氣相色譜-燃燒-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜測定葡萄酒中甘油δ13C的可行性探討

王道兵 ，鐘其頂 ，李國輝 ，岳紅衛(wèi)

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015； 2.全國食品發(fā)酵標準化中心，北京 100015）

甘油是葡萄酒中干浸出物的主要化合物，主要產(chǎn)生于葡萄酒發(fā)酵生產(chǎn)過程。雖然其對葡萄酒的香氣特征沒有直接貢獻，但卻賦予葡萄酒酒體豐滿的特征——不僅可以增加葡萄酒的甜度，而且使葡萄酒口感更厚重圓潤[1]，因此一些歐洲國家也將甘油作為葡萄酒評級的依據(jù)[2]。因葡萄質(zhì)量不好或者發(fā)酵過程的問題會導(dǎo)致生產(chǎn)出來的葡萄酒口感較差，雖然各國標準與法規(guī)禁止人為加入甘油，但一些不法酒商仍會添加甘油來改善葡萄酒的口感，更有甚者直接用工業(yè)甘油和三精一水化學(xué)原料生產(chǎn)“葡萄酒”。

穩(wěn)定同位素技術(shù)在葡萄酒摻假檢測中具有重要應(yīng)用[3]，利用穩(wěn)定碳同位素的自然分餾特征檢測葡萄酒中非法添加的甘油組分，對維護葡萄酒市場公平競爭、保護消費者權(quán)益、打擊葡萄酒造假具有重要意義。自1997年以來，關(guān)于甘油碳同位素分析的報道有很多[4-8]，其中，Weber等[4]和Rossmann等[5]首先分析了不同產(chǎn)品中甘油的碳同位素分布特征，F(xiàn)ronza等[6-7]研究了動物脂肪轉(zhuǎn)化的甘油同位素特點，陳珊珊等[8]測定了植物油中甘油碳同位素組成，然而上述方法僅限于分析甘油含量較高的樣品——樣品中甘油提純后再測定。隨著在線分析技術(shù)的發(fā)展，氣相色譜-燃燒-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜（GC-C-IRMS）在有機物碳同位素分析中的研究與應(yīng)用越來越廣泛，其分析精度也可優(yōu)于0.3‰[9-10]。2004年，Calderone報道了直接進樣模式聯(lián)用GC-CIRMS測定葡萄酒中甘油碳同位素比值的方法[11]，該方法也被國際葡萄與葡萄酒組織（OIV）采納為標準方法（Resolution OIV/OENO 343/2010），然而我們在應(yīng)用OIV方法時發(fā)現(xiàn)其存在一些問題：葡萄酒樣品用乙醇稀釋4倍后取0.3 μL進樣（分流比120∶1，進樣口溫度270℃）測定，卻未能監(jiān)測到甘油的色譜峰，為此，我們針對樣品的不同屬性進行了方法驗證。

GC-C-IRMS適于氣體或較低沸點物質(zhì)的碳氮同位素特征分析，然而常壓下甘油的沸點是290℃，在205℃或稍高溫度時會隨受熱時間而有不同程度的聚合和分解，在此過程中必然會發(fā)生同位素動力學(xué)分餾[12-13]。根據(jù)穩(wěn)定同位素分析“IT”原則[14-15]，測定樣品甘油δ13C時只需確保和標準品中的甘油具有相同的氣化特征而無需完全氣化，但是考慮到葡萄酒中甘油含量僅為4～11 g/L，而IRMS精確分析需要約200 ng C[16]，因此，探討色譜條件對甘油氣化和碳同位素分餾的影響對準確測定葡萄酒甘油δ13CVPDB值具有重要意義。本研究針對上述因素對測定結(jié)果的影響展開了探討，以期為我國葡萄酒中甘油的穩(wěn)定同位素分布特征調(diào)查和真實性應(yīng)用研究選擇合適的技術(shù)方法提供數(shù)據(jù)支持。

1　材料與方法

1.1　材料、試劑及儀器

葡萄酒：市售。

儀器設(shè)備：Delta V Advantage穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀，配備Ultra Trace GC氣相色譜、IsoLink接口和Triplus自動進樣器，以及Flash 2000元素分析儀，以上儀器均購自Thermo Fisher公司。超純水由Milipore公司的Milli-Q系統(tǒng)制備。氦氣（純度為99.999%）和二氧化碳氣體（純度99.99%）均購于北京北溫氣體制造廠。HP-INNOwax氣相色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）購于安捷倫科技（中國）有限公司。十萬分之一電子天平購于瑞士Mettler-Toledo公司。

試劑：乙醇（色譜純），購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甘油（分析純），編號為WS-1、WS-2和WS-3，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

IAEA-CH-6(國際原子能機構(gòu))，δ13CV-PDB=-10.45‰±0.2 ‰；IAEA-601（國際原子能機構(gòu)），δ13CV-PDB=-27.77‰±0.04‰。

1.2　儀器條件

1.2.1　GC條件

進樣量1 μL，進樣口溫度240～270℃，載氣為氦氣，流速1.2 mL/min，分離比10∶1。程序升溫條件為：初溫120℃，升溫速度為25℃/min。

1.2.2　甘油轉(zhuǎn)化條件

燃燒轉(zhuǎn)化裝置（IsoLink）中配備陶瓷（Al2O3）氧化管（填料為CuO、NiO 和Pt），工作溫度為1000 ℃[12-13]。

1.2.3　EA條件[15]

氧化管溫度980℃，還原管溫度680℃，柱溫60℃，氦氣流速100 mL/min，氧氣充入時長為3 s（流速250 mL/min）；稱取0.1 mg有機物于錫杯中，包樣后測定。

1.2.4　IRMS條件

離子源電壓2.97 kV，真空度1.8×10-6mbar，轟擊電壓120.8 eV。

1.3　數(shù)據(jù)處理

Thermo isodat version 3.0軟件用于數(shù)據(jù)采集和碳同位素值的計算（注：δ13C值僅是實際測定結(jié)果，未經(jīng)過標準品校正。校正后的結(jié)果記為δ13CVPDB）。

2　結(jié)果與討論

受同位素熱力學(xué)分餾作用的影響，物質(zhì)在兩種或兩種以上物質(zhì)（物相）之間的分配時具有不同的同位素比值，而分餾系數(shù)取決于物質(zhì)分配時的條件，如溫度、溶劑等[17]。GC-C-IRMS系統(tǒng)中存在兩個分配節(jié)點：進樣口和燃燒管/裂解管接口，本研究中，我們重點針對上述兩個節(jié)點中有樣品損失的情況而重點分析溫度、溶劑對甘油碳同位素分餾的影響。

2.1　甘油工作標準

由于國內(nèi)外均缺乏甘油碳同位素參考物質(zhì)，因此我們選擇國際碳同位素參考物質(zhì)標定的方法得到甘油工作標準物質(zhì)：用IAEA-CH-6和IAEA-601反標定EA-IRMS中參考氣CO2的δ13CVPDB[18]，然后多次測定純甘油的穩(wěn)定碳同位素比值并取其平均值，得到3個甘油WS-1、WS-2和WS-3的 δ13CVPDB值分別為-30.98‰±0.05‰、-27.95‰±0.04‰和-25.08‰±0.04‰。由此可見，上述3個純甘油具有不同的碳同位素特征且均勻穩(wěn)定，因而可以作為實驗室工作標準用于方法驗證和同位素分餾特征研究。

2.2　進樣口溫度對葡萄酒甘油測定的影響

Schmitt等[19]的研究表明，進樣口參數(shù)設(shè)置會影響氣體物質(zhì)分析時的同位素分餾特征，而為了保持良好的分離度和峰形，我們一般采用分流進樣的模式，這種分流造成的樣品損失必然也會帶來同位素分餾。研究進樣口條件對GC-C-IRMS測定甘油δ13C的影響，保持色譜柱溫度240℃，設(shè)定IsoLink的反吹閥（Backflush valve）在0～300 s處于打開狀態(tài)以防止乙醇進入反應(yīng)管。以甘油乙醇溶液（WS-1、WS-2、WS-3）和葡萄酒（Wine-01）為研究對象，分別在進樣口溫度200℃、240℃、270℃和300℃時進樣，每個試樣進樣3次，測試序列中以270℃條件下的測定結(jié)果為基準進行結(jié)果初校正。甘油經(jīng)GC-C-IRMS轉(zhuǎn)化的CO2的信號強度（m/z44）見圖1，δ13C結(jié)果見表1。

圖1　不同進樣口溫度時甘油轉(zhuǎn)化的CO2的信號強度（m/z44）

從圖1可看出，信號強度（m/z44）因進樣口溫度不同而有差異：小于240℃時，信號強度（m/z44）隨溫度升高而增強；大于270℃時，信號強度（m/z44）與溫度呈反相關(guān)關(guān)系；乙醇為溶劑的甘油樣品在240℃和270℃時幾乎是一樣的，但葡萄酒中甘油的信號強度（m/z44）在270℃條件下達到最高值。這與甘油在氣相色譜進樣口的氣化特性有關(guān)，低于240℃時有相當一部分甘油未氣化而未能進入色譜柱；高于270℃時，可能會導(dǎo)致甘油分解，也可能是高溫條件下的乙醇、水等其他低沸點物質(zhì)的蒸汽分壓太大，導(dǎo)致甘油的氣化占比變小，而進入色譜柱的比例也隨之降低的緣故。

表1數(shù)據(jù)表明，試樣在4個溫度條件下δ13C值的標準偏差均小于0.3‰，尤其是WS-1，其不同溫度下測定值的標準偏差均優(yōu)于0.20‰，考慮到進樣口溫度270℃時，Wine-01的甘油具有更高的信號強度（m/z44），后續(xù)研究中均固定進樣口溫度為270℃。

表1　甘油在不同進樣溫度下的δ13C測定結(jié)果　(‰)

對比各樣品的甘油δ13C實測值可以看出，不同溫度條件下測定結(jié)果均不相同，并且呈現(xiàn)出隨進樣口溫度升高而δ13C值下降的趨勢，并且甘油中13C/12C比值越大，測定結(jié)果變化的程度也越大，這表明GC-C-IRMS測定甘油碳同位素時，在進樣口處出現(xiàn)了碳同位素分餾，溫度越高時，質(zhì)量數(shù)大的甘油分子越容易進入色譜柱，這符合瑞利分餾的相關(guān)特征[20]。

由2.1可知，3個甘油工作標準物質(zhì)的δ13CVPDB差值（Δ13C）最大為5.90‰（WS-3與WS-1），然而GC-C-IRMS測定結(jié)果（δ13C值）的差值卻不是5.90‰，而是在6.43‰～7.34‰范圍內(nèi)變化，顯然，EA-IRMS與GC-C-IRMS在分析樣品時具有不同的同位素分餾特征，若以WS-1為基準進行數(shù)據(jù)校正，WS-3的校正結(jié)果與EA-IRMS標定值也會存在偏差，偏差的大小與進樣口溫度密切相關(guān)。結(jié)合分餾系數(shù)（ɑ）因溫度而變的特點，說明只依靠工作參考氣CO2或單點校正法計算樣品的δ13C值是不充分的，而應(yīng)該按照“PIT”原則，并且依據(jù)Stephen等[22]建立的兩點校正模型來進行數(shù)據(jù)校正：以進樣口270℃下的測定結(jié)果為例，3個標樣的測定值與給定值之間的線性擬合程度R2=1，這說明該分析條件（進樣口270℃、色譜柱240℃恒溫、分流進樣10∶1）下甘油碳同位素分餾特征是線性的、分餾系數(shù)是固定的。采用兩點校正法，任取2個標樣的測定值和給定值建立回歸曲線，如WS-1和WS-2之間的線性擬合公式為δ13CVPDB=0.8832*δ13C-6.5792，由此計算得出WS-2的δ13CVPDB值為-27.93‰，與給定值-27.95‰十分接近。

2.3　色譜柱溫度對甘油測定的影響

如上文所述，分流進樣模式下進樣口溫度影響樣品的氣化特征進而影響甘油產(chǎn)生的CO2的信號強度，同樣地，GC-C-IRMS體系中毛細色譜柱并非直接連在檢測器上，色譜柱流出的物質(zhì)約有90%的物質(zhì)轉(zhuǎn)入燃燒管中（其余10%經(jīng)裂解管排出）。甘油在該節(jié)點處并未100%進入燃燒管，因此碳同位素分餾在該處同樣存在。為驗證色譜柱溫度對甘油δ13C測定的影響，在進樣口溫度270℃、載氣流速1.2 mL/min的情況下，設(shè)定程序升溫的初始溫度為80℃，保持1 min，然后以30℃/min升至180℃、200℃、220℃、240℃或260℃，并分別保持恒溫至分析結(jié)束。甘油乙醇溶液（WS-1、WS-2、WS-3）和葡萄酒（Wine-01）分別進樣，每個試樣進樣3次，甘油經(jīng)GC-C-IRMS轉(zhuǎn)化的CO2的信號強度（m/z44）見圖2，δ13C結(jié)果見表2。

圖2　不同色譜柱最終溫度時甘油轉(zhuǎn)化的CO2的信號強度（m/z44）

由圖2可知，各試樣中甘油轉(zhuǎn)化的CO2信號強度（m/z44）隨色譜柱最終溫度的升高而增大，最大相差近4倍，這表明柱溫影響了甘油流出色譜柱后的分配情況，溫度越高，越有利于甘油進入燃燒管。

表2　甘油在不同色譜柱溫度下的δ13C測定結(jié)果　(‰)

表2中，180～220℃時甘油δ13C測定值的標準偏差較大（＞0.4‰），分析其原因，可能是由于甘油的沸點較高，甘油流出色譜柱后或在色譜柱中有一部分被液化的緣故。根據(jù)同位素熱力學(xué)分餾原理，溫度越高時同位素越能快速達到動態(tài)平衡，甘油在柱溫180℃和200℃時，流入反應(yīng)管的部分與剩余部分可能未達到平衡狀態(tài)，因此導(dǎo)致碳同位素測定精度差。240℃和260℃時甘油δ13C的測定重復(fù)性均比較理想（標準偏差小于0.25‰），但相對于240℃，柱溫設(shè)定在260℃時甘油標準品（乙醇為溶劑）產(chǎn)生的CO2的信號強度（m/z44）提升有限（2%～5%），而葡萄酒樣品中甘油的信號強度（m/z44）提高了約9%。

穩(wěn)定同位素分析領(lǐng)域，分析系統(tǒng)的測定尺度（“scale”）對分析準確性至關(guān)重要[23]，而由于穩(wěn)定同位素分析誤差的存在（δ13C≤0.3‰），我們認為測定尺度越大，分析誤差對樣品準確性的影響越?。ū热玑槍蓚€物質(zhì)的測定尺度：實際差值=2，即使分析誤差為0.3‰，那么數(shù)據(jù)經(jīng)校正后結(jié)果的誤差則可能僅為0.15‰）。標品WS-1與WS-3之間δ13CVPDB差值為5.90‰，180℃和220℃時差值最大，但分析精度差；與260℃的數(shù)據(jù)相比，240℃時GC-CIRMS的測定尺度更大一些，雖然260℃更有利于提升含水試樣中甘油信號強度，但仍選擇240℃作為后續(xù)研究的色譜柱的最終溫度。

2.4　水分對甘油測定的影響

以上研究過程中，葡萄酒和甘油-乙醇溶液在測定時表現(xiàn)出了一些不同，其原因可能是由于樣品中溶劑不同導(dǎo)致的：純甘油樣品的溶劑為純乙醇，而葡萄酒中則是10%左右的乙醇水溶液。為研究水分對甘油測定的影響，分別配制含水量為0、20%、40%、60%、80%、90%和100%的乙醇水溶液，然后分別稀釋甘油工作標準物質(zhì)（WS-1和WS-3）至6 g/L，并在進樣口270℃、流速1.2 mL/min、程序升溫（80℃/1 min//30//240℃/5 min）條件下進樣測定，每個試樣測定3次，結(jié)果見圖3和表3。

圖3　不同溶劑中甘油轉(zhuǎn)化CO2的信號強度（m/z44）

由圖3可知，CO2信號強度均隨溶液中水分含量的增加而降低，擬合度分析表明相關(guān)系數(shù)R2可達0.98，這表明溶液中水分影響了甘油在GC中的分配特征。事實上，同體積同條件進樣，水蒸汽的體積是乙醇蒸汽的3倍以上，因此，進樣溶液含水量越高，甘油氣化后占比越低，進入色譜柱的氣態(tài)甘油也會相應(yīng)減少。

表3中所有試樣的標準偏差均小于0.21‰，這說明水分未影響甘油δ13C的測定穩(wěn)定性。但是各試樣中甘油δ13C的分析結(jié)果存在微小差異，測定值隨溶液中含水量的增加而升高，樣品中的水分影響了甘油的碳同位素分餾情況，此時，進樣口處含13C較多的甘油分子更容易被轉(zhuǎn)移至色譜柱中。葡萄酒的含水量一般為84%～95%，對比表3數(shù)據(jù)可知，樣品含水量在80%～100%波動時，兩個甘油（WS-1和WS-2）δ13C測定值的極差分別為0.49‰和0.89‰，因此，按照穩(wěn)定同位素分析的“IT”原則，應(yīng)確保工作標準樣品與葡萄酒樣品盡可能具有相同的水/乙醇比例。2.5甘油濃度對δ13C測定的影響

表3　不同溶劑中甘油δ13C測定結(jié)果　(‰)

表4　不同濃度下甘油δ13C測定結(jié)果　(‰)

Hall等指出分析單體化合物的碳同位素分布特征時δ13C測定結(jié)果受濃度的影響較大[21]，然而葡萄酒甘油含量因受多種因素的影響而存在差異，有報道指出葡萄酒中甘油含量最低時僅為4 g/L，而最高則可達21 g/L[2]。為研究甘油濃度對δ13C測定的影響，我們模擬葡萄酒中酒精含量，以12%乙醇水溶液為溶劑配制濃度為3～21 g/L的甘油樣品，分別測定δ13C，并以100%乙醇為溶劑配制的甘油樣品為基準進行數(shù)據(jù)校正，結(jié)果見表4。

由表4可看出，峰面積與甘油濃度呈顯著正相關(guān)關(guān)系（R2=0.978），然而當甘油濃度加倍時，甘油轉(zhuǎn)化CO2的m/z 44峰面積的增加量卻不止一倍。對比分析精度，除濃度為3 g/L時測定結(jié)果穩(wěn)定性SD大于0.4‰以外，其余濃度梯度時SD均優(yōu)于0.3‰，但是甘油濃度在12 g/L時的樣品與相鄰兩個濃度樣品的測定結(jié)果具有明顯差異，這意味著測定結(jié)果在甘油濃度9～15 g/L時存在較大變化，而甘油濃度在6～9 g/L與15～21 g/L范圍時，δ13C測定值則保持了相對穩(wěn)定（差異均小于0.2‰）。一般來說，連續(xù)流-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀（CF-IRMS）測定CO2時，δ13C測定結(jié)果會因信號強度（m/z44）的不同而線性變化，根據(jù)儀器公司提供的測試指標要求，變化率在±0.065‰/V范圍內(nèi)時即可認為儀器測定結(jié)果是穩(wěn)定的。本研究中，3 g/L（信號強度為502 mV）時，δ13C測定結(jié)果相對偏正，高濃度21 g/L（信號強度為13994 mV）時，結(jié)果最偏負，雖然變化是線性的，但是3個甘油工作標準的變化率不一致，分別為-0.084‰/V～-0.117‰/V，其中甘油中13C含量越高變化率越大，說明GC-C-IRMS分析甘油δ13C時具有特殊的碳同位素分餾效應(yīng)，而且濃度確實造成了δ13C測定結(jié)果的差異。

當然，根據(jù)“IT”原則可在測定結(jié)果穩(wěn)定的前提下進行數(shù)據(jù)校正，然后依據(jù)“IT”原則，用于校正的標準品應(yīng)與待測樣品具有相同的理化特征和處理過程。采用GC-C-IRMS分析葡萄酒甘油時應(yīng)確保標準品的甘油濃度和乙醇含量完全一致（或接近），然而葡萄酒乙醇含量為8%vol～20%vol，而甘油濃度在3～21 g/L之間波動，并且不同產(chǎn)區(qū)、不同品種的葡萄酒樣品上述兩指標均存在較大差異，為確保數(shù)據(jù)有效性應(yīng)根據(jù)單個樣品進行針對性的配制標準品，而這間接地影響了分析效率，增加了前處理和分析工作量?；诖耍唤ㄗh使用GCC-IRMS技術(shù)測定葡萄酒中甘油碳同位素比值。

3　結(jié)論

本研究分析了溫度、樣品含水量及甘油濃度對GC-C-IRMS測定甘油δ13C的影響，其中甘油產(chǎn)生的CO2的信號強度（m/z44）與溫度、濃度呈顯著正相關(guān)關(guān)系，然而與樣品含水量呈顯著負相關(guān)；甘油δ13C測定值與溫度呈顯著負相關(guān)而與樣品含水量呈顯著正相關(guān)，但與濃度的相關(guān)性不明顯；各條件下3個工作標準的測定結(jié)果與標定值（EA數(shù)據(jù)）具有良好相關(guān)性，可根據(jù)數(shù)據(jù)模型用于數(shù)據(jù)校正，但前提是用于校正的標準品與待測樣品的乙醇和甘油濃度一致，而該過程會直接增加前處理工作量和測定任務(wù)量，分析效率低下，因此不建議使用GC-CIRMS技術(shù)測定葡萄酒中甘油碳同位素比值。

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