細(xì)粒棘球絳蟲蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展

徐夢飛，盧平萍，馬　勛，張艷艷，王煒燁,，孟季蒙，王正榮*，薄新文*

(1. 省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，石河子 832000；2. 石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832000)

細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus，E.g)，系帶科、棘球?qū)俳{蟲，其擁有復(fù)雜的生活史，包括蟲卵、六鉤蚴、棘球蚴、成蟲等4個(gè)發(fā)育階段，以及兩任宿主[1]。其成蟲主要寄生于犬科食肉動物，如犬、狼等(終末宿主)，幼蟲寄生于牛、羊等食草動物和人(中間宿主)。包蟲病是由細(xì)粒棘球絳蟲的幼蟲引起的重要人畜共患病，對人類的健康和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重的威脅，并且其分布相當(dāng)廣泛[2]，在亞洲、歐洲、非洲、北美洲的高原及氣候寒冷的牧區(qū)與半牧區(qū)較為流行，被WHO列為嚴(yán)重的“被忽視的熱帶病”[3-5]。中國是包蟲病流行較為嚴(yán)重的國家之一，主要在西部的牧區(qū)和半牧區(qū)，其中20多個(gè)省、自治區(qū)和直轄市都已證實(shí)有包蟲病感染的病例，主要流行于四川西部、甘肅、內(nèi)蒙、寧夏、青海、西藏和新疆，在2012年被列為《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012—2020年)》優(yōu)先防治的國內(nèi)動物疫病[6]。

在早期預(yù)防階段，除在包蟲病流行區(qū)進(jìn)行健康教育之外，疫苗預(yù)防是主要的預(yù)防方法。近些年，在包蟲病研究中，主要包括疫苗候選分子、藥物靶點(diǎn)和診斷標(biāo)志物的篩選，而了解細(xì)粒棘球絳蟲蛋白構(gòu)成情況是以上工作的基礎(chǔ)和前提，蛋白質(zhì)組學(xué)是從整體水平對細(xì)粒棘球蚴的蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模研究和探索，為包蟲病的預(yù)防和治療探索新的方法和思路[2]。下面將從相關(guān)的研究方法和進(jìn)展等方面進(jìn)行闡述。

1　細(xì)粒棘球絳蟲蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要技術(shù)和手段

目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容包括三個(gè)方面，即蛋白質(zhì)分離、鑒定和生物信息學(xué)分析，其中蛋白質(zhì)分離和鑒定的核心技術(shù)是雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)，而生物信息學(xué)分析必須先建立蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，后進(jìn)行蛋白質(zhì)預(yù)測及功能分析等操作。下面將從以上三個(gè)方面進(jìn)行概述。

1.1　雙向凝膠電泳

雙向凝膠電泳(2-dimensional gel electrophoresis，2-DE)是當(dāng)前用于分離組織、細(xì)胞蛋白質(zhì)最有效的分離手段[7]，其能夠同時(shí)將數(shù)千種蛋白質(zhì)分離和展示。2-DE結(jié)合了等電聚焦技術(shù)和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)。通常第一維電泳是等電聚焦電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)不同將其分離，第二維電泳是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)相對分子質(zhì)量對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離[3]。這樣各個(gè)蛋白質(zhì)根據(jù)等電點(diǎn)和分子量的不同而被分離、分布在二維圖譜上。

由于雙向電泳具有很高的分辨率，在細(xì)粒棘球絳蟲蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，同時(shí)也在不斷改進(jìn)，李居怡等在分析細(xì)粒棘球蚴囊液過程中，通過比較等電聚焦中膠條的pH值發(fā)現(xiàn)，pH值在7～10時(shí)分離蛋白質(zhì)效果更好，得到的單個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)更多[7]。通常2-DE技術(shù)會串聯(lián)質(zhì)譜(mass spectrometry, MS)技術(shù)使用，從而進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析，其中基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flying mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)可實(shí)現(xiàn)2-DE分離后蛋白質(zhì)的快速、靈敏和高通量鑒定[8]。但該技術(shù)重復(fù)性差，并且某些疏水蛋白不適合進(jìn)行等電點(diǎn)聚焦電泳，檢測不出低豐度蛋白質(zhì)等[3]。

1.2　質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用于E.g蛋白質(zhì)組學(xué)研究, 它的基本原理是樣品分子離子化后, 根據(jù)不同離子間的質(zhì)荷比(m/z)的差異來分離樣品并確定相對分子質(zhì)量, 進(jìn)行成分和結(jié)構(gòu)分析[9]。常用的質(zhì)譜技術(shù)有MALDI-TOF-MS和電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜分析法(electrical spray ionisation-mass spectrometer/mass spectrometer, ESI-MS/MS)，前者最適于肽相對分子質(zhì)量分析，具有易于操作、分辨率高和靈敏度高的特點(diǎn)，后者最適于測定肽序列分析。利用生物信息學(xué)對這些蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)獲得的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析, 在篩選生物標(biāo)志物領(lǐng)域有著重要的作用。

1.3　生物信息學(xué)分析

質(zhì)譜技術(shù)測定的結(jié)果通過高通量質(zhì)譜軟件分析、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比對及生物信息學(xué)分析來鑒定蛋白質(zhì)?，F(xiàn)有的較成熟的蛋白質(zhì)搜索數(shù)據(jù)庫有EMBL、SWISS-PROT及NCBI的非冗余蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，其中SWISS-PROT是目前世界上最大、蛋白質(zhì)種類最多的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫[10]。在細(xì)粒棘球絳蟲蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，生物信息學(xué)分析起著重要的作用，為2-DE、MS等技術(shù)獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行高通量的分析，從而得出詳細(xì)的結(jié)果，通過數(shù)據(jù)庫比對，還能進(jìn)行基因功能聚類、通路富集等分析，為細(xì)粒棘球絳蟲蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了巨大的幫助。

1.4　近幾年細(xì)粒棘球絳蟲蛋白質(zhì)組學(xué)常用方法

隨著技術(shù)的進(jìn)步，細(xì)粒棘球絳蟲蛋白質(zhì)組學(xué)研究中用到的技術(shù)和手段也隨之提高，在常用的2-DE、MS和生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，近幾年在細(xì)粒棘球絳蟲蛋白質(zhì)組學(xué)研究的方法和手段上也出現(xiàn)了新的嘗試，例如，基質(zhì)輔助激光解吸附四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry, MALDI-Q-TOF MS)[11]、液相色譜-二級質(zhì)譜連用(liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)[12]、強(qiáng)陽離子交換(strong cation exchange, SCX)、雙向液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(2-dimensional liquid chromatography tandem mass spectrometry, 2DLC-MS)[13]、免疫印跡(immunoblot)[14]、矩陣輔助激光解吸/電離串聯(lián)時(shí)間質(zhì)譜法(matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF/TOF-MS)[15]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(inductively coupled plasma atomic emission spectrometer, ICP-AES)[16]、基質(zhì)輔助激光解吸附四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜-二級質(zhì)譜聯(lián)用(matrix-assisted laser desorption/ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry/mass spectrometry, MALDI-Q-TOF MS/MS)、電噴霧液質(zhì)聯(lián)用四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜-二級質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry/mass spectrometry, LC-ESI-Q-TOF MS/MS)[17]、激光顯微切割(laser microdissection, LMD)[18]，并且相關(guān)數(shù)據(jù)庫完善和分析軟件的發(fā)展，使蛋白質(zhì)組學(xué)研究得到了快速發(fā)展。

2　細(xì)粒棘球絳蟲蛋白質(zhì)組學(xué)研究

2013年，具有轉(zhuǎn)折性和革命性的兩篇關(guān)于細(xì)粒棘球絳蟲基因組研究論文發(fā)表，I. J. Tsai等描述了E.g的基因組草圖[19]，H. J. Zheng等報(bào)道了E.g的基因組的序列與分析[20]，這兩項(xiàng)研究成果，為人們在細(xì)粒棘球絳蟲的生物學(xué)、變異、發(fā)育、進(jìn)化、致病機(jī)制和與宿主之間的相互作用等方面提供了新的研究方向，其中之一便是蛋白質(zhì)組學(xué)。

E.g發(fā)育的全程包括蟲卵、六鉤蚴、棘球蚴、原頭蚴和成蟲等5個(gè)主要形態(tài)階段。其中在中間宿主體內(nèi)主要為棘球蚴階段，即包囊階段，在終末宿主體內(nèi)主要是成蟲階段。目前E.g的整體蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要集中在棘球蚴階段和成蟲階段，其他階段由于樣本獲得和操作的困難性，目前鮮有相應(yīng)的研究。

2.1　棘球蚴蛋白質(zhì)組學(xué)

此階段為包囊形態(tài)，包囊內(nèi)充滿液體，由包囊壁包裹，包囊液中含有原頭蚴。當(dāng)前對棘球蚴蛋白質(zhì)組的研究主要見于三個(gè)部分，即生發(fā)層(germinal layer, GL)、包囊液(hydatid cyst fluid, HCF)和原頭蚴(protoscolex, PSC)。此階段也是寄生蟲與宿主之間相互作用最活躍的時(shí)期，特別是對于ES產(chǎn)物的研究，對于疫苗研發(fā)和臨床診斷的標(biāo)志物的研究具有重要的意義。

包囊壁包含有內(nèi)外兩層，即外層的薄片層(laminated layer, LL)與內(nèi)層的GL。LL為非細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由GL衍生而成的薄層，主要作用是保護(hù)包囊不受宿主細(xì)胞的直接攻擊；GL是由細(xì)胞形成的合胞體層，GL是產(chǎn)生PSC的部位，同時(shí)也是棘球蚴與宿主之間相互作用的部位，在棘球蚴生存過程中有著重要的作用，如攝取營養(yǎng)物質(zhì)、分泌排泄以及免疫逃避等[21-23]。GL能夠控制寄生蟲從宿主獲取特定的氨基酸、蛋白質(zhì)及營養(yǎng)物質(zhì)，例如由于處于中絳期的E.g缺乏合成脂肪和膽固醇的能力，E.g通過使用脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)以及載脂蛋白B抗原從宿主那里獲得必需的脂肪[19]。K. M. Monteiro等[24]對GL進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析后，鑒別出25個(gè)E.g蛋白質(zhì)，通過功能分析后，發(fā)現(xiàn)大部分蛋白質(zhì)與代謝、產(chǎn)能和轉(zhuǎn)化有關(guān)，這種結(jié)果也符合GL具有生殖功能的特征，并且可以推測出這些蛋白質(zhì)都很活躍。棘球蚴是E.g在中間宿主體內(nèi)的主要存在形式，作為抗原而引起宿主的免疫應(yīng)答，而棘球蚴為能夠在中間宿主體內(nèi)發(fā)育、增殖并長期存活，通過某些途徑逃避宿主的免疫效應(yīng)，在進(jìn)化過程中獲得了某些自我保護(hù)的能力——免疫逃避[25]。作為棘球蚴與宿主重要的接觸面——GL在棘球蚴免疫逃避過程中發(fā)揮著重要的作用，GL與LL構(gòu)成的包囊壁作為免疫逃避的有效屏障，將宿主與包囊內(nèi)的寄生蟲隔離，保證寄生蟲的存活；其次，棘球蚴可通過胞吞作用攝取宿主的蛋白質(zhì)，并將其分泌在GL表面，進(jìn)行免疫逃避，降低炎癥反應(yīng)[12，24]，并且棘球蚴能夠通過自身表達(dá)和綿羊宿主的某些相似的抗原，從而進(jìn)行免疫逃避[26]。另外，GL中包含有多種可對宿主免疫應(yīng)答進(jìn)行抑制或直接破壞的蛋白質(zhì)，如AgB8/1作為EgAgB基因家族的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，能夠干擾并改變宿主的免疫反應(yīng)[26]；副肌球蛋白是具有多種功能的宿主免疫調(diào)節(jié)蛋白，通過與補(bǔ)體、免疫球蛋白和細(xì)胞免疫分子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用；四分子交聯(lián)體家族成員9能與各種細(xì)胞表面分子作用，如主要組織相容性復(fù)合體、Fc受體，從而調(diào)節(jié)它們的功能或信號，通過作為宿主配體的受體對宿主免疫功能進(jìn)行調(diào)節(jié)；AgB和EgTeg能夠誘發(fā)和維持Th2極化的微環(huán)境，營造棘球蚴適宜的生存環(huán)境有助于建立起E.g的慢性感染；E.g硫氧還過氧化物酶(E.gthioredoxin peroxidase, EgTPx)能夠抵抗宿主的氧化作用，增加寄生蟲的生存概率；Ag5包含有一個(gè)高保守性的黏多糖結(jié)合的機(jī)構(gòu)域，能夠以此為抗原，并且以Ag5為抗原的疫苗已經(jīng)上市，但其生物學(xué)意義并未完全研究透徹[24]。

HCF是由包囊壁包裹的無色清亮的液體，其中含有大量的蛋白質(zhì)，其中主要包括兩類，即GL和PSC的ES產(chǎn)物，以及大量宿主的蛋白質(zhì)[24]，本文將HCF中的蛋白質(zhì)按功能分為三類，即PSC發(fā)育、免疫逃避及保護(hù)作用。HCF是棘球蚴重要的組成部分，也是PSC生長繁殖不可或缺的組分，因?yàn)镠CF的主要功能之一是為PSC提供發(fā)育所需的營養(yǎng)和必要成分[12]，如E.g除缺乏從頭合成脂肪酸和膽固醇的能力，并且還缺乏從頭合成嘧啶、嘌呤和大部分氨基酸(除丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸外)的能力，加之缺乏從頭合成核苷酸的能力，以上營養(yǎng)物質(zhì)E.g只能從宿主那里獲得[20]，通過對HCF蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其中存在與PSC發(fā)育所需營養(yǎng)物質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)組，如低密度脂蛋白受體，其能夠幫助E.g攝取宿主的甾醇類和脂肪酸[12]；在HCF大量存在的宿主血清蛋白中，主要包括白蛋白、血清鐵傳遞蛋白和血紅蛋白，其中推測白蛋白為PSC提供必要的能源物質(zhì)，血清鐵轉(zhuǎn)移蛋白能夠幫助PSC獲取宿主的鐵，血紅蛋白能夠?yàn)镻SC運(yùn)輸氧氣和二氧化碳，維持HCF的酸堿度[27]；通過比較不同物種中間宿主(羊、牛和人)體內(nèi)獲得HCF中鑒定出的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的含量和數(shù)量均有差異，如有12個(gè)蛋白質(zhì)只在牛的包囊液(CHCF)中存在，AgB-4在三種中間宿主的HCF中都有出現(xiàn)，但在羊的包囊液(SHCF)中高表達(dá)，推測可能與宿主的生理環(huán)境不同有關(guān)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，IgM和補(bǔ)體C3僅在CHCF和人的包囊液(HHCF)中出現(xiàn)，說明對于棘球蚴的出現(xiàn)，不同種宿主之間在最初的反應(yīng)存在差異[12]。HCF中大量的宿主蛋白質(zhì)不但能夠?yàn)镻SC的發(fā)育提供所需的營養(yǎng)，也能夠通過分泌在包囊表面，進(jìn)行抗原偽裝，這與之前的研究結(jié)果相同[12]。PSC能夠在具有免疫應(yīng)答的宿主內(nèi)存活，HCF中的蛋白質(zhì)起著重要的作用，如其中的親環(huán)蛋白通過與環(huán)孢素及CD147作用，能夠調(diào)節(jié)宿主的炎癥反應(yīng)，營造適合棘球蚴生存的環(huán)境[28]。由于HCF中蛋白質(zhì)與宿主血漿蛋白的相似性，同時(shí)HCF中的蛋白質(zhì)混合物是處在變化之中，HCF的蛋白質(zhì)組學(xué)分析面臨著挑戰(zhàn)[24，29]。

PSC是E.g生活史中重要的一部分，由GL上的生發(fā)囊(brood capsule)產(chǎn)生，是在中間宿主體內(nèi)存在的主要形式。PSC具有雙向發(fā)育的能力，即在中間宿主體內(nèi)時(shí)，可發(fā)育為子囊，并通過無性生殖的方式在子囊中產(chǎn)生新的PSC，當(dāng)進(jìn)入終末宿主時(shí)，在膽汁的刺激下，在終末宿主的小腸內(nèi)發(fā)育為成蟲[19-20]。PSC是E.g生活史中蛋白質(zhì)組學(xué)研究較多的階段之一，對PSC的ES產(chǎn)物中鑒定出的蛋白質(zhì)進(jìn)行注釋后，通過GO分析，發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)主要分類為結(jié)合與催化，除此之外，還包括抗氧化、酶調(diào)節(jié)以及轉(zhuǎn)運(yùn)功能[14]。在與宿主相互作用過程中，除GL的抗原偽裝外，PSC可釋放ES產(chǎn)物以結(jié)合、降解或其他方式與宿主免疫細(xì)胞作用，從而對宿主免疫反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，達(dá)到免疫逃避的目的[30]。研究發(fā)現(xiàn)，PSC能夠釋放一些蛋白質(zhì)與宿主的免疫效應(yīng)物作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)，通過2-DE免疫印跡發(fā)現(xiàn)包蟲病患者血清中鑒定出PSC的14個(gè)蛋白質(zhì)(P-29、E.gTPx、HSP70等)[24]，其中EgTeg能夠引起Th2免疫反應(yīng)，與E.g慢性感染有關(guān)[14]；14-3-3蛋白與抵御細(xì)胞介導(dǎo)的免疫有關(guān)[14]；TPx能夠保護(hù)寄生蟲不受宿主及自身的細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)的破壞，并且在免疫逃避中起重要的作用，TPx在E.g各個(gè)階段均有表達(dá)，PSC階段表達(dá)量較大，在其體表皮層、皮下層和鈣顆粒細(xì)胞內(nèi)分布廣泛[31-32]；鈣蛋白酶在V. G. Virginio等的研究中首次在ES產(chǎn)物中被鑒定出來，與其他絳蟲相似，鈣蛋白酶能夠促進(jìn)E.g對宿主蛋白的消化和組織的浸潤[14，33]。碳水化合物代謝、氨基酸代謝、脂類代謝及核苷酸代謝是動物寄生性蠕蟲的營養(yǎng)物質(zhì)代謝主要方式，其中碳水化合物代謝途徑包括糖酵解、三羧酸循環(huán)和磷酸戊糖途徑，KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，E.g具有完整的碳水化合物代謝途徑[20]。W. Pan等[34]在研究中發(fā)現(xiàn)E.g進(jìn)化出了幾近完美的從宿主獲取能量和營養(yǎng)的策略，不但通過釋放磷酸果糖激酶(phosphofructokinase, PFK1)和丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)等調(diào)節(jié)糖酵解的酶類，這些限速酶通過調(diào)節(jié)糖酵解能夠合成非必需氨基酸、脂肪酸、腺嘌呤、次黃嘌呤和嘧啶供其生長所需，而且在葡萄糖缺乏時(shí)，PSC能夠釋放丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase)等酶類進(jìn)行糖異生反應(yīng)，從而合成葡萄糖供其生長所需，在V. G. Virginio等的研究[14]中也有相似發(fā)現(xiàn)。PSC除在蛋白質(zhì)水平上與宿主進(jìn)行相互作用，在PSC還發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白能夠在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)控宿主基因的表達(dá)，使宿主的內(nèi)環(huán)境適合PSC的生長發(fā)育[13, 34]。在G. B. Dos Santos等的研究中，鑒定出G蛋白伴侶受體超家族的兩個(gè)卷曲蛋白，它們在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和生長發(fā)育過程中起主要作用，并且在調(diào)節(jié)細(xì)胞對刺激的反應(yīng)程度方面有著重要的作用，它們的缺失可能會導(dǎo)致寄生蟲信息傳遞、發(fā)育及存活出現(xiàn)問題，最終導(dǎo)致PSC不能產(chǎn)生子囊，甚至死亡[35]。通過將鑒定出的PSC蛋白進(jìn)行KEGG分析，發(fā)現(xiàn)大量蛋白質(zhì)參與Wnt、Hedgehog和Notch等與蟲體發(fā)育密切相關(guān)的信號通路，了解PSC蛋白質(zhì)表達(dá)特性，將有助于抗原及診斷靶標(biāo)候選分子的篩選[36]。PSC是E.g蛋白質(zhì)組學(xué)中研究較多也是較透徹的一個(gè)階段，也是進(jìn)行診斷標(biāo)志物篩選、藥物靶標(biāo)篩選及疫苗候選分子篩選中具有較大希望的階段。

綜上所述，在棘球蚴階段，寄生蟲主要通過ES產(chǎn)物與宿主相互作用，一方面利用ES產(chǎn)物直接或間接調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)，創(chuàng)造適宜的生存環(huán)境，例如ES產(chǎn)物中的TPx等，另一方面寄生蟲利用ES產(chǎn)物直接從宿主處獲得營養(yǎng)物質(zhì)或調(diào)節(jié)宿主相關(guān)代謝途徑，從而獲得能量，例如參與三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle, TCA)的部分酶類[34]，以及參與脂肪合成的FABP等。隨著E.g蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)ES產(chǎn)物在E.g生長發(fā)育中具有重要的作用，在ES產(chǎn)物研究過程中，通過篩選將部分ES產(chǎn)物分為診斷標(biāo)志物、疫苗靶點(diǎn)和藥物靶標(biāo)的候選蛋白，以期在包蟲病的診斷、預(yù)防和治療中提供幫助，見表1。

表1已知蛋白質(zhì)的潛在應(yīng)用

Table1Potentialapplicationofknownproteins

GenBank登錄號GenBankID蛋白質(zhì)Protein氨基酸(aa)Aminoacid應(yīng)用Application表達(dá)階段Stage疫苗候選ART89314.1EG95156疫苗候選幼蟲[37]EgM9疫苗候選成蟲[38]ABG75851.1Myophilin190疫苗候選幼蟲[39]AAF19966.114-3-3protein244疫苗候選成蟲[40]CDS16133.1Leucylaminopeptidase566疫苗候選幼蟲[41]Q02970.2Fattyacid-bindingproteinhomolog1133疫苗候選幼蟲[42]EUB59176.1AntigenEG31634疫苗候選幼蟲[20]AF067807EgA311836疫苗候選幼蟲[43]CDS21034.1ImmunogenicproteinTs11162疫苗候選幼蟲[19]EUB57912.1GlutathioneS-transferase(GST)438疫苗候選、診斷標(biāo)志物幼蟲[44]診斷標(biāo)志物CAA81256.1AntigenB65診斷標(biāo)志物成蟲[45]EUB59176.1EgA13634診斷標(biāo)志物幼蟲[19]ACA14468.1TropomyosinB224診斷標(biāo)志物幼蟲及成蟲[46]AAD38373.1EgAgB8/181診斷標(biāo)志物幼蟲[47]NP_001153220.1EgAgB8/2245診斷標(biāo)志物幼蟲[48]AAW78439.1AntigenB178診斷標(biāo)志物幼蟲[49]AAW78460.1AntigenB281診斷標(biāo)志物幼蟲[49]AAW78445.1AntigenB382診斷標(biāo)志物幼蟲[49]AAW78450.1AntigenB481診斷標(biāo)志物幼蟲[49]AAQ74961.1AntigenBsubunit481診斷標(biāo)志物幼蟲[49]AAZ76567.1AntigenBsubunit178診斷標(biāo)志物幼蟲[50]AAC14584.1Thioredoxin(TRX)107診斷標(biāo)志物幼蟲[51]AOY34842.1EpC1174診斷標(biāo)志物幼蟲[52]CDS15479.1FKBP12rapamycincomplexassociatedprotein3300診斷標(biāo)志物幼蟲[19]

(轉(zhuǎn)下頁　Carried forward)

2.2　成蟲的蛋白質(zhì)組學(xué)

E.g的終末宿主在采食含有包囊的內(nèi)臟后，PSC進(jìn)入終末宿主(如犬)的體內(nèi)，在膽酸鹽的刺激下發(fā)育為成蟲，寄生終末宿主的小腸中。

E.g通過頭節(jié)的吸盤固定在終末宿主的小腸黏膜上，通過表皮吸收食物中的營養(yǎng)，并通過釋放ES產(chǎn)物調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)，創(chuàng)造適宜的生長環(huán)境。通過寄生蟲與宿主蛋白質(zhì)共純化的方式，從E.g中鑒定出30個(gè)宿主的蛋白質(zhì)，如激動蛋白、組蛋白、代謝酶類、角質(zhì)及胞內(nèi)蛋白等，推測這些蛋白質(zhì)可能是成蟲從其吸附的腸道上皮細(xì)胞中獲得的，并且還發(fā)現(xiàn)宿主激素及固有免疫分子，表明成蟲通過攝取宿主蛋白質(zhì)減輕炎癥反應(yīng)，從而建立長期感染[13]。另外，研究發(fā)現(xiàn)，在成蟲與宿主間的相互作用中，幾種蛋白質(zhì)發(fā)揮著重要的作用，如烯醇酶、親環(huán)素硫氧還蛋白過氧化物酶等，其中烯醇酶是成蟲ES產(chǎn)物中含量最多的蛋白質(zhì)，其是具有多功能的表面蛋白，與建立寄生蟲、宿主之間相互作用和寄生蟲侵襲有關(guān)[69]；親環(huán)素是成蟲ES產(chǎn)物中第二多的蛋白質(zhì)，參與寄生蟲發(fā)育和寄生蟲、宿主相互作用，并且親環(huán)素已開發(fā)出免疫療法制劑——親環(huán)素A[70]；磷酸烯醇丙酮酸激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)，其中PEPCK涉及多個(gè)通路，如內(nèi)分泌功能、排泄和糖代謝等[13]。在免疫逃避方面，成蟲通過不斷脫落表皮，從而逃避宿主的免疫反應(yīng)[12]。通路分析發(fā)現(xiàn)成蟲能夠通過有氧和無氧糖酵解兩種方式產(chǎn)生ATP[13]。2015年，Y. Wang等對成蟲進(jìn)行了ES產(chǎn)物和抗原性蛋白的分析，鑒定了9個(gè)ES蛋白和13個(gè)抗原性蛋白，其中6個(gè)抗原性蛋白為首次發(fā)現(xiàn)，此研究豐富了E.g蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，對宿主與寄生蟲相互作用和寄生蟲生存機(jī)制的研究提供了相關(guān)信息，對E.g的疫苗候選分子和診斷標(biāo)志物的篩選提供了幫助[15]。

2.3　細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲蛋白質(zhì)組學(xué)差異

隨著在2013年關(guān)于E.g和多房棘球絳蟲(Echinococcusmoltilocularis,E.m)全基因組序列的發(fā)布[19-20]，為E.g和E.m的蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了重要的基礎(chǔ)。

雖然E.g和E.m同屬于棘球?qū)?，蛋白質(zhì)具有較高的同源性，但也存在一定的差異。通過對人體內(nèi)的細(xì)粒棘球蚴和多房泡球蚴蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的蛋白質(zhì)濃集在相對分子質(zhì)量72 ku處，囊壁的蛋白質(zhì)濃集在17、26和72 ku處，囊液的蛋白質(zhì)濃集在17、26、43～55和72 ku；泡球蚴總蛋白質(zhì)濃集在26、55～72和72 ku處[71]。和E.g相似，對E.m的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，也發(fā)現(xiàn)一些在疫苗研發(fā)、診斷標(biāo)志物篩選及藥物靶標(biāo)篩選中具有潛力的蛋白質(zhì)，如Em2、EmⅡ/3、Em10、Em18、Ag5、AgB、Em70、Em90及EmY162等，其中由Em10構(gòu)建的Pcd-Em10核酸疫苗免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)對E.m原頭節(jié)攻擊具有保護(hù)性免疫反應(yīng)[72]；Em70和Em90具有潛在的多房棘球蚴病血清學(xué)診斷價(jià)值[73]；EmY162在診斷E.m成蟲的感染方面具有一定的價(jià)值[74]。

3　存在的問題

由于目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的相關(guān)技術(shù)限制，在對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離時(shí)，蛋白質(zhì)會出現(xiàn)一定量的損失，特別是對于低豐度蛋白質(zhì)，可能出現(xiàn)分離不到的情況，而某些低豐度蛋白質(zhì)對E.g功能起重要作用，另外，在棘球蚴階段，包囊液中存在大量的宿主蛋白質(zhì)，對寄生蟲蛋白質(zhì)組學(xué)分析干擾較大，如何克服這一特性還需要在相關(guān)技術(shù)上進(jìn)行改進(jìn)；目前對于E.g蛋白質(zhì)組學(xué)的分析大多集中在棘球蚴和成蟲階段，特別是在棘球蚴階段研究較為集中，而對其他階段的研究比較少，如果要全面了解E.g完整的蛋白質(zhì)表達(dá)變化，以及診斷試劑、疫苗和藥物的開發(fā)，傳播階段的研究不可或缺；缺少系統(tǒng)性E.g的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，E.g為多宿主寄生蟲，當(dāng)寄生的宿主不同，寄生的部位不同，發(fā)育階段不同，以及宿主環(huán)境變化都會引起E.g蛋白質(zhì)的變化，系統(tǒng)性了解E.g蛋白質(zhì)組學(xué)，對于預(yù)防、診斷和治療E.g引起的人獸共患病有著重要意義；在對E.g進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析之后，數(shù)據(jù)的處理同樣重要，例如基因功能聚類分析、通路富集分析等，而目前相關(guān)研究較少。

4　展　望

鑒定蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基礎(chǔ)，雖然近些年隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的進(jìn)步，已鑒定出了許多種E.g蛋白質(zhì)，但并沒有全覆蓋E.g的蛋白質(zhì)，未鑒定的蛋白質(zhì)還有很多，并且已鑒定出的蛋白質(zhì)許多僅僅是推測，因此E.g蛋白質(zhì)的鑒定任重道遠(yuǎn)。

“工欲善其事，必先利其器”，蛋白質(zhì)組學(xué)研究中涉及到的技術(shù)手段有限，常見且主要的有2-DE、MS、WB，因此技術(shù)上的改進(jìn)與創(chuàng)新顯得相當(dāng)重要，例如在2-DE主要的作用是將蛋白質(zhì)根據(jù)等電點(diǎn)和質(zhì)量進(jìn)行分離，但對于豐度較小的蛋白質(zhì)分離效果較差；目前，MS已不單單是一種技術(shù)，而是一套技術(shù)，通過與其他技術(shù)的聯(lián)合使用以及自身的創(chuàng)新，已發(fā)展出許多衍生的技術(shù)。

隨著絳蟲屬寄生蟲蛋白質(zhì)組學(xué)研究的推進(jìn)，通過數(shù)據(jù)比對發(fā)現(xiàn)，很多蛋白質(zhì)是一種或多種寄生蟲共有，有利于疫苗研發(fā)和藥物靶標(biāo)的篩選，可以利用一種蛋白質(zhì)對多種寄生蟲進(jìn)行預(yù)防和治療，但在免疫診斷方面會產(chǎn)生非特異性的結(jié)果，因此要對現(xiàn)有絳蟲蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，發(fā)現(xiàn)寄生蟲特有的蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，將對寄生蟲的疫苗研發(fā)、藥物靶標(biāo)篩選和免疫診斷起到促進(jìn)作用。

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