cDNA，-20 ℃保存。

1.5　引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中普通牛KDM2B基因的mRNA序列(登錄號(hào)：XM_019977355.1)和GAPDH基因mRNA序列(登錄號(hào)：AC_000162.1)，利用Primer5.0軟件分別設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物(表1)。同時(shí)用NCBI中Primer-BLAST在線比對(duì)工具檢測引物的質(zhì)量，引物由生工生物工程股份有限公司合成。

表1引物序列及其反應(yīng)條件

Table1Primersequencesandreactionconditions

引物名稱Primersymbol引物序列(5'-3')Primersequence退火溫度/℃Tm產(chǎn)物長度/bpProductsizeKDM2B-CF:CCCACAACTGCTGAAAATR:GAGCAATGGTCCAGAAAGCA58.54259KDM2B-QF:CAGACGGAAGCCACGAATR:CAGCACCCACTCCTCATACA60207GAPDH-QF:TGCTGGTGCTGAGTAGTTGGTGR:TCTTCTGGGTGGCAGTGATGG60290

KDM2B-C.克隆引物；KDM2B-Q和GAPDH-Q.定量引物。F.正向引物；R.反向引物

KDM2B-C. The cloning primer; KDM2B-Q and GAPDH-Q.The quantitative primers. F.Sense primer; R.Antisense primer

1.6　KDM2B基因的克隆測序

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL：2×LA Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，模板1 μL，補(bǔ)ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性20 s，58.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸4 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸7 min，最后4 ℃保存。15 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，紫外光下切目的條帶按照膠回收試劑盒說明書回收目的DNA。膠回收產(chǎn)物與PMD-19T載體16 ℃連接10 h，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中。將菌液均勻接種在含有100 μg·mL-1氨芐的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑取單菌落在搖床震蕩培養(yǎng)8 h，PCR篩選陽性克隆送交生工(上海)生物工程股份有限公司測序。

1.7　KDM2B蛋白生物信息學(xué)分析

NCBI中ORF Finder分析KDM2B序列的開放閱讀框，BLAST在線工具進(jìn)行同源性比較， Protparam和ProtScale預(yù)測牦牛KDM2B蛋白的基本理化性質(zhì)和親疏水性，PredictProtein和SWISS-MODEL預(yù)測KDM2B的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.8　KDM2B基因組織表達(dá)譜分析

以GAPDH為參照，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測KDM2B基因在牦牛腦、小腸、腎、肺、脾、肝、心、胃、睪丸、肌肉、子宮和卵巢中的表達(dá)。qRT-PCR反應(yīng)體系：SYBR-Premix Ex TaqTMⅡ 7.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，補(bǔ)ddH2O至15 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.9　KDM2B基因在牦牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中的表達(dá)規(guī)律

qRT-PCR檢測KDM2B基因在牦牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的3個(gè)不同階段(GV、MI、MII期)及其相應(yīng)卵丘顆粒細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律。qRT-PCR反應(yīng)體系同1.8，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.10　數(shù)據(jù)分析

2-△△Ct法對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果進(jìn)行均一化處理，SPASS軟件進(jìn)行方差分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，Duncan法對(duì)各組織間的mRNA表達(dá)量進(jìn)行多重比較。

2　結(jié)　果

2.1　牦牛KDM2B基因的克隆及序列分析

以牦牛卵巢組織的總RNA為模板，利用RT-PCR對(duì)KDM2B基因的CDS區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，測序獲得4 259 bp的核苷酸序列(圖略)，開放閱讀框?yàn)? 930 bp，共編碼1 309個(gè)氨基酸。

目前GenBank中已經(jīng)測定的KDM2B基因序列僅有3種：人、小鼠和褐家鼠，其他動(dòng)物的KDM2B基因均為預(yù)測序列。將克隆得到的牦牛KDM2B基因與黃牛(Bostaurus)、野牦牛(Bosmutus)、豬(Susscrofa)、綿羊(Ovisaries)、山羊(Caprahircus)、人(Homosapiens)、黑猩猩(Panpaniscus)、小鼠(Musmusculus)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)、駱駝(Camelusdromedarius)、貓(Feliscatus)、原雞(Gallusgallus)和斑馬魚(Daniorerio)的KDM2B基因進(jìn)行相似性比對(duì)，結(jié)果見表2。與其他哺乳動(dòng)物相比，克隆得到的KDM2B基因的核苷酸序列的相似性達(dá)到90%以上，其中與人、小鼠和褐家鼠的相似性分別為92%、89%和90%；氨基酸序列相似性大都95%以上，其中與人、小鼠和褐家鼠的相似性都為96%。由此可見，KDM2B基因在進(jìn)化過程中相對(duì)保守，而且堿基突變多為同義突變。

表2牦牛KDM2B基因與其他物種的相似性比對(duì)

Table 2　Alignment of yak KDM2B gene with the corresponding sequences of various species %

2.2　牦牛KDM2B蛋白結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測

ExPASy在線工具分析牦牛KDM2B蛋白的理化性質(zhì)，該蛋白分子量為149 737.23，分子式為C6556H10474N1894O1971S74。脂肪族系數(shù)為71.40，半衰期為30 h，等電點(diǎn)為8.63，不穩(wěn)定系數(shù)為64.01，推測該蛋白為堿性不穩(wěn)定蛋白。KDM2B蛋白包含20種氨基酸，出現(xiàn)頻率較高的有Leu(9.3%)、Glu(9.2%)、Lys(8.0%)、Ser(7.9%)和Arg(7.7%)。其中帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)有206個(gè)，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)有187個(gè)，所以KDM2B蛋白整體上帶正電。

Signal P和TM pred分析發(fā)現(xiàn)，牦牛KDM2B蛋白為不含跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽的非分泌蛋白。親疏水性分析發(fā)現(xiàn)，牦牛KDM2B蛋白存在293、294、295、296位點(diǎn)存在最小親水指數(shù)-3.544，在539位點(diǎn)達(dá)到最大疏水指數(shù)2.222，平均親水指數(shù)為-0.728。牦牛KDM2B蛋白修飾預(yù)測發(fā)現(xiàn)，磷酸化位點(diǎn)有126個(gè)，包含79個(gè)Ser，39個(gè)Thr和8個(gè)Tyr；N-糖基化位點(diǎn)有3個(gè)；O-糖基化位點(diǎn)有84個(gè)，且閾值均在0.5以上。

牦牛KDM2B基因包括幾個(gè)主要的功能結(jié)構(gòu)域：JmjC功能域，CXXC型鋅指結(jié)構(gòu)域和PHD型的鋅指結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)-Box功能域和8個(gè)LRR(Leucine-rich repeat)重復(fù)序列(圖1)。KDM2B 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白的α-螺旋占35.14%，β-轉(zhuǎn)角占6.95%，延伸鏈占14.36%，無規(guī)卷曲占43.54%，同時(shí)，KDM2B蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步驗(yàn)證了二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(圖2)。

圖1　KDM2B蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.1　The predicted domain of yak KDM2B protein

圖2　KDM2B蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2　The predicted tertiary structure of yak KDM2B protein

2.3　牦牛KDM2B基因的組織表達(dá)譜

KDM2B基因在牦牛腦、小腸、腎、肺、脾、肝、心、胃、睪丸、肌肉、子宮和卵巢組織中的表達(dá)譜如圖3所示，結(jié)果表明，牦牛KDM2B基因在各個(gè)組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量存在一定的差異，在脾、子宮、睪丸和卵巢中表達(dá)量較高，且與其他組織比差異極顯著(P<0.01)，而在胃、腦、肌肉中表達(dá)量較低。

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同大寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同Different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01),the same capital letter mean no significant difference (P>0.05).The same as below圖3　KDM2B基因組織表達(dá)水平Fig.3　Tissues expression levels of yak KDM2B gene

2.4　KDM2B在牦牛卵母細(xì)胞不同成熟階段的表達(dá)

以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，用qRT-PCR方法分別檢測KDM2B基因在牦牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的不同時(shí)期及其相應(yīng)卵丘顆粒細(xì)胞中的表達(dá)情況(圖4)。在卵母細(xì)胞中GV期和MII期KDM2B的表達(dá)水平相差不大(P>0.05)，而MI期的表達(dá)水平極顯著高于這兩個(gè)時(shí)期(P<0.01)。在卵丘顆粒細(xì)胞中KDM2B的表達(dá)水平隨成熟時(shí)間的進(jìn)行而極顯著增加(P<0.01)。

圖4　KDM2B基因在牦牛卵母細(xì)胞(A)和卵丘顆粒細(xì)胞(B)減數(shù)分裂不同階段的表達(dá)Fig.4　The expression of KDM2B in different stages during meiosis of the oocyte (A)and the cumulus cells(B) in yak

3　討　論

組蛋白修飾介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控對(duì)哺乳動(dòng)物的胚胎發(fā)育有至關(guān)重要的作用，其中組蛋白的甲基化修飾方式是最穩(wěn)定的。組蛋白的甲基化可以發(fā)生在精氨酸和賴氨酸的側(cè)鏈，每個(gè)殘基上的氨基氮都可以發(fā)生一次或多次的甲基化。組蛋白H3上特異性賴氨酸殘基的甲基化位點(diǎn)參與了多數(shù)基因的調(diào)節(jié)，包括一些與發(fā)育和分化相關(guān)的基因，如H3K4和H3K36上的甲基化與轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)，H3K9和H3K27上的甲基化與基因沉默相關(guān)[16-17]。組蛋白去甲基化酶的發(fā)現(xiàn)推翻了組蛋白甲基化是單向發(fā)展的理論，這為人們解開了很多細(xì)胞內(nèi)無法解釋的難題。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)組蛋白去甲基化酶家族成員有27個(gè)，其中KDM2B對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、分化、衰老、腫瘤的形成以及胚胎的發(fā)育等都起到調(diào)控作用。本研究在克隆牦牛KDM2B基因序列的基礎(chǔ)上，檢測其在不同組織中的表達(dá)，并研究其在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中的表達(dá)規(guī)律，為KDM2B的功能研究提供了試驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為提高牦牛的胚胎質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

目前GenBank中已經(jīng)測定的KDM2B基因序列僅有3個(gè)：人、小鼠和褐家鼠，其他動(dòng)物的KDM2B基因均為預(yù)測序列，而且不管是已確定的序列還是預(yù)測序列都有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本。在人上有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，分為長型和短型，長型與短型相比在5′端多出90 bp，在2 450 bp后多出114 bp。在黃牛上有8個(gè)預(yù)測轉(zhuǎn)錄本，在牦牛上有1個(gè)預(yù)測轉(zhuǎn)錄本，而本研究中只獲得了1條牦牛轉(zhuǎn)錄本?，F(xiàn)在還不清楚牦牛上是否有其他轉(zhuǎn)錄本的存在，而轉(zhuǎn)錄本的差異也導(dǎo)致了牦牛基因與其他物種基因相似性和蛋白結(jié)構(gòu)上的差異[18]。筆者克隆得到的牦牛KDM2B序列要比GenBank中預(yù)測的牦牛序列長一些，可能是長型與短型的區(qū)別，由此導(dǎo)致了蛋白上的差異，因此，還需后續(xù)研究進(jìn)一步驗(yàn)證牦牛上KDM2B基因是否還存在其他轉(zhuǎn)錄本。但從結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)5個(gè)主要功能結(jié)構(gòu)域：JmjC功能域(和組蛋白去甲基化酶活性有關(guān))：CXXC型的鋅指結(jié)構(gòu)域(結(jié)合DNA)，PHD型的鋅指結(jié)構(gòu)域(結(jié)合DNA)，F(xiàn)-Box功能域(結(jié)合蛋白質(zhì))和LRR重復(fù)序列都存在，說明這些主要功能域在不同的物種間是高度保守的[13,19]。而且同源性分析發(fā)現(xiàn)，該基因與黃牛和野牦牛的同源性最高，表明，牦牛KDM2B基因在進(jìn)化過程中具有較高的保守性。

組織表達(dá)譜的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牦牛KDM2B基因在脾和睪丸中的表達(dá)量較高，與R.Pfau等[20]的研究結(jié)果一致，還發(fā)現(xiàn)在子宮和卵巢中表達(dá)量也較高，而在胃、腦、肌肉中表達(dá)量最低。表觀遺傳學(xué)的變化被認(rèn)為是癌癥細(xì)胞的顯著特征之一[21-22]，KDM2B由于其有效的抑癌作用被用作不同疾病的新的治療靶點(diǎn)，包括造血細(xì)胞腫瘤[23]和胃癌[24]等。脾是全身最大的免疫器官，KDM2B在脾中高表達(dá)說明其抑癌作用可能與機(jī)體的免疫系統(tǒng)有關(guān)系，該問題有待進(jìn)一步的研究。在KDM2B缺失的細(xì)胞中KDM5A的表達(dá)量會(huì)顯著下降，并發(fā)現(xiàn)了一條KDM2B-KDM5A/Myc的調(diào)控通路[7]，而KDM5A與生殖息息相關(guān)[25]，通常只在生殖器官中表達(dá)。

KDM2B在胚胎發(fā)育過程中起至關(guān)重要的作用，一旦缺失會(huì)導(dǎo)致早期胚胎在神經(jīng)、腦、視網(wǎng)膜和尾巴等方面的發(fā)育缺陷[13]。在雌性胚胎中KDM2B的缺失會(huì)導(dǎo)致X染色體相關(guān)基因表達(dá)的減少以及常染色體基因的異常表達(dá)[26]。胚胎是由卵母細(xì)胞受精而成，而敲除KDM2B的雄性小鼠附睪的精子數(shù)量顯著降低[13]，之后M.Ozawa等[27]發(fā)現(xiàn)，KDM2B在長期可持續(xù)的精子發(fā)生中通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期起重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，KDM2B在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的不同時(shí)期都有表達(dá)，且主要在細(xì)胞核中表達(dá)。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)KDM2B在MI期顯著高于GV期和MII期的表達(dá)水平，這可能與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中的兩次分裂阻滯有關(guān)。在體內(nèi)環(huán)境下，減數(shù)分裂從雙線期停滯恢復(fù)是由促性腺激素LH啟動(dòng)的[28]。在LH的刺激下，壁顆粒細(xì)胞中cAMP水平上升，PKA和PKC通路被激活，合成大量的EGF樣因子，這些EGF樣因子激活卵丘細(xì)胞中MAPK的活性，促進(jìn)減數(shù)分裂恢復(fù)后的細(xì)胞進(jìn)程[29]。卵丘細(xì)胞中活化的MAPK通過磷酸化CX43導(dǎo)致間隙連接關(guān)閉，打斷卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間的聯(lián)系[30]，使體細(xì)胞中的抑制因子無法進(jìn)入卵母細(xì)胞，從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的下降，進(jìn)入第二次減數(shù)分裂中期停滯。KDM2B與cAMP在卵母細(xì)胞中的表達(dá)模式相一致，由此推測KDM2B可能參與了卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂過程，這需要進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證。

4　結(jié)　論

本試驗(yàn)成功克隆了牦牛KDM2B基因序列，與牦牛已有預(yù)測序列相比，屬于長型轉(zhuǎn)錄本；生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CDS區(qū)的保守性較強(qiáng)；在脾、子宮、睪丸和卵巢中的表達(dá)量較高，而在胃、腦、肌肉中的表達(dá)量較低。為KDM2B基因在牦牛繁殖調(diào)控中的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。在卵母細(xì)胞中GV期和MII期KDM2B的表達(dá)水平相差不大(P>0.05)，而MI期的表達(dá)水平極顯著高于GV期和MII期(P<0.01)。在卵丘細(xì)胞中KDM2B的表達(dá)水平隨成熟時(shí)間的進(jìn)行而極顯著增加(P<0.01)。這可能與減數(shù)分裂過程中的兩次分裂阻滯有關(guān)，為進(jìn)一步研究牦牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂機(jī)制及改善牦牛繁殖效率提供基礎(chǔ)資料。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]KOOISTRA S M, HELIN K. Molecular mechanisms and potential functions of histone demethylases[J].NatRevMolCellBiol, 2012, 13(5): 297-311.

[2]KIMWA H, SATO Y, ZHANG J, et al. Histone modification sensors in living cells[J].GeophysJInt, 2015(1): 201-202.

[3]LI C W, GUO S S, ZHANG M, et al. DNA methylation and histone modification patterns during the late embryonic and early postnatal development of chickens[J].PoultSci, 2015, 94(4): 706-721.

[4]SHI Y J, LAN F, MATSON C, et al. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1[J].Cell, 2004, 119(7): 941-953.

[5]TSUKADA Y I, FANG J, ERDJUMENT-BROMAGE H, et al. Histone demethylation by a family of JmjC domain-containing proteins[J].Nature, 2006, 439(7078): 811-816.

[6]JANZER A, STAMM K, BECKER A, et al. The H3K4me3 histone demethylase Fbxl10 is a regulator of chemokine expression, cellular morphology, and the metabolome of fibroblasts[J].JBiolChem, 2012, 287(37): 30984-30992.

[7]TZATSOS A, PASKALEVA P, LYMPERI S, et al. Lysine-specific Demethylase 2B (KDM2B)-let-7-Enhancer of Zester Homolog 2 (EZH2) pathway regulates cell cycle progression and senescence in primary cells[J].JBiolChem, 2011, 286(38): 33061-33069.

[8]TZATSOS A, PASKALEVA P, FERRARI F, et al. KDM2B promotes pancreatic cancer via Polycomb-dependent and-independent transcriptional programs[J].JClinInvest, 2013, 123(2): 727-739.

[9]HE J, SHEN L, WAN M, et al. KDM2B maintains murine embryonic stem cell status by recruiting PRC1 complex to CpG islands of developmental genes[J].NatCellBiol, 2013, 15(4): 373-384.

[10]KOTTAKIS F, POLYTARCHOU C, FOLTOPOULOU P, et al. FGF-2 regulates cell proliferation, migration, and angiogenesis through an NDY1/KDM2B-miR-101-EZH2 pathway[J].MolCell, 2011, 43(2): 285-298.

[11]LIANG G Y, HE J, ZHANG Y. KDM2B promotes induced pluripotent stem cell generation by facilitating gene activation early in reprogramming[J].NatCellBiol, 2012, 14(5): 457-466.

[12]BALOW S A, PIERCE L X, ZENTNER G E, et al. Knockdown offbxl10/kdm2bbrescueschd7 morphant phenotype in a zebrafish model of CHARGE syndrome[J].DevBiol, 2013, 382(1): 57-69.

[13]FUKUDA T, TOKUNAGA A, SAKAMOTO R, et al. Fbxl10/Kdm2b deficiency accelerates neural progenitor cell death and leads to exencephaly[J].MolCellNeurosci, 2011, 46(3): 614-624.

[14]LU L, GAO Y, ZHANG Z, et al. Kdm2a/b lysine demethylases regulate canonical Wnt signaling by modulating the stability of nuclear β-catenin[J].DevCell, 2015, 33(6): 660-674.

[15]DAVID G. Regulation of oncogene-induced cell cycle exit and senescence by chromatin modifiers[J].CancerBiolTher, 2012, 13(11): 992-1000.

[16]BERGER S L. The complex language of chromatin regulation during transcription[J].Nature, 2007, 447(7143): 407-412.

[17]LI B, CAREY M, WORLANAN J L. The role of chromatin during transcription[J].Cell, 2007, 128(4): 707-719.

[18]朱江江, 林亞秋, 左璐璐, 等. 牦牛KLF5、KLF6、KLF7基因的克隆表達(dá)及其與肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)性分析[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2017, 48(3): 416-424.

ZHU J J, LIN Y Q, ZUO L L, et al. Molecular cloning, tissue expression ofKLF5,KLF6,KLF7 genes, and their correlations with intramuscular fat content in yak[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2017, 48(3): 416-424. (in Chinese)

[19]WANG T, CHEN K S, ZENG X M, et al. The histone demethylases Jhdm1a/1b enhance somatic cell reprogramming in a vitamin-C-dependent manner[J].CellStemCell, 2011, 9(6): 575-587.

[20]PFAU R, TZATSOS A, KAMPRANIS S C, et al. Members of a family of JmjC domain-containing oncoproteins immortalize embryonic fibroblasts via a JmjC domain-dependent process[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2008, 105(6): 1907-1912.

[21]SHEN H, LAIRD P W. Interplay between the cancer genome and epigenome[J].Cell, 2013, 153(1): 38-55.

[23]ANDRICOVICH J, KAI Y, PENG W Q, et al. Histone demethylase KDM2B regulates lineage commitment in normal and malignant hematopoiesis[J].JClinInvest, 2016, 126(3): 905-920.

[24]ZHAO E H, TANG C L, JIANG X L, et al. Inhibition of cell proliferation and induction of autophagy by KDM2B/FBXL10 knockdown in gastric cancer cells[J].CellSignal, 2017, 36: 222-229.

[25]NAVARRO-COSTA P, MCCARTHY A, PRUDNCIO P, et al. Early programming of the oocyte epigenome temporally controls late prophase I transcription and chromatin remodelling[J].NatCommun, 2016, 7: 12331.

[26]BOULARD M, EDWARD J, BESTOR T H, et al. Abnormal X chromosome inactivation and sex-specific gene dysregulation after ablation of FBXL10[J].EpigeneticsChromatin, 2016, 9: 22.

[27]OZAWA M, FUKUDA T, SAKAMOTO R, et al. The histone demethylase FBXL10 regulates the proliferation of spermatogonia and ensures long-term sustainable spermatogenesis in mice[J].BiolReprod, 2016, 94(4): 92.

[28]MEHLMANN L M. Signaling for meiotic resumption in granulosa cells, cumulus cells, and oocyte[M]//COTICCHIO G, ALBERTINI D, DE SANTIS L. Oogenesis. London: Springer, 2013: 171-182.

[29]MEHLMANN L M. Stops and starts in mammalian oocytes: Recent advances in understanding the regulation of meiotic arrest and oocyte maturation[J].Reproduction, 2005, 130(6): 791-799.

[30]SUN Q Y, MIAO Y L, SCHATTEN H. Towards a new understanding on the regulation of mammalian oocyte meiosis resumption[J].CellCycle, 2009, 8(17): 2741-2747.