豬MYNN基因可變剪接體的克隆及表達特性研究

郭曉紅，李　萌，高鵬飛，曹果清，成志敏，張寧芳，樂寶玉，劉劍鋒，劉小軍，李步高*

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801； 2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動物遺傳育種與繁殖國家重點實驗室，北京 100193； 3. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002)

BTB(Broad complex, tramtrack, bricabrac)蛋白家族在轉(zhuǎn)錄的抑制和激活、染色質(zhì)重塑以及細胞骨架的構(gòu)建上發(fā)揮重要作用[1]。BTB蛋白既是轉(zhuǎn)錄激活劑，也是轉(zhuǎn)錄抑制劑[2-5]，可通過在核小體上的旋轉(zhuǎn)和重建來激活轉(zhuǎn)錄[6]，還可通過招募轉(zhuǎn)錄輔阻遏物[7-9]抑制轉(zhuǎn)錄因子的活性，進一步抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性[10-12]。鋅指蛋白(Zinc finger protein, ZF)為常見的一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，主要通過與靶基因特異性序列結(jié)合，以及與自身或其他鋅指蛋白的結(jié)合，來調(diào)節(jié)靶基因的表達，使之適應(yīng)生物體發(fā)育、分化和成熟等不同階段個體的需要[13]。研究發(fā)現(xiàn)，大約有5%～10%的C2H2型鋅指蛋白的N端含有BTB結(jié)構(gòu)域[14]，這便形成一類新的轉(zhuǎn)錄因子-BTB/POZ和鋅指蛋白 (BTB/POZ-ZF)家族。該家族通常與其他轉(zhuǎn)錄因子或者輔因子共同作用形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體從而激活或者抑制轉(zhuǎn)錄。Myoneurin(MYNN)是BTB/POZ-ZF家族的一員，其蛋白包括1個BTB/POZ結(jié)構(gòu)域和8個串聯(lián)重復(fù)的C2H2類型的鋅指結(jié)構(gòu)[15-16]，在基因的表達調(diào)控上具有重要作用。

MYNN已在小鼠的胚胎細胞中被鑒定出來，并且發(fā)現(xiàn)與人的MYNN序列具有較高的同源性[17]。前人研究發(fā)現(xiàn)，MYNN在哺乳動物各個組織中均有表達[18-20]。通過分析MYNN的整個結(jié)構(gòu)并檢測其在人肌肉組織中的表達規(guī)律，發(fā)現(xiàn)MYNN可以在人的肌肉組織中調(diào)控某些基因的表達[16]。研究發(fā)現(xiàn)，若將神經(jīng)切斷或細胞核突觸外的軸突切斷，MYNN的表達會出現(xiàn)異常，說明MYNN是介導(dǎo)突觸特異基因表達的候選基因[17]。另外還有研究認為，MYNN是潛在的促癌因子[21]，因此，其生物學(xué)功能及與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系值得進一步剖析。

目前，國內(nèi)外關(guān)于MYNN基因的研究主要集中在人和鼠上，關(guān)于豬MYNN的研究尚未見報道。本研究利用RT-PCR等技術(shù)對豬MYNN基因的全長CDS區(qū)進行克隆，并對其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能進行預(yù)測，采用實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qPCR)技術(shù)對馬身豬各組織表達譜及特定組織的發(fā)育性表達規(guī)律進行研究，從而為豬MYNN基因生物學(xué)功能的深入研究提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗動物和樣品采集

本試驗選取的試驗動物為山西省地方豬種馬身豬12頭，由山西大同市種豬場提供。分別在1、90、180日齡3個時間點屠宰采樣，每個時間點各4頭(公、母各半，公豬斷奶時去勢)，屠宰后，取其心、肝、脾、肺、腎、小腦、小腸、胰、胃、背最長肌及脂肪(無1日齡的脂肪組織樣品)組織樣品，迅速置于液氮中，后轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2　主要試劑

RNAiso Plus regent(TaKaRa, 大連)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(perfect Real Time)(TaKaRa, 大連)；2×TaqPCR MasterMix(天根生化科技有限公司，北京)；Gel DNA Extraction Kit(TaKaRa, 大連)； Trans-5α感受態(tài)細胞(全式金生物科技有限公司，北京)； pMDTM19-T Vector(TaKaRa, 大連)；SYBR Premix ExTaqⅡ (Tli RNaseH Plus)(TaKaRa，大連)。

1.3　試驗方法

1.3.1總RNA提取和cDNA合成按照RNAiso Plus regent試劑盒說明書提取不同組織的總RNA，用ND-1000微量核酸蛋白測定儀及1%瓊脂糖凝膠電泳測定總RNA的濃度和純度。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。合成cDNA采用兩步法，第一步反應(yīng)體系：gDNA Eraser 1 μL，gDNA Eraser buffer 2 μL，RNA 500 ng，加RNase-free水至10 μL。反應(yīng)程序：42 ℃ 2 min；4 ℃ 5 min。第二步反應(yīng)體系：5×primer 4 μL，mixⅠ1 μL，RTmix 1 μL，加RNase-free水至20 μL。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；4 ℃ 5 min。合成的cDNA置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2引物的設(shè)計與合成根據(jù)GenBank序列(登錄號：NC_010455.5)，用NCBI Primer-BLAST(https://blast.ncbi.nlm.ni，h.gov/Blast.cgi)和Oligo 7軟件設(shè)計克隆MYNN基因全長CDS區(qū)的引物P1以及擴增MYNN兩個轉(zhuǎn)錄本(MYNN-1和MYNN-2)的特異性引物P2和P3。所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物位置如圖1，各引物詳細信息見表1。圖1中兩個F3是因為F3的位置為外顯子5的末端及外顯子7的前端。F3的序列前面部分與外顯子5的3′末端相同，后半部分與外顯子7的5′端的開始序列相同，所以標(biāo)注兩個F3，其實是一個，即P3的上游引物。

F. 上游引物；R. 下游引物F. Forward primer; R. Reverse primer圖1　引物在豬MYNN基因上的位置信息Fig.1　Positional information of primers in pig MYNN

1.3.3目的基因的擴增及克隆以所有組織的cDNA混合物為模板，擴增豬MYNN基因全長CDS區(qū)，PCR反應(yīng)體系為20 μL：cDNA pool 50 ng，上下游引物(P1)各0.5 μmol·L-1，2×TaqPCR MasterMix 10 μL，加 ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸2 min。反應(yīng)產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用Gel DNA Extraction Kit對目的片段進行回收。

表1豬MYNN基因的PCR引物

Table1PCRprimersamplifyingpigMYNN

引物名稱Primername引物序列(5'→3')Primersequence片段長度/bpProductlength注釋NoteP1F1:AGAACAAGGGTAAAATTCGTTTGTGR1:TGCAGCATCAGGTGCTTTTA1928PCR擴增MYNN基因CDS區(qū)P2F2:CCTCAGGAGAGCTCAACAAACAR2:TGGACTCTTTTTCACTCAAGGGAT186qPCR擴增MYNN-1P3F3:CACTCATTCTCGAAAACATACAGGAR3:TGGACTCTTTTTCACTCAAGGGAT170qPCR擴增MYNN-218SrRNAF:CCCACGGAATCGAGAAAGAGR:TTGACGGAAGGGCACCA132qPCR擴增18SrRNA

將回收的目的片段與pMDTM19-T Vector 4 ℃過夜連接；采用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Trans-5α感受態(tài)細胞，用Amp抗性固體培養(yǎng)基進行藍白斑篩選，37 ℃避光培養(yǎng)12 h；選取陽性白色單克隆菌在含Amp的LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，之后對菌液進行PCR鑒定，篩選陽性菌液進行測序(北京六合華大科技股份有限公司)。

1.3.4生物信息學(xué)分析測序結(jié)果采用DNASTAR軟件進行序列比對；運用NCBI上的ORF Finder程序?qū)ωiMYNN基因的開放性閱讀框進行分析(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)；應(yīng)用ProtParam軟件對豬MYNN的理化性質(zhì)進行預(yù)測(http://web.expasy.org/protparam/)；采用NCBI在線軟件進行蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)；用SOPMA軟件對豬MYNN蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測(https://www.predictprotein.org/)；用ProtFun 2.2軟件對MYNN功能進行預(yù)測(http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)；用BLAST軟件對豬、人、東北虎、馬、羊駝、驢、家貓、家犬、北極熊、山羊的MYNN蛋白氨基酸序列進行同源性比較(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)；用MEGA4軟件對各物種進行進化樹的構(gòu)建。

1.3.5MYNN基因的時空表達特性研究采用qPCR技術(shù)及引物P2和P3對馬身豬各組織MYNN兩個轉(zhuǎn)錄本的表達規(guī)律進行研究。qPCR反應(yīng)體系為20 μL：2×SYBR Premix ExTaqII 10 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，50×ROX Reference Dye II 0.4 μL，cDNA 50 ng，RNAase Free ddH2O補至20 μL。參照SYBR Premix ExTaqⅡ (Tli RNaseH Plus)說明書確定反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性20 s，64 ℃退火延伸34 s，45個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s。每個樣本重復(fù)3次，反應(yīng)產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.3.6數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt法對相對定量結(jié)果進行處理，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示[22]。利用SPSS 22.0軟件單因素方差分析對MYNN基因的表達差異顯著性進行判斷，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2　結(jié)　果

2.1　豬MYNN基因可變剪接體的克隆及生物信息學(xué)分析

用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA，發(fā)現(xiàn)總RNA存在28S、18S、5S完整的3條帶(圖略)，且A260 nm/A280 nm的比值為1.8～2.0，表明其RNA完整性好，且無蛋白質(zhì)與DNA污染，測得的濃度適宜，可進一步用于RT-PCR分析。

2.1.1豬MYNN基因可變剪接體的克隆及序列分析引物P1的擴增結(jié)果如圖2所示，產(chǎn)物為清晰的兩條帶，大小分別為2 012和1 928 bp，推測其為MYNN的兩個不同的轉(zhuǎn)錄本。經(jīng)克隆測序得到豬MYNN基因的全長CDS區(qū)及部分非編碼區(qū)。

M. DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 引物P1的擴增產(chǎn)物M. DL2000 DNA marker; 1. Amplicons of P1圖2　引物P1擴增產(chǎn)物的電泳圖Fig.2　Agarose gel electrophoresis of RT-PCR amplicons of P1

經(jīng)過序列比對分析發(fā)現(xiàn)，MYNN基因在豬上存在兩個轉(zhuǎn)錄本，分別命名為MYNN-1和MYNN-2。運用NCBI上的ORF Finder對豬MYNN基因序列分析發(fā)現(xiàn)，MYNN-1含有一個長1 830 bp的ORF，其起始密碼子為ATG，位于34 bp處，終止密碼子為TGA，位于1 863 bp處；MYNN-2含有一個長1 746 bp的ORF，其起始密碼子為ATG，位于34 bp處，終止密碼子為TGA，位于1 779 bp處。由此可得出，MYNN-1的CDS區(qū)全長1 830 bp，編碼609個氨基酸；MYNN-2的CDS區(qū)全長1 746 bp，編碼581個氨基酸。與MYNN-1相比，MYNN-2少了84 bp，缺失第6外顯子，并且發(fā)現(xiàn)第6外顯子的剪切符合GT-AG法則，可變剪切的類型為外顯子跳躍(圖3)。將兩個轉(zhuǎn)錄本的全長CDS區(qū)序列及部分UTR序列提交至GenBank：MYNN-1的登錄號: KY470829，MYNN-2的登錄號: KY670835。

“∣”表示相同的核苷酸；“-”表示缺失的核苷酸“∣” indicate the same nucleotides; “-” indicate the deleted nucleotides圖3　MYNN-1和MYNN-2的部分核苷酸序列Fig.3　Partial nucleotide sequences of MYNN-1 and MYNN-2

2.1.2豬MYNN理化性質(zhì)分析用ProtParam軟件預(yù)測了豬MYNN的理化性質(zhì)。MYNN-1由609個氨基酸組成，其分子式為C3009H4787N859O928S32，分子量為68 871.23 u，理論等電點PI為8.77，說明MYNN-1為堿性氨基酸；Ser(9.5%)、Lys(9.4%)和Leu(8.7%)出現(xiàn)的頻率較高；在氨基酸組成中，極性氨基酸占33.83%，疏水性氨基酸占27.59%，帶電荷氨基酸占24.63%，其中包括13.46%的酸性氨基酸和11.17%的堿性氨基酸；消光系數(shù)(mol·L-1·cm-1γ=280 nm)為35 310，預(yù)測其在哺乳動物紅細胞的半衰期為30 h，其不穩(wěn)定系數(shù)為39.76，因此屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)；疏水性指數(shù)為72.18，平均親水性為-0.603，屬于可溶性蛋白質(zhì)。MYNN-2由581個氨基酸組成，其分子式為C2873H4578N820O889S30，分子量為65 792.71 u，理論等電點PI為8.71，說明MYNN-2為堿性氨基酸；Ser(9.3%)、Lys(9.3%)和Leu(9.0%) 出現(xiàn)的頻率較高，在氨基酸組成中，極性氨基酸占33.91%，疏水性氨基酸占27.88%，帶電荷氨基酸占24.78%，其中包括13.42%的酸性氨基酸和11.36%的堿性氨基酸；消光系數(shù)(mol·L-1·cm-1γ=280 nm)為35 310，預(yù)測其在哺乳動物紅細胞的半衰期為30 h，其不穩(wěn)定系數(shù)為40.83，因此屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；疏水性指數(shù)為72.98，平均親水性為-0.609，屬于可溶性蛋白質(zhì)。

2.1.3豬MYNN保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測利用NCBI在線軟件進行蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測：MYNN-1的N端含有一個BTB結(jié)構(gòu)域，C端含有8個串聯(lián)重復(fù)C2H2類型的鋅指結(jié)構(gòu)(圖4，左側(cè)為N端BTB結(jié)構(gòu)域，右側(cè)C端為鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域)。MYNN-2的N端同樣含有一個BTB結(jié)構(gòu)域，不同的是，其C端相對MYNN-1少了一個鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域(圖4)。

雙豎線標(biāo)出的是MYNN-1與MYNN-2結(jié)構(gòu)域預(yù)測不同的地方Double vertical line indicate the difference of predicted domains between MYNN-1 and MYNN-2圖4　豬MYNN蛋白結(jié)構(gòu)與分析Fig.4　Conservative domains analysis of pig MYNN protein

2.1.4豬MYNN二級結(jié)構(gòu)預(yù)測用SOPMA軟件對豬MYNN蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果顯示， MYNN-1的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(36.32%)、延伸(19.97%)、β-折疊(8.78%)和無規(guī)則卷曲(34.94%)組成，MYNN-2的二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋、延伸、β-折疊及無規(guī)則卷曲的比例分別為35.63%、20.53%、10.02%及33.83%。

2.1.5豬MYNN功能預(yù)測用ProtFun 2.2軟件對MYNN功能進行了預(yù)測，結(jié)果表明，該蛋白在運輸和結(jié)合、嘌呤和嘧啶、輔因子及翻譯的生物合成中發(fā)揮功能的可能性分別為0.773、0.331、0.210及0.071，作為電壓激活離子通道、轉(zhuǎn)錄因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、離子通道、陽離子通道及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子發(fā)揮作用的可能性分別為0.279、0.219、0.205、0.169、0.146、及0.111(表2)。由此推測，MYNN可能在運輸和結(jié)合、嘌呤和嘧啶、輔因子及翻譯的生物合成中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要作用。

2.1.6MYNN氨基酸序列進化樹的構(gòu)建用BLAST與MEGA4軟件對豬、東北虎、馬、山羊、羊駝、驢、家貓、家犬、北極熊、人的氨基酸序列進行同源性的比較以及進化樹的構(gòu)建(圖5)。結(jié)果表明，豬MYNN的氨基端序列與北極熊、山羊、馬、家犬等在系統(tǒng)進化樹中的遺傳距離較近，且同源性在95%以上。MYNN氨基酸序列進化樹與生物進化物種樹基本一致，符合物種進化的規(guī)律，說明MYNN基因的編碼區(qū)在物種間具有很高的保守性。

表2豬MYNN功能分析

Table2AnalysisofMYNNfunction

功能分類Functionalcategory概率Probability基因本體分類GeneOntologycategory概率Probability氨基酸生物合成Aminoacidbiosynthesis0.011信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Signaltransducer0.205輔因子的生物合成Biosynthesisofcofactors0.210受體Receptor0.007細胞被膜Cellenvelope0.033轉(zhuǎn)運蛋白Transporter0.025細胞加工Cellularprocesses0.030離子通道Ionchannel0.169中央中間代謝Centralintermediarymetabo-lism0.048電壓激活離子通道Voltage-gatedionchannel0.279能量代謝Energymetabolism0.035陽離子通道Cationchannel0.146脂肪酸代謝Fattyacidmetabolism0.017轉(zhuǎn)錄因子Transcriptionfactor0.219嘌呤和嘧啶Purinesandpyrimidines0.331轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Transcriptionregulationfactor0.111監(jiān)管職能Regulatoryfunctions0.034應(yīng)激反應(yīng)Stressresponse0.073復(fù)制和轉(zhuǎn)錄Replicationandtranscription0.020免疫反應(yīng)Immuneresponse0.011翻譯Translation 0.071生長因子Growthfactor0.005運輸和結(jié)合Transportandbinding0.773金屬離子轉(zhuǎn)運Metaliontransport0.018

圖5　MYNN 氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.5　Phylogenetic tree of amino acid sequences of MYNN

2.2　豬MYNN基因的時空表達特性研究

2.2.1MYNN基因各轉(zhuǎn)錄本在豬不同組織的表達譜分析由圖6可以看出，MYNN-1和MYNN-2在馬身豬各組織中均有表達，且組織間表達差異顯著(P<0.05)；MYNN-1和MYNN-2在馬身豬的胃中表達量最高，其次為胰、小腸、肺、小腦、肝、腎，在脂肪組織中的表達量最低；相同組織中，除了腎組織，MYNN-1的表達量均顯著或極顯著高于MYNN-2(P<0.05或P<0.01)。

2.2.2MYNN基因各轉(zhuǎn)錄本在豬胃和背最長肌中的發(fā)育性表達特征分析MYNN-1和MYNN-2在馬身豬胃組織的表達量隨著日齡的增加呈下降趨勢(圖7)；在背最長肌中的表達量隨著日齡的增加呈先上升后下降的趨勢(圖8)；在胃和背最長肌幾乎所有時期中，MYNN-1的表達量均極顯著高于MYNN-2(P<0.01)(圖7、圖8)。

*、**分別表示同一組織不同轉(zhuǎn)錄本間表達差異顯著或極顯著(P<0.05，P<0.01)。不同字母表示同一轉(zhuǎn)錄本在不同組織間表達差異顯著(P<0.05)，下圖同*, ** indicate the significant or extremely significant expression difference in the same tissue between the two transcripts(P<0.05, P<0.01). The different letters indicate the significant difference of the same transcript expression among different tissues(P<0.05). The same as below圖6　MYNN-1和MYNN-2在馬身豬各組織中的表達Fig.6　The relative expression of MYNN-1 and MYNN-2 in different tissues of Mashen pig

圖7　MYNN-1和MYNN-2 mRNA在胃組織的表達Fig.7　The relative expression of MYNN-1 and MYNN-2 mRNA in stomach

圖8　MYNN-1和MYNN-2 mRNA在背最長肌組織的表達Fig.8　The relative expression of MYNN-1 and MYNN-2 mRNA in longissimus dorsi

3　討　論

可變剪接是由pre-mRNA通過不同的剪接方式產(chǎn)生的，最終會導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的多樣性[23]?？勺兗艚釉跈C體中廣泛存在，并且與蛋白質(zhì)功能的改變密切相關(guān)[24]。同一基因的各個轉(zhuǎn)錄本的表達程度大小不同，表達量最高的被稱為主要的亞型形式，而那些相對表達少的轉(zhuǎn)錄本被稱為次要亞型[25]。本試驗成功克隆出豬MYNN基因的兩個轉(zhuǎn)錄本，MYNN-1的CDS區(qū)全長1 830 bp，編碼609個氨基酸，MYNN-2的CDS區(qū)全長1 746 bp，編碼581個氨基酸。在馬身豬90日齡的各個組織，以及胃和背最長肌幾乎所有的時期，MYNN-1 mRNA的表達量顯著或極顯著高于MYNN-2(P<0.05，P<0.01)，因此，在豬上MYNN-1是主要的亞型。

TF IIIA是典型的C2H2類型的鋅指蛋白，其雖含有9個鋅指結(jié)構(gòu)，但并非每個鋅指都可以與DNA結(jié)合，它主要依靠鋅指1～3與DNA結(jié)合。鋅指7～9與DNA結(jié)合的能力顯著低于鋅指1～3[26-27]，且鋅指4～6不能與DNA結(jié)合，它會形成一個開放性的延展結(jié)構(gòu)，來促進鋅指1～3、7～9與DNA的結(jié)合[28-29]。功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)，MYNN-1比MYNN-2多了一個C2H2類型的鋅指結(jié)構(gòu)，該鋅指結(jié)構(gòu)有Zn的結(jié)合位點，但不能結(jié)合核酸。MYNN-1比MYNN-2多出來的鋅指結(jié)構(gòu)雖然不能結(jié)合DNA，但有可能會促進其他鋅指結(jié)構(gòu)與DNA的結(jié)合，使MYNN-1與DNA結(jié)合的能力更強，從而發(fā)揮主要作用。

前人研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的半衰期和其穩(wěn)定性有密切關(guān)系，半衰期長的蛋白質(zhì)一般具有較高的穩(wěn)定性[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，豬MYNN-1與MYNN-2同樣具有較長的半衰期，但前者屬于穩(wěn)定蛋白，后者卻為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，推測該特性與其特定的功能有關(guān)。通過對豬MYNN功能的預(yù)測，其可能在運輸和結(jié)合、嘌呤和嘧啶及輔因子的生物合成中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要作用。對豬MYNN基因序列與氨基酸序列的比對分析發(fā)現(xiàn)，豬MYNN基因的長度與其所編碼氨基酸數(shù)和其他物種基本一致，與個別物種略有差異。分析與其他物種的同源性發(fā)現(xiàn)，豬與人、羊駝、家犬等9個物種的親緣關(guān)系較近，其同源性為95%～100%。該結(jié)果說明MYNN基因的編碼區(qū)在生物進化過程中具有很強的保守性。

基因表達的差異與生物學(xué)功能密切相關(guān)，所以研究MYNN基因的表達規(guī)律對于探究其功能是十分必要的。前人研究發(fā)現(xiàn)，MYNN在哺乳動物各個組織中均有表達[18-20]。P.M.Alliel等[15]通過Northern blot分析發(fā)現(xiàn)，MYNN在人的各組織中均有表達，且肌肉組織中的表達量顯著高于睪丸、卵巢及胚胎等其他組織。據(jù)報道，MYNN在小鼠的小腦、骨骼、肌肉、睪丸、心、腦及肝中都有表達[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，MYNN-1和MYNN-2在馬身豬的心、肝、脾、肺、腎、小腦、小腸、胃、胰、肌肉和脂肪中都有表達，且各組織間表達差異顯著(P<0.05)，與前人的研究結(jié)果基本一致。MYNN基因的這種廣譜型表達特征與其作為轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的功能相符。進一步分析發(fā)現(xiàn)，MYNN-1和MYNN-2在馬身豬的胃、胰、小腸中高表達，胃、胰和小腸是主要的消化器官，據(jù)此推測，MYNN與馬身豬的消化吸收作用密切相關(guān)。

由此，本研究進一步對MYNN-1與MYNN-2在馬身豬胃組織中的發(fā)育性表達規(guī)律進行研究，結(jié)果顯示，隨著日齡的增加，MYNN-1與MYNN-2的表達量均逐漸降低。仔豬出生時的胃腸道發(fā)育不完全，其重量和容積均相對較小，且消化酶的分泌量不足，消化吸收功能也不完善，例如胃蛋白酶在仔豬出生時是以酶原狀態(tài)存在的，其為不可消化蛋白質(zhì)，特別是植物性蛋白。初生1 d仔豬的胃重僅為4～8 g，只能容納40 mL左右的乳汁。仔豬胃腸道在整個哺乳期會快速生長發(fā)育，胃蛋白酶在35～40日齡便開始具有消化功能，75日齡時消化機能逐漸完善，180日齡時，胃腸道基本不再發(fā)育。由此推測，MYNN基因可能通過調(diào)控某些基因的表達來促進胃腸道的發(fā)育。

研究推測MYNN基因在肌肉發(fā)育中有重要作用。因此，為了更深入地研究MYNN在肌肉中的功能，本試驗分析了MYNN基因在馬身豬背最長肌中的發(fā)育性表達規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著日齡的增加，MYNN-1與MYNN-2的表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。骨骼肌的生長發(fā)育受到一系列生肌決定因子在時間和空間上的精密調(diào)控。本課題組前期研究的MyoD及MyoG基因均屬生肌調(diào)控因子家族，該家族基因參與肌纖維的形成，是影響肌肉生長和肉品質(zhì)的候選基因[31]。在初生1～180日齡，MyoD呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，MyoG的表達量在1和180日齡均顯著低于90日齡，90日齡時達到最高值[31]。MYNN-1與MYNN-2的發(fā)育性表達規(guī)律與這兩個生肌決定因子基本相同，這說明MYNN-1與MYNN-2很可能在骨骼肌的生長發(fā)育調(diào)節(jié)過程中起到一定的作用，但其具體機制還需要進一步的研究。

4　結(jié)　論

本試驗獲得了豬MYNN基因的兩個新轉(zhuǎn)錄本，分別命名為MYNN-1(GenBank登錄號：KY470829)和MYNN-2(GenBank登錄號：KY670835)，MYNN-1的CDS區(qū)全長1 830 bp，編碼609個氨基酸，MYNN-2的CDS區(qū)全長1 746 bp，編碼581個氨基酸。與MYNN-1 相比，MYNN-2少84 bp，缺失第6外顯子，且MYNN-2比MYNN-1少一個C2H2類型的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域。分析馬身豬MYNN-1和MYNN-2在各組織表達譜及在胃和背最長肌組織中發(fā)育性表達規(guī)律發(fā)現(xiàn)，MYNN-1是主要的亞型，且MYNN在馬身豬的消化吸收及骨骼肌的生長發(fā)育過程中具有重要作用。

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