結(jié)球甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)條件優(yōu)化及高代自交系胚狀體誘導(dǎo)研究

蘇賀楠　韓風(fēng)慶　楊麗梅　莊　木　張揚(yáng)勇　王　勇　李占省　方智遠(yuǎn)　呂紅豪

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100081）

結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleraceaL. var.capitataL.）是世界各地廣泛種植的十字花科蕓薹屬蔬菜作物，在我國的年栽培面積已達(dá)到90萬hm2（楊麗梅 等，2016）。結(jié)球甘藍(lán)具有明顯的雜種優(yōu)勢，目前生產(chǎn)上的主栽品種幾乎均為一代雜種，雜交育種已成為結(jié)球甘藍(lán)育種的主要方式（楊麗梅 等，2003）。培育一代雜種，首先要獲得遺傳穩(wěn)定的高代自交系，傳統(tǒng)育種需要7～8 a的時間，而利用小孢子培養(yǎng)可以在2 a內(nèi)獲得純合的育種材料，加速自交系的選育過程；同時，隱性性狀易于表達(dá)，豐富了育種資源。

游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)是在花藥培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的一種單倍體誘導(dǎo)技術(shù)，減少了花藥壁和絨氈層對培養(yǎng)結(jié)果的影響，培養(yǎng)出的單倍體植株經(jīng)自然加倍或者秋水仙素誘導(dǎo)加倍形成純合的雙單倍體植株（double haploid，DH）（Yuan et al.，2015）。DH群體是進(jìn)行遺傳分析、圖譜構(gòu)建和基因定位的理想材料，而經(jīng)過鑒定獲得的優(yōu)良DH系也為雜交育種提供了良好的材料基礎(chǔ)（孫繼峰 等，2012；Lv et al.，2014a，2014b；Liu et al.，2017）。自Lichter首次在油菜中利用小孢子培養(yǎng)獲得單倍體植株以來，在隨后的30 a間各國學(xué)者對這一技術(shù)進(jìn)行了深入的研究，并已在多數(shù)十字花科蔬菜包括大白菜、結(jié)球甘藍(lán)中獲得了胚狀體（Lichter，1982；Takahata et al.，1991；Ver ó nica et al.，2015；Mukhlesur & Monika，2016）。

在結(jié)球甘藍(lán)中，近幾年國內(nèi)外學(xué)者從基因型（Takahashi et al.，2012；Shumilina et al.，2015）、供體植株的生長環(huán)境、小孢子發(fā)育時期（王五宏等，2013；王玉書 等，2015）、預(yù)處理條件（張振超 等，2013；Shmykova et al.，2016）、培養(yǎng)條件（戴希剛 等，2012）、植株再生、倍性鑒定及染色體加倍（程芳芳 等，2015；祁魏崢 等，2015）等方面對游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了研究和改進(jìn)，使得一部分基因型的小孢子出胚率在原有基礎(chǔ)上得到了提高。然而，結(jié)球甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)仍存在一些問題：頑固難出胚基因型材料依然較多，因而培養(yǎng)條件和體系仍有待優(yōu)化；研究材料大多集中在一代雜種上，關(guān)于高代自交系出胚的研究很少，因而利用差異大的高代自交系材料構(gòu)建群體、挖掘出胚相關(guān)基因的研究鮮見報道。

本試驗(yàn)擬通過對25份結(jié)球甘藍(lán)材料的花蕾長度及形態(tài)參數(shù)、花期和活性炭等影響小孢子胚狀體發(fā)生因素和雄配子發(fā)育過程進(jìn)行研究，進(jìn)一步優(yōu)化小孢子培養(yǎng)體系；對高代自交系進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，篩選出胚率差異較大的親本材料，為下一步構(gòu)建分離群體、挖掘出胚率相關(guān)基因和相關(guān)分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

參試材料為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所甘藍(lán)青花菜課題組提供的25份結(jié)球甘藍(lán)材料，包括一代雜種5份、高代自交系20份，材料名稱及類型詳見表1。

2016年8月20日在本所試驗(yàn)基地大棚內(nèi)穴盤播種育苗，11月10日將半成株囤到陽畦越冬春化，2017年2月25日定植到日光溫室中，常規(guī)栽培管理；2017年4月上旬至5月上旬花期取材培養(yǎng)。

1.2　小孢子分離與培養(yǎng)

小孢子的分離與培養(yǎng)參照袁素霞（2009）和呂紅豪（2011）的方法并加以改進(jìn)。① 取材：分別取長度為3.0～3.5 mm的花蕾，先用70%酒精滅菌30 s，再用7%次氯酸鈉滅菌12 min，無菌水清洗3次，每次3 min。② 游離：把滅過菌的花蕾放入10 mL玻璃試管內(nèi)，加入少量經(jīng)高溫高壓滅菌的B5培養(yǎng)基（購自Phytotechnology Laboratories）后研磨，使小孢子游離出來，用孔徑45 μm的尼龍篩網(wǎng)過濾到離心管中。再添加適量B5培養(yǎng)基，800 r?min-1離心5 min，棄上清液；重復(fù)3次。加入適量經(jīng)抽濾滅菌的NLN培養(yǎng)基（購自Phytotechnology Laboratories，pH=5.9），用血球計數(shù)板調(diào)整小孢子懸浮液濃度為1×105個?mL-1。③ 培養(yǎng)：將小孢子懸浮液分裝進(jìn)規(guī)格為60 mm×15 mm的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿3 mL，加入1滴經(jīng)高溫高壓滅菌的0.5 g?L-1活性炭，封口并在黑暗條件下32 ℃熱激24 h，隨后在25 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)。④ 出胚：經(jīng)過21 d左右，小孢子出胚，統(tǒng)計出胚率（個?蕾-1）。每份材料設(shè)置3次重復(fù)，每重復(fù)3個培養(yǎng)皿。

1.3　花蕾形態(tài)參數(shù)與游離小孢子發(fā)育時期的關(guān)系

以01-88為試驗(yàn)材料觀察結(jié)球甘藍(lán)花粉配子體發(fā)育過程。選取不同長度（2.5、3.0、3.5、4.0、5.0 mm）的花蕾放入FAA固定液中，32 h之后進(jìn)行石蠟切片，觀察花粉配子體發(fā)育過程。① 脫水：50%、70%、85%、95%、100%乙醇，處理時間分別為 0.5 h、0.5 h、0.5 h、0.5 h、20 min。② 透明：將脫水后的材料依次置于1/2二甲苯+1/2無水乙醇、純二甲苯、純二甲苯中，處理時間分別為0.5 h、1.0 h、0.5 h。③ 透蠟：將透明好的材料放入少量二甲苯，加入石蠟蠟屑，放入37 ℃恒溫箱，過夜，敞口放置，使其中的二甲苯慢慢揮發(fā)。④ 換蠟：第2天倒出石蠟、二甲苯混合液，在65 ℃烘箱中進(jìn)行，加入已經(jīng)熔化的純蠟，間隔2 h換1次，共換2次。⑤ 包埋：在60 ℃烘箱中進(jìn)行，將融化的石蠟倒入預(yù)熱的紙盒內(nèi)，將透好蠟的材料擺放在熔蠟中，輕輕將蠟盒平移到室溫環(huán)境中，待紙盒內(nèi)底層蠟稍凝固，用預(yù)熱的鑷子將材料直立整齊地排列在軟蠟層上，待材料固定不再飄動后，將蠟盒平移到冷水中待完全凝固。⑥ 切片：用Leica輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片，厚度為10 μm。⑦ 貼片與烘片：用玻璃棒輕蘸1小滴粘片劑，涂抹均勻，貼片時蒸餾水用量為1～2滴，烘片臺溫度設(shè)置為39 ℃。⑧ 脫蠟：把烘干的切片放入二甲苯中，每次5 min，共2次。⑨ 甲苯胺藍(lán)染色，顯微鏡照相觀察。設(shè)置3次重復(fù)，每次選取3個花蕾。

以中甘628和01-88為試驗(yàn)材料，分別選取主花序，將花蕾依照長度（2.5、3.0、3.5、4.0、5.0 mm）分為5個組別，每個組別中隨機(jī)選取3個花蕾，測定花蕾長度，計算花藥長度/花瓣長度的比值；用小鑷子挑開花蕾，小心擠出少量花粉，均勻鋪平于載玻片上，利用顯微鏡觀察小孢子的發(fā)育時期與花蕾長度的相關(guān)性。

1.4　基因型對游離小孢子培養(yǎng)出胚率的影響

在相同適宜條件下（pH值為5.9的NLN培養(yǎng)基，32 ℃熱激24 h，0.5 g?L-1的活性炭1滴）對25份結(jié)球甘藍(lán)材料進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，21 d后統(tǒng)計出胚率。設(shè)置3次重復(fù)，每重復(fù)3個培養(yǎng)皿。

1.5　不同花期與游離小孢子培養(yǎng)出胚率的關(guān)系

以中甘628和01-88為試驗(yàn)材料，分別于初花期、盛花期和末花期取花蕾進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)（pH值為5.9的NLN培養(yǎng)基，32 ℃熱激24 h，0.5 g?L-1的活性炭1滴），21 d后統(tǒng)計出胚率。設(shè)置3次重復(fù)，每次每份材料選取3個花蕾。

初花期是指主枝的花朵開放時期（3月下旬至4月上旬），盛花期是指大部分側(cè)枝頂部花朵開放時期（4月上旬至4月下旬），末花期指側(cè)枝花朵全開放至花蕾停止發(fā)育（4月下旬至5月中旬）。

1.6　活性炭濃度對游離小孢子培養(yǎng)出胚率的影響

以中甘628和01-88為試驗(yàn)材料，在相同適宜條件下（pH值為5.9的NLN培養(yǎng)基，32 ℃熱激24 h）分別添加0.25、0.50 g?L-1活性炭，以不添加活性炭的處理為對照，進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，21 d后統(tǒng)計出胚率。設(shè)置3次重復(fù)，每處理3個培養(yǎng)皿。

1.7　數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，利用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制。

2　結(jié)果與分析

2.1　基因型對結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)出胚率的影響

由表1和圖1可以看出，供試的25份結(jié)球甘藍(lán)材料中，有11個基因型產(chǎn)生了胚狀體，都是春甘藍(lán)圓球類型，而秋甘藍(lán)扁球類型均未出胚。一代雜種中，中甘628為最易出胚材料，平均出胚率高達(dá)19.8個?蕾-1，極顯著高于其他品種；中甘828、中甘23、中甘192未有胚狀體產(chǎn)生。在20份高代自交系中，01-88為最易出胚材料，平均出胚率高達(dá)47.5個?蕾-1，極顯著高于其他自交系；084、96-100-312等11份材料未出胚。

中甘628是高代自交系87-534與SG643的雜交F1，其出胚率為19.8個?蕾-1，極顯著高于兩個親本自交系的出胚率（0.3、2.6個?蕾-1）；中甘828是高代自交系87-534與96-100-312的雜交F1，其出胚率為0個?蕾-1，其親本自交系的出胚率為0.3、0個?蕾-1。由此可見，不同結(jié)球甘藍(lán)材料中胚誘導(dǎo)相關(guān)基因的遺傳和分子機(jī)制可能不同。

2.2　花蕾長度及形態(tài)參數(shù)與結(jié)球甘藍(lán)小孢子發(fā)育時期的關(guān)系

由圖2可知：花粉母細(xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂后形成四分體（圖2-a）；早期小孢子體積增大，顏色加深，細(xì)胞核位于中央，屬于單核早期（圖2-b）；隨后，細(xì)胞核移向細(xì)胞壁，花粉萌發(fā)溝清晰可見，此時呈不明顯的三棱狀，此階段是單核靠邊期（圖2-c）；小孢子細(xì)胞核進(jìn)行1次有絲分裂，形成1個生殖核和1個營養(yǎng)核，進(jìn)入雙核期（圖2-d）。

表1　不同基因型對結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)出胚率的影響

圖1　部分結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)出胚情況

花粉的發(fā)育時期是影響小孢子最終出胚量的關(guān)鍵因素之一，花粉發(fā)育時期的選擇與植株花蕾的長度及形態(tài)參數(shù)密切相關(guān)，單核靠邊期即單核晚期是結(jié)球甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)的最適時期，此時小孢子形態(tài)呈現(xiàn)出不明顯三棱狀。切片后在顯微鏡下觀察結(jié)球甘藍(lán)不同大小花蕾的花粉細(xì)胞發(fā)育時期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個不同基因型中甘628和01-88表現(xiàn)相似。由表2可知，當(dāng)花蕾長度在3.0～3.5 mm之間、花藥長度∶花瓣長度為3∶2至2∶1時，處于單核靠邊期的小孢子占67%～71%，利于游離小孢子培養(yǎng)出胚。

圖2　01-88花粉配子體發(fā)育途徑

表2　結(jié)球甘藍(lán)不同長度花蕾中單核靠邊期小孢子的比例

2.3　不同花期對結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)出胚率的影響

由表3可知，兩種不同基因型的結(jié)球甘藍(lán)出胚率最高時的取蕾時期不同，其中一代雜種中甘628在初花期的出胚率最高，達(dá)19.8個?蕾-1，自交系01-88在盛花期的出胚率最高，達(dá)47.5個?蕾-1；兩種基因型出胚率最低的取蕾時期都在末花期，分別為0.3、0.7個?蕾-1；初花期和盛花期取蕾的出胚率極顯著高于末花期，說明初花期和盛花期是游離小孢子培養(yǎng)的適宜時期。

表3　取蕾時期對結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)出胚率的影響

2.4　活性炭濃度對結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)出胚率的影響

從表4可以看出，對兩種不同基因型結(jié)球甘藍(lán)來說，在培養(yǎng)基中加入0.25、0.50 g?L-1的活性炭后，游離小孢子出胚率都極顯著提高，中甘628出胚率分別達(dá)到12.0、19.8個?蕾-1，01-88出胚率分別達(dá)到35.3、47.5個?蕾-1；兩種不同濃度的活性炭處理之間游離小孢子出胚率差異未達(dá)極顯著水平，說明適當(dāng)濃度的活性炭可以提高結(jié)球甘藍(lán)小孢子胚誘導(dǎo)率。

表4　不同濃度活性炭對結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)出胚率的影響

3　結(jié)論與討論

游離小孢子培養(yǎng)是提高育種效率、豐富育種資源的重要手段，獲得的DH群體也是進(jìn)行遺傳分析、圖譜構(gòu)建和基因定位的理想材料。近年來，結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)取得了較大進(jìn)展，但仍存在一些問題，如培養(yǎng)體系不夠完善、胚誘導(dǎo)的相關(guān)分子機(jī)制尚不明確等，阻礙了小孢子培養(yǎng)技術(shù)在育種中的進(jìn)一步應(yīng)用。

在培養(yǎng)體系方面，研究表明影響小孢子培養(yǎng)成胚的關(guān)鍵因素包括基因型、取蕾時期、活性物質(zhì)等?；蛐褪怯绊懶℃咦优囵B(yǎng)出胚的關(guān)鍵因素，不同基因型之間出胚率差異較大，供體植株的基因型不僅影響小孢子的產(chǎn)胚率，而且也影響胚的質(zhì)量（王超楠 等，2010；顧祥昆 等，2013）。以往有關(guān)研究著重介紹了一代雜種的出胚率，桑玉芳等（2007）比較分析了19個結(jié)球甘藍(lán)一代雜種游離小孢子的出胚情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)出胚率＞1個?蕾-1的品種只有10個；關(guān)于自交系材料研究較少，楊安平等（2009）分別用25份結(jié)球甘藍(lán)F1及其50份親本，產(chǎn)胚困難的22份結(jié)球甘藍(lán)F1及其相應(yīng)的F2，1份產(chǎn)胚能力強(qiáng)的結(jié)球甘藍(lán)與22份產(chǎn)胚困難材料的正、反交后代，在同等條件下進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)球甘藍(lán)F1較其親本產(chǎn)胚能力強(qiáng)，對產(chǎn)胚困難的結(jié)球甘藍(lán)F1，以其F2為試材可誘導(dǎo)產(chǎn)胚或提高胚產(chǎn)量，用產(chǎn)胚能力強(qiáng)的結(jié)球甘藍(lán)作親本與產(chǎn)胚困難的材料雜交，正、反交均能明顯提高產(chǎn)胚困難材料的產(chǎn)胚能力。本試驗(yàn)以25份不同基因型結(jié)球甘藍(lán)為試材（其中有20份高代自交系），在相同適宜培養(yǎng)條件下進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有11個基因型（2份一代雜種和9份高代自交系）產(chǎn)生了胚狀體，且不同材料之間小孢子出胚率差異顯著，中甘628的出胚率極顯著高于兩個親本自交系87-534與SG643，可見以產(chǎn)胚率較高的結(jié)球甘藍(lán)作親本與產(chǎn)胚困難的材料雜交，能明顯提高雜交后代的產(chǎn)胚能力，這與前人的研究結(jié)果相似。

在十字花科蔬菜花藥和游離小孢子培養(yǎng)中，單核期和雙核早期通常認(rèn)為是小孢子最適培養(yǎng)的時期（星曉蓉，2011），而不同花蕾的大小對應(yīng)著小孢子不同的發(fā)育時期，選擇最佳花蕾長度非常關(guān)鍵。因此，本試驗(yàn)采用石蠟切片技術(shù)對結(jié)球甘藍(lán)配子體發(fā)育進(jìn)行了詳細(xì)觀察，分別觀察到四分體時期、單核早期、單核晚期、雙核期，并明確了關(guān)鍵時期（單核期和雙核早期）與花蕾長度和花藥、花瓣長度比值之間的對應(yīng)關(guān)系，為選取取樣最適時期的花蕾提供了細(xì)胞學(xué)依據(jù)。曾愛松等（2015）利用DAPI染色對甘藍(lán)花粉發(fā)育途徑進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)6個品種的花蕾長度基本在3.5～4.5 mm范圍內(nèi)處于單核靠邊期的小孢子比例最高。本試驗(yàn)對2個易出胚的甘藍(lán)材料進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)花蕾長度在3.0～3.5 mm之間，且花藥長度∶花瓣長度為3∶2至2∶1時，處于單核靠邊期的小孢子比例最高，該結(jié)果中適宜的花蕾長度較前人研究中的稍短，可能與基因型不同有關(guān)。

取蕾時期也是影響結(jié)球甘藍(lán)小孢子出胚率的重要因素之一。馮輝等（2007）對羽衣甘藍(lán)的研究發(fā)現(xiàn)，盛花期是最適宜的取蕾時期；曾愛松等（2010）研究認(rèn)為，結(jié)球甘藍(lán)取蕾時期對易出胚和難出胚的材料影響不一致，對于易出胚材料，花期對胚胎發(fā)生影響不大，出胚率都基本穩(wěn)定，對于難出胚材料，開花初期至盛花中期取樣培養(yǎng)易獲得成功，而末花期很少有胚狀體產(chǎn)生。本試驗(yàn)利用2個易出胚基因型進(jìn)行花期對小孢子培養(yǎng)出胚率影響的研究，結(jié)果表明2個基因型出胚率最高的花期不同，一代雜種中甘628在初花期出胚率最高，達(dá)19.8個?蕾-1，高代自交系01-88在盛花期出胚率最高，達(dá)47.5個?蕾-1，二者出胚率最低時期一致。

在培養(yǎng)基中添加一些活性成分會影響小孢子的產(chǎn)胚能力。蔣武生等（2008）在大白菜游離小孢子培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)添加活性炭（0.5 mg?L-1）較未添加活性炭的對照培養(yǎng)效果好，兩個處理小孢子胚誘導(dǎo)率相差4～17倍；韓陽等（2006）在大白菜游離小孢子培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)100、200 mg?L-1活性炭對大白菜小孢子的胚胎發(fā)生有抑制作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，加入0.25、0.50 g?L-1活性炭均有利于結(jié)球甘藍(lán)胚狀體發(fā)生，這可能與活性炭能吸附培養(yǎng)過程中的部分有害物質(zhì)有關(guān)。

目前，關(guān)于小孢子培養(yǎng)出胚相關(guān)分子機(jī)制的研究很少，Malik等（2007）通過構(gòu)建cDNA文庫從甘藍(lán)型油菜0 h（晚無核到早期雙核小孢子）、3 d（32℃熱激處理誘導(dǎo)小孢子）、5 d（分裂小孢子）和7 d（胚性小孢子）小孢子中分離出來LEC1、LEC2、BBM，這3個基因在小孢子胚胎形成時起著重要的作用。Kitashiba等（2016）利用高出胚大白菜品種Ho-Me和低出胚大白菜品種CR-Seiga構(gòu)建小孢子群體，利用偏分離確定與小孢子胚胎發(fā)生相關(guān)的基因位點(diǎn)，確定了3個與小孢子培養(yǎng)胚產(chǎn)量相關(guān)物理位置。然而在結(jié)球甘藍(lán)中還未見與小孢子胚胎發(fā)生相關(guān)的基因及分子機(jī)制研究，本試驗(yàn)得到的高、低出胚自交系材料為下一步開展甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)出胚機(jī)制的研究打下了基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)從基因型、取蕾時期、活性物質(zhì)等方面進(jìn)一步探討和優(yōu)化了結(jié)球甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)的條件；獲得的純合DH系為育種提供了材料；獲得的出胚率差異大的自交系也為下一步構(gòu)建群體、挖掘胚誘導(dǎo)相關(guān)基因及分子機(jī)制的研究做好了鋪墊，進(jìn)一步的工作正在開展中。

程芳芳，張恩慧，楊安平，程永安，許忠民，董韓，霍柳青．2015．甘藍(lán)小孢子單倍體植株加倍技術(shù)探討．西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，43（6）：167-173．

戴希剛，施雪萍，包滿珠．2012．基因型與培養(yǎng)條件對羽衣甘藍(lán)小孢子胚胎發(fā)生的影響．植物生理學(xué)報，48（11）：1113-1119．馮輝，姜鳳英，馮建云，王超楠．2007．羽衣甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究及應(yīng)用．園藝學(xué)報，34（4）：1019-1022．

顧祥昆，李菲，張淑江，章時蕃，張慧，孫日飛．2013．芥菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究．中國蔬菜，（12）：23-30．

韓陽，葉雪凌，馮輝．2006．大白菜小孢子培養(yǎng)影響因素研究．中國蔬菜，（7）：16-18．

蔣武生，姚秋菊，張曉偉，原玉香，耿建峰．2008．活性炭和振蕩培養(yǎng)對提高大白菜胚誘導(dǎo)率的影響．中國瓜菜，21（4）：1-3．

呂紅豪．2011．甘藍(lán)枯萎病抗源篩選和抗性遺傳研究〔碩士論文〕．北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院．

祁魏崢，頡建明，郁繼華，康俊根．2015．甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)及再生植株倍性鑒定研究．西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，28（6）：2381-2388．

桑玉芳，張恩慧，楊安平，馬超，許忠民，程永安，白延紅．2007．甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)中影響胚狀體形成的主要因素．西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，16（2）：125-129．

孫繼峰，劉玉梅，方智遠(yuǎn)，劉二艷，袁素霞，李占省，楊麗梅，莊木，張揚(yáng)勇，孫培田．2012．青花菜相同親本的DH與F2群體遺傳多樣性的比較．園藝學(xué)報，39（6）：1090-1098．

王超楠，聞鳳英，劉曉暉，羅智敏，趙冰．2010．球莖甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)中影響胚誘導(dǎo)的幾個因素．中國蔬菜，（10）：35-39．

王五宏，葉國銳，李必元，岳智臣，鐘新民．2013．結(jié)球甘藍(lán)小孢子胚誘導(dǎo)與植株再生．核農(nóng)學(xué)報，27（6）：715-722．

王玉書，王歡，范震宇，馮輝．2015．觀賞羽衣甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)及再生植株倍性變異．核農(nóng)學(xué)報，29（6）：1037-1043．

星曉蓉．2011．白菜型油菜小孢子培養(yǎng)成胚率及植株再生的影響因素．西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，20（7）：94-97．

楊安平，張恩慧，尚麗榮，朱守亮，李宏偉，許忠民，白延紅．2009．結(jié)球甘藍(lán)F1、F2、雙交種及其親本的游離小孢子胚胎發(fā)生能力分析．西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，37（8）：171-176．

楊麗梅，方智遠(yuǎn)，劉玉梅，莊木，張揚(yáng)勇，孫培田．2003．利用小孢子培養(yǎng)選育甘藍(lán)自交系．中國蔬菜，（6）：36-37．

楊麗梅，方智遠(yuǎn)，莊木，張揚(yáng)勇，呂紅豪，劉玉梅，李占?。?016．“十二五”我國甘藍(lán)遺傳育種研究進(jìn)展．中國蔬菜，（11）：1-6．

袁素霞．2009．甘藍(lán)和青花菜小孢子培養(yǎng)及早期胚胎形成相關(guān)基因差異表達(dá)分析〔博士論文〕．北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院．

曾愛松，馮翠，高兵，宋立曉，嚴(yán)繼勇．2010．結(jié)球甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系的優(yōu)化研究．華北農(nóng)學(xué)報，25（S2）：40-44．

曾愛松，高兵，宋立曉，張云霞，李健綺，嚴(yán)繼勇．2015．耐寒結(jié)球甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)及其發(fā)育過程．中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，20（2）：86-92．

張振超，耿鑫鑫，戴忠良，潘躍平，王兵，許玲，顏志明，周偉軍．2013．甘藍(lán)類植物小孢子培養(yǎng)及植株再生研究．核農(nóng)學(xué)報，27（7）：929-937．

Kitashiba H，Taguchi K，Kaneko I，Inaba K，Yokoi S J，Takahata Y，Nishio T．2016．Identification of loci associated with embryo yield in microspore culture ofBrassica rapaby segregation distortion analysis．Plant Cell Report，35（10）：2197-2204．

Lichter R．1982．Induction of haploid plants from isolated pollen ofBrassica napus．Zeitschrift F ü r Pflanzenphysiologie，105（5）：427-434．

Liu X，Han F Q，Kong C C，F(xiàn)ang Z Y，Yang L M，Zhang Y Y，Zhuang M，Liu Y M，Li Z S，Lv H H．2017．Rapid introgression of the Fusarium wilt resistance gene into an elite cabbage line through the combined application of a microspore culture，genome background analysis，and disease resistance-specific marker assisted selection．Frontiers in Plant Science，8：1-11．

Lv H H，Wang Q B，Zhang Y Y，Yang L M，F(xiàn)ang Z Y，Wang X W，Liu Y M，Zhuang M，Lin Y，Yu H L，Liu B．2014a．Linkage map construction using InDel and SSR markers and QTL analysis of heading traits in cabbage．Molecular Breeding，34：87-98．

Lv H H，Wang Q B，Yang L M，F(xiàn)ang Z Y，Zhuang M，Zhang Y Y，Sun P T．2014b．Breeding of cabbage（Brassica oleraceaL. var.capitata）with Fusarium wilt resistance based on microspore culture and marker-assisted selection．Euphytica，200（3）：465-473．

Malik M R，Wang F，Dirpaul J M，Zhou N，Polowick P L，F(xiàn)errie A M R，Krochko J E．2007．Transcript profiling and identification of molecular markers for early microspore embryogenesis inBrassica napus．Plant Physiology，144（1）：134-154．

Mukhlesur R，Monika M．2016．Behind the scenes of microspore-based double haploid development inBrassica napus：a review．Journal of Plant Science & Molecular Breeding，5（1）：1-9．

Shmykova E，Shumilina T，Suprunova P．2016．Doubled haploid production inBrassicaL. species．Russian Journal of Genetics Applied Research，6（1）：68-77．

Shumilina N，Shmykova L，Bondareva T．2015．Effect of genotype and medium culture content on microspore-derived embryo formation in Chinese cabbage（Brassica rapassp.chinensis）cv. Lastochka．Biology Bulletin，42（4）：302-309．

Takahashi Y，Shuji Y，Yoshihito T．2012．Effects of genotypes and culture conditions on microspore embryogenesis and plant regeneration in several subspecies ofBrassica rapaL．Plant Biotechnology Reports，6（4）：297-304．

Takahata Y，Brown D，Keller W．1991．Effect of donor plant age and inflorescence age on microspore culture ofBrassica napusL．Euphytica，58（1）：51-55．

Ver ó nica P V，Patricia C M，Alba R S，Segu í-Simarro J M．2015．Induction of embryogenesis inBrassica napusmicrospores produces a callosic subintinal layer and abnormal cell walls with altered levels of callose and cellulose．Frontiers in Plant Science，6：1-17．

Yuan S X，Su Y B，Liu Y M，Li Z S，F(xiàn)ang Z Y，Yang L M，Zhuang M，Zhang Y Y，Lv H H，Sun P T．2015．Chromosome doubling of microspore-derived plants from cabbage（Brassica oleraceavar.capitataL．）and broccoli（Brassica oleraceavar.italicL．）．Frontiers in Plant Science，6：1-10．