HPLC法測(cè)定紅羚清散中西紅花苷I和西紅花苷II的含量

★袁娟麗 劉明智 張鈺祺（萍鄉(xiāng)市食品藥品檢驗(yàn)所 江西　萍鄉(xiāng)　337000）

紅羚清散是萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院應(yīng)用多年的純中藥制劑，是依據(jù)仲景《傷寒論》六經(jīng)辨證理論衍化而來(lái)，具有平肝祛風(fēng)，清熱鎮(zhèn)驚，解毒的作用。主要用于熱盛、神昏，譫語(yǔ)發(fā)狂，驚癇抽搐，目赤頭痛等癥。紅羚清散主要由羚羊角、西紅花2味中藥組成。目前，紅羚清散的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《江西省食品藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑》GZJ-0289-（1）-2006，檢驗(yàn)項(xiàng)目包括“性狀”“鑒別”“檢查”等，暫無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)。為進(jìn)一步保證該制劑的臨床療效，有效控制其質(zhì)量，提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)選取紅羚清散中西紅花的主成分西紅花苷I和西紅花苷II為定量指標(biāo)，采用高效液相色譜法，對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定方法的研究。

1　儀器與試藥

高效液相色譜儀（Agilent 1200四元低壓梯度泵系列，Agilent1200化學(xué)工作站，DAD檢測(cè)器）；西紅花苷I對(duì)照品（Stanford Chemicals，批號(hào)：PR151116-08，含量以98.52%計(jì)），西紅花苷II對(duì)照品（Stanford Chemicals，批號(hào)：PR160225-17，含量以98.61%計(jì)）。水為超純水，甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用樣品由萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院提供。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件 Agilent 5 TC-C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相：甲醇-水（49∶51），檢測(cè)波長(zhǎng)為440nm；流速：1.0mL/min；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為10μL。理論板數(shù)按西紅花苷I峰計(jì)算均應(yīng)不低于3500。

2.2溶液制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 取西紅花苷I對(duì)照品、西紅花苷II對(duì)照品適量，精密稱定，分別加稀乙醇制成每1mL含20μg和5μg的溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 取本品約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇10mL，稱定重量，冰浴超聲處理（功率500W，頻率40KHz）20min，放冷，稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白溶劑，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，比較供試品溶液色譜、混合對(duì)照品色譜及空白溶劑色譜，結(jié)果供試品中西紅花苷I和西紅花苷II色譜峰有較好的色譜分離，見(jiàn)圖1。

2.3.2線性關(guān)系考察 精密稱取西紅花苷I對(duì)照品9.93mg，置50mL量瓶中，加稀乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為西紅花苷I對(duì)照品母液；取母液逐級(jí)稀釋成4.8915，9.7830，19.5661，23.4793，39.1321μg/mL的溶液，精密吸取上述對(duì)照品溶液及西紅花苷I對(duì)照品母液10μL注入液相色譜儀，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為Y=58.91X-4.1531，r=0.9999，結(jié)果西紅花苷I在4.8915～195.6607μg/mL之間呈良好線性關(guān)系。

另精密稱取西紅花苷II對(duì)照品9.82mg，置50mL量瓶中，加稀乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為西紅花苷II對(duì)照品母液。取母液逐級(jí)稀釋成0.9684，1.9367，3.8734，7.7468，19.3670μg/mL的溶液，精密吸取上述對(duì)照品溶液及西紅花苷II對(duì)照品母液10μL注入液相色譜儀，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為Y=73.687X-3.0682，r=0.99981，結(jié)果西紅花苷II在0.9684～193.6700μg/mL之間呈良好線性關(guān)系。

圖1　高效液相色譜圖

2.3.3精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品（西紅花苷I對(duì)照品溶液19.5661μg/mL、西紅花苷II對(duì)照品溶液3.8734μg/mL），按2.1項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果西紅花苷I峰面積RSD為1.70%；西紅花苷II峰面積RSD為2.89%。表明精密度良好。

2.3.4重復(fù)性試驗(yàn) 取同批樣品（批號(hào)20151106），照2.3項(xiàng)下平行制備供試品溶液6份，照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果西紅花苷IRSD為2.34%；西紅花苷IIRSD為1.80%，表明此方法的重復(fù)性良好。

2.3.5加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的本品（批號(hào)20151106）約0.25g，置具塞錐形瓶中，精密添加混合對(duì)照品溶液（西紅花苷I對(duì)照品：19.6449μg/mL，西紅花苷II對(duì)照品：4.4769μg/mL）10mL，按2.1項(xiàng)下方法試驗(yàn)，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1-2。

表1　西紅花苷I回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表2　西紅花苷II回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.3.6穩(wěn)定性 精密吸取供試品溶液（批號(hào)20151106），分別在0、2、4、6、8、12h進(jìn)樣，按2.1項(xiàng)下色譜條件記錄西紅花苷I和西紅花苷II的峰面積，結(jié)果供試品溶液中西紅花苷I和西紅花苷II在12h內(nèi)峰面積無(wú)明顯變化，西紅花苷I RSD為0.79%（n=6），西紅花苷II RSD為0.1.34%（n=6），表明樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7樣品測(cè)定 取本品5批，照2.1項(xiàng)下方法試驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　樣品測(cè)定結(jié)果（n=5）　mg/g

3　討論

3.1色譜條件的選擇 參考中國(guó)藥典［1］及有關(guān)文獻(xiàn)［3］，選擇440nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，甲醇-水（49∶51）為流動(dòng)相，在此條件下，各組分的峰型及分離效果良好，同時(shí)未見(jiàn)其他成分干擾。

3.2供試品溶液的制備 參考中國(guó)藥典［1］，采用超聲提取法，以稀乙醇為提取溶劑。分別對(duì)10min、20min、30min提取時(shí)間進(jìn)行比較，結(jié)果表明20min已提取完全。同時(shí)，因西紅花苷穩(wěn)定性差，且對(duì)溫度非常敏感［10］，分別對(duì)供試品在冰浴中和常溫下超聲處理方法進(jìn)行了對(duì)比研究。結(jié)果表明，冰浴比常溫提取所測(cè)得的西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ含量略高，故采用冰浴超聲提取作為紅羚清散中西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的提取方法。此外，考察了避光條件下與未避光條件下操作，最后確定供試品溶液制備應(yīng)避光操作，并置于棕色瓶中避光保存。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，不同批次樣品中西紅花苷I與西紅花苷II含量差異顯著，提示西紅花原藥材的質(zhì)量存在差別，為避免由原藥材引起中成藥的療效差異，有必要對(duì)西紅花進(jìn)行質(zhì)量控制。本研究建立了同時(shí)測(cè)定紅羚清散中西紅花苷I與西紅花苷II含量的HPLC方法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法準(zhǔn)確、快速，操作簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，可用于紅羚清散的質(zhì)量控制。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典·一部[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015:129-130.

［2］周素娣,仲惠娟. HPLC測(cè)定西紅花提取物及其片劑中各西紅花苷含量[J]. 藥物分析雜志, 1998, 18(3):159-162.

［3］楊博涵,朱旭江. HPLC法測(cè)定藏藥仁青芒覺(jué)膠囊中西紅花苷-I和西紅花苷-II的含量[J]. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥, 2015, 24(20):159-162.

［4］馬慧萍,李蘭茹,董志臣,等. HPLC法測(cè)定紅花益氣養(yǎng)血膠囊中西紅花苷-I和西紅花苷-II的含量[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào), 2013,29(6):512-514.

［5］戴智慧, 黃士文，倪穗， 等. HPLC法測(cè)定浙江慈溪水稻田栽培的西紅花中西紅花苷I、II含量的研究[J]. 中國(guó)野生植物資源, 2016,35(2):14-18.

［6］劉瑛,張浩. RP-HPLC法測(cè)定梔子中西紅花苷-1和西紅花總苷含量[J]. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥, 2007, 89(6):337-339.

［7］張蕾,周幗維,周素娣.不同引種產(chǎn)地西紅花的含量測(cè)定[J]. 中國(guó)中藥雜質(zhì), 1997, 22(11):657-659.

［8］何常明,謝曉梅,何美蓮,等. 西紅花中西紅花苷-1和西紅花苷-2含量測(cè)定方法的建立[J]. 藥物分析雜志, 2006, 26(9):1 270-1 273.

［9］金春女,李云峰. 西紅花的真?zhèn)舞b別及主要成分西紅花苷I、II的含量測(cè)定[J]. 中醫(yī)中藥, 2014, 28(15):188-189.

［10］付小梅,王崢濤．西紅花苷-Ⅰ的穩(wěn)定性研究[J].食品科學(xué),2012, 33(5):71-73．