基于DNA模板制備的金屬納米簇及其在分析檢測(cè)中應(yīng)用進(jìn)展

賀錦燦， 李攻科*， 胡玉玲*

(中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510275)

1 引言

金屬納米簇(Metal Nano-Clusters，M NCs)一般由10～100個(gè)金屬原子構(gòu)成，其直徑通常小于2 nm，接近電子的費(fèi)米波長(zhǎng)，連續(xù)密度態(tài)分裂成離散的能級(jí)，可認(rèn)為是一種“分子物種”。由于獨(dú)特的分裂能級(jí)和量子尺寸效應(yīng)，M NCs呈現(xiàn)出與較大金屬納米顆粒顯著不同的光學(xué)、電學(xué)和化學(xué)性質(zhì)。M NCs具有強(qiáng)熒光性、優(yōu)異的光穩(wěn)定性以及良好的生物相容性等，因此在生化分析，環(huán)境監(jiān)測(cè)、工業(yè)催化等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景[1]。M NCs的尺寸很小，表面能非常大，容易團(tuán)聚成不發(fā)光的大顆粒，因此制備穩(wěn)定性好、強(qiáng)熒光的M NCs是相關(guān)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。常見(jiàn)的方法是利用模板分子的包覆作用制備結(jié)構(gòu)和性質(zhì)穩(wěn)定的M NCs。目前，已報(bào)道的模板主要為聚合物、蛋白質(zhì)、巰基小分子、寡聚核苷酸(DNA) 等[2]。DNA堿基序列和長(zhǎng)度可調(diào)、二級(jí)結(jié)構(gòu)多樣、生物相容性好[3]，使之成為最具特色的模板之一。DNA雜環(huán)堿基上的N、O 功能基團(tuán)可與過(guò)渡金屬離子配合；同時(shí)，DNA堿基對(duì)自組裝可形成多形態(tài)的超分子結(jié)構(gòu)，包括G -四鏈體、i-motif、以及傳統(tǒng)的Watson-Crick雙鏈等。以DNA為模板制備M NCs具有如下優(yōu)勢(shì)：(1) 可通過(guò)調(diào)節(jié)DNA長(zhǎng)度、堿基序列合成從藍(lán)到近紅外的M NCs；(2) 可通過(guò)設(shè)計(jì)同時(shí)包含適配體和堿基模板的DNA序列實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物選擇性識(shí)別與檢測(cè)；(3) 與傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料和半導(dǎo)體量子點(diǎn)相比，無(wú)需再將DNA與M NCs進(jìn)行共價(jià)連接，費(fèi)用降低；(4) DNA為M NCs提供了良好的生物活性表面，促進(jìn)了其在生物成像和核酸檢測(cè)方面的應(yīng)用[1]。

目前，雖有不少Ag NCs合成[2]和應(yīng)用[3 - 6]方面的綜述，但基于DNA為模板制備M NCs及其在分析檢測(cè)中的應(yīng)用綜述甚為鮮見(jiàn)。本文總結(jié)了DNA-M NCs的合成方法及光學(xué)性質(zhì)，重點(diǎn)介紹了DNA-M NCs 在分析檢測(cè)中的應(yīng)用，并總結(jié)和展望其存在的問(wèn)題和發(fā)展趨勢(shì)。以期為DNA-M NCs在分析化學(xué)中的發(fā)展提供一定的參考。

2 DNA-M NCs的制備

根據(jù)DNA模板的不同，可將DNA-M NCs的合成方法分為以下幾類：(1)單鏈DNA(ssDNA)；(2)雙鏈DNA(dsDNA)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA；(3)三鏈DNA、i-motif和G -四鏈體；(4)模板置換等。

2.1 單鏈DNA

2004年，Dickson等[7]首次在磷酸緩沖溶液中以12堿基DNA序列為模板(5′-AGGTCGCCGCCC-3′)合成熒光Ag NCs。DNA為Ag NCs提供了有效的模板(支架)。Ag+與DNA存在較強(qiáng)的作用力，加入還原劑NaBH4后，得到的少量Ag原子(1～4個(gè)) 鍵合在ssDNA上。他們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，胞嘧啶堿基與Ag NCs的作用最強(qiáng)，可通過(guò)調(diào)控化學(xué)計(jì)量比和DNA序列制備理想的Ag NCs。胞嘧啶[8 - 10]和鳥嘌呤[11 - 12]與Ag+的結(jié)合力較強(qiáng)，因此富C的ssDNA常被用于合成Ag NCs。Petty等[8]發(fā)現(xiàn)富C序列C12是一種制備Ag NCs的高效模板，Ag NCs主要結(jié)合在胞嘧啶的N3位置。Vosch等[9]采用同一種DNA序列為模板制備了近紅外發(fā)光、耐光性好的Ag NCs。胸腺嘧啶的N3位置需在較高pH才能發(fā)生去質(zhì)子化，因此富T序列很少用來(lái)合成Ag NCs[13]。此外，可通過(guò)調(diào)節(jié)DNA的堿基序列和長(zhǎng)度獲得具有不同發(fā)射波長(zhǎng)的Ag NCs[14 - 15]。

一般來(lái)說(shuō)，DNA-Au NCs的發(fā)射光的顏色主要與還原試劑有關(guān)而不是DNA序列。用強(qiáng)還原劑NaHB4還原HAuCl4只能得到較大粒徑的Au NPs。Liu等[16]以含30個(gè)堿基的DNA為模板，以檸檬酸鈉為還原劑，合成了藍(lán)色發(fā)射波長(zhǎng)的Au NCs。pH和反應(yīng)物化學(xué)計(jì)量比影響堿基與Au的結(jié)合。以C30為模板時(shí)，僅在較低pH和大量DNA存在下才可制備出熒光Au NCs；而以A30為模板時(shí)，在中性pH和約1∶1 反應(yīng)計(jì)量比條件下即可制備出熒光Au NCs。除檸檬酸鈉外，二甲基胺硼烷也常被用作制備Au NCs的還原劑[17 - 19]。

Cu NCs的熒光強(qiáng)度弱且穩(wěn)定性差，因此相關(guān)研究并不多。由于胸腺嘧啶與Cu NCs的作用較強(qiáng)，因此常用富T序列的ssDNA為模板合成Cu NCs[20 - 21]。以ssDNA為模板不僅可以合成單一金屬組分的M NCs，也可合成雙金屬組分的M NCs，如Cu/Ag NCs[22 - 23]。

2.2 雙鏈DNA和發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA

通過(guò)調(diào)節(jié)DNA的多態(tài)結(jié)構(gòu)，如雙鏈DNA和含loop區(qū)的發(fā)夾DNA，可制備具有不同熒光特性的Ag NCs[24 - 27]、Au NCs[18,28]和Cu NCs[29 - 32]。DNA發(fā)夾序列不同，所制備的Ag NCs熒光特性不盡相同。Gwinn等[27]發(fā)現(xiàn)C發(fā)夾和G發(fā)夾制備的DNA-Ag NCs亮度較高，A發(fā)夾制備的DNA-Ag NCs亮度很低，而T發(fā)夾制備的DNA-Ag NCs無(wú)熒光。Liu等[18]發(fā)現(xiàn)基于loop區(qū)發(fā)夾DNA為模板制備的Au NCs，熒光特性與loop區(qū)序列組成有關(guān)，富C loop形成的Au NCs產(chǎn)率最高。與T和A loop相比，C和G loop形成的Au NCs熒光強(qiáng)度要高很多。Wang等[32]發(fā)現(xiàn)錯(cuò)配dsDNA比匹配dsDNA調(diào)控出的DNA-Cu NCs 熒光強(qiáng)度高很多，為核苷酸位點(diǎn)突變檢測(cè)提供了新方法。

2.3 三鏈DNA、i-motif和G -四鏈體

除了ssDNA和dsDNA，三鏈DNA(Triplex DNA)也可作為制備M NCs的模板。Ren等[33]以三鏈DNA為模板制備了均一性好、亮度高的Ag NCs。Ag NCs的成核與三鏈DNA的CG.C+位點(diǎn)有關(guān)。通過(guò)對(duì)DNA序列的合理設(shè)計(jì)，可在CG.C+位點(diǎn)形成均相Ag2團(tuán)簇。

與傳統(tǒng)的雙鏈互補(bǔ)配對(duì)不同，i-motif結(jié)構(gòu)是一種以C.C+堿基對(duì)為基本單元的DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。Jeffrey等[34]用兩條具有C4i-motif結(jié)構(gòu)的序列(dTA2C4)4和(dC4A2)3C4合成了紅色熒光和綠色熒光Ag NCs。Li等[35]以具有i-motif結(jié)構(gòu)的DNA序列合成了Pd NCs。密度泛函理論計(jì)算顯示位于i-motif結(jié)構(gòu)上的CH+.C堿基對(duì)可通過(guò)胞嘧啶的N3位點(diǎn)與Pd離子有效結(jié)合。

G -四鏈體(G -quadruplex)是一種鳥嘌呤連接的四鏈DNA螺旋結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)G -quadruplex也是一種調(diào)控?zé)晒釧g NCs的有效模板。Wang等[36]用可形成G -quadruplex的抗核仁素適配體AS1411為模板，合成了在420 nm和680 nm處發(fā)光的Ag NCs。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，合成Ag NCs后，AS141仍保持原有的結(jié)構(gòu)，可與癌細(xì)胞核仁素結(jié)合。同時(shí)，這種結(jié)合可以增強(qiáng)Ag NCs的熒光強(qiáng)度，利用該性質(zhì)成功實(shí)現(xiàn)了HeLa細(xì)胞的熒光成像。該方法也可拓展到其他G -quadruplex模板。

2.4 模板轉(zhuǎn)換

除了直接合成法，Dickson等[37]發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)模板轉(zhuǎn)化法制備DNA-Ag NCs。由聚丙烯酸為模板合成的Ag NCs發(fā)光很弱，加入C12后，團(tuán)簇轉(zhuǎn)移到更具親和力的ssDNA模板上，其熒光亮度提高了10倍。熒光轉(zhuǎn)換效率受溶液的pH值、緩沖溶液和溫度等因素的影響。類似地，Martinez等[38]發(fā)現(xiàn)，以含12堿基成核序列和30堿基雜化序列的DNA為模板合成的DNA-Ag NCs接近富G序列3′-G4(TG4)2TG3)后，紅色熒光增強(qiáng)了500倍。

3 M NCs的光學(xué)性質(zhì)

M NCs的能級(jí)譜帶不連續(xù)，分裂成類似于分子的分立能級(jí)，因此具有與分子類似的性質(zhì)。由于獨(dú)特的分裂能級(jí)和量子尺寸效應(yīng)，M NCs呈現(xiàn)出與較大金屬納米顆粒顯著不同的光學(xué)性質(zhì)，如強(qiáng)熒光、優(yōu)異的光穩(wěn)定性等。

3.1 吸收光譜和熒光光譜

金屬納米粒子的吸收光譜主要取決于導(dǎo)帶電子的表面等離子性質(zhì)，而表面等離子共振來(lái)源于導(dǎo)帶電子與入射光的相互作用。M NCs的連續(xù)密度態(tài)分裂成不同的能級(jí)，不再表現(xiàn)出等離子性質(zhì)，但仍可以通過(guò)不同能級(jí)間的電子躍遷與光相互作用，顯示出吸收峰。Zhang等[39]發(fā)現(xiàn)C12-Ag NCs在波長(zhǎng)442 nm和547 nm處有吸收峰。最近，Tseng等[40]發(fā)現(xiàn)A30-Au NCs在290 nm處有吸收峰。雖然不同配體為模板的M NCs 吸收峰位置不盡相同，但通常都表現(xiàn)出電子的離散躍遷，因此吸收光譜可作為鑒定M NCs的一種手段。

M NCs與常見(jiàn)的有機(jī)熒光染料相比，顯示出更加優(yōu)越的熒光性質(zhì)，有良好的光穩(wěn)定性、如光漂白抗性好、斯托克斯位移大(100 nm以上)等[41]。大塊金屬發(fā)光極其微弱，主要是由于存在有效的非輻射躍遷和能級(jí)帶。當(dāng)金屬的尺寸減小到納米級(jí)，發(fā)光效率明顯增強(qiáng)。當(dāng)粒徑接近導(dǎo)帶電子的費(fèi)米波長(zhǎng)時(shí)，M NCs顯示出強(qiáng)熒光性質(zhì)。DNA-M NCs的發(fā)光通常歸因于納米簇能帶間的電子躍遷(可見(jiàn)發(fā)射) 及DNA堿基與納米簇間的電荷轉(zhuǎn)移(紫外發(fā)射)[42]。目前有研究者提出一些解釋小尺寸M NCs發(fā)光的機(jī)理，但都存在一定的局限性，仍無(wú)一種普遍適用的解釋。DNA-M NCs的熒光性質(zhì)與多種因素有關(guān)，如DNA序列、溶劑、pH、試劑濃度、納米簇的尺寸和氧化態(tài)等[43]。

3.2 溶劑致變色效應(yīng)

溶劑變色效應(yīng)是指物質(zhì)在不同的溶劑中有不同的顯色能力。溶劑變色效應(yīng)常見(jiàn)于大尺寸金屬納米粒子，這種性質(zhì)與表面等離子體性質(zhì)有關(guān)。最近的研究顯示，M NCs表現(xiàn)出類似的光學(xué)性質(zhì)。隨著溶劑極性的變化，不同DNA序列包裹的Ag NCs產(chǎn)生強(qiáng)的、不連續(xù)的熒光，吸收峰和發(fā)射峰在可見(jiàn)和近紅外區(qū)間[44]。最近，Elisabeth等[45]發(fā)現(xiàn)不同DNA模板合成的AgN-DNAs經(jīng)純化后溶劑致變色效應(yīng)不盡相同，且比未純化的AgN-DNAs溶劑變色效應(yīng)弱很多。

3.3 雙光子吸收性質(zhì)

雙光子吸收是指兩個(gè)相同或不同頻率的光子同時(shí)吸收，從而將一個(gè)分子從低能態(tài)激發(fā)到高能態(tài)。與單光子激發(fā)相比，雙光子激發(fā)所需要的能量減半，通常位于近紅外區(qū)。由于色散率低和自熒光變小，其近紅外區(qū)域的穿透深度和空間分辨率增加，尤其適合生物體內(nèi)成像和光動(dòng)力治療。Dickson等[46]發(fā)現(xiàn)發(fā)射峰的截面為35 000 GM，680 nm處發(fā)射峰的截面為34 000 GM，在710 nm處發(fā)射峰的截面高達(dá)50 000 GM。M NCs的雙光子吸收截面接近水溶性量子點(diǎn)的截面(66 000 GM)，遠(yuǎn)大于水溶性雙光子染料的截面。Goodson等[47]發(fā)現(xiàn)當(dāng)用800 nm對(duì)dsDNA-Ag NCs進(jìn)行激發(fā)時(shí)，可在630 nm處檢測(cè)到雙光子激發(fā)熒光。雙光子吸收的截面約為3 000 GM。

3.4 電化學(xué)發(fā)光性質(zhì)

電化學(xué)發(fā)光(Electrochemiluminescence，ECL)是指在電極表面施加一定的電壓而引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，包括化學(xué)發(fā)光與電化學(xué)兩個(gè)過(guò)程。存在共反應(yīng)試劑存在時(shí)，M NCs顯示強(qiáng)烈的ECL信號(hào)。共反應(yīng)試劑在氧化或還原時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)還原性或強(qiáng)氧化性中間體，該中間體和ECL體系的發(fā)光基團(tuán)作用，從而增強(qiáng)ECL發(fā)光效率[48]。ECL體系中最常見(jiàn)的激發(fā)方式為氧化還原激發(fā)，發(fā)光物質(zhì)最先被陰極產(chǎn)生的氧化自由基氧化，然后被高能電子還原，進(jìn)而回到初始氧化態(tài)基態(tài)。Xu等[49]發(fā)現(xiàn)CdS納米晶體(CdS NCs) 的發(fā)射峰與DNA-Ag NCs的吸收峰重疊，能發(fā)生有效的ECL共振能量轉(zhuǎn)移。加入共反應(yīng)試劑K2S2O8后，工作電極表面的DNA-Ag NCs發(fā)生反應(yīng)而逐漸減少，導(dǎo)致CdS NCs的ECL信號(hào)減弱，據(jù)此建立了一種檢測(cè)micro RNA的方法。Yuan等[50]結(jié)合聚合酶鏈反應(yīng)和雜交鏈反應(yīng)，在電極表面組裝富胞嘧啶莖環(huán)，促使Ag NCs的合成，在0.24 V處觀察到較強(qiáng)的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。

4 DNA-M NCs在分析檢測(cè)中的應(yīng)用

DNA-M NCs具有超小尺寸、強(qiáng)熒光、良好的穩(wěn)定性、良好的生物相容性，已成為構(gòu)建生化傳感平臺(tái)的新型熒光探針。環(huán)境變化容易導(dǎo)致DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而引起Ag NCs的熒光增強(qiáng)、猝滅或熒光激發(fā)、發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生位移。這種性質(zhì)為DNA-M NCs在分析檢測(cè)方面的應(yīng)用提供了可能。目前，DNA-M NCs 已成功用于金屬離子[25,51 - 55]、有機(jī)小分子[56 - 65]、核酸[66 - 71]、蛋白質(zhì)[24,72 - 74]分析檢測(cè)和成像標(biāo)記[75 - 83]等分析檢測(cè)領(lǐng)域。

4.1 檢測(cè)金屬離子

基于熒光猝滅(“turn off”)、熒光增強(qiáng)(“turn on”)或發(fā)射波長(zhǎng)位移，已實(shí)現(xiàn)Hg2+ [25,51 - 52]、Cu2+[53 - 54]和Ag+[55]等金屬離子的檢測(cè)。以“turn off”模式為例，Yang等[51]用ssDNA模板(5′-CCCCCCCCCCCC TTTTTT-3′)合成Au NCs，加入Hg2+后形成“T-Hg2+-T”結(jié)構(gòu)，DNA-Au NCs發(fā)生聚集，熒光強(qiáng)度降低，Hg2+的檢出限為0.083 μmol/L。此外，也可通過(guò)“turn on”模式實(shí)現(xiàn)金屬離子的檢測(cè)。Chang等[54]發(fā)現(xiàn)3-巰基丙酸(MPA)對(duì)DNA-Cu/Ag NCs熒光具有猝滅作用，加入Cu2+后，MPA被氧化為二硫化物，DNA-Cu/Ag NCs熒光恢復(fù)，熒光恢復(fù)程度與Cu2+濃度相關(guān)，依此建立檢測(cè)Cu2+的方法，其檢出限為2.7 nmol/L。最近，Kim等[55]利用熒光發(fā)射波長(zhǎng)的變化實(shí)現(xiàn)了Ag+的檢測(cè)。Ag+可同時(shí)連接兩個(gè)Cyt12-Ag NCs，使Cyt12-Ag NCs的熒光從紅色變?yōu)榫G色，從而建立一種檢測(cè)Ag+的方法，檢出限10 nmol/L。

4.2 檢測(cè)有機(jī)小分子

除了金屬離子，DNA-M NCs對(duì)生物硫醇[56 - 58]、腺苷[59]、三磷酸腺苷(ATP)[60 - 61]、可卡因(Cocaine)[62 - 63]、赭曲霉毒素A(OTA)[64]、硝基化合物[65]等小分子也有優(yōu)異的檢測(cè)效果。巰基與Ag有較強(qiáng)的親和作用，可通過(guò)硫醇對(duì)熒光DNA-M NCs的猝滅實(shí)現(xiàn)對(duì)硫醇的分析檢測(cè)。Wang等[58]發(fā)現(xiàn)含巰基的氨基酸(半胱氨酸Cys、同型半胱氨酸Hcy和谷胱甘肽GSH) 可高效猝滅DNA-Ag NCs熒光。該方法對(duì)Cys、Hcy和GSH的檢出限分別為4.0、4.0和0.2 μmol/L。最近，He等[61]設(shè)計(jì)了一條啞鈴狀的DNA模板，該模板由兩個(gè)富C loop(可合成Ag NCs) 和富A-T堿基對(duì)的莖環(huán)(可合成Cu NPs) 組成，既可作Ag NCs 的合成模板，又可作Cu NPs的合成模板。由于T4 DNA連接酶的催化需ATP做輔助因子，因此當(dāng)體系中存在ATP時(shí)，向模板中加入T4 DNA連接酶后，5′端和3′端連接，形成閉合形啞鈴狀dsDNA，ExoⅠ和EXoⅢ無(wú)法將其水解，加入Ag+/NaBH4或Cu2+/抗壞血酸后，可以形成具有熒光的Ag NCs或Cu NPs；而當(dāng)體系中不存在在ATP時(shí)，T4 DNA連接酶無(wú)法起催化作用，加入ExoⅠ和ExoⅢ后DNA模板被水解，無(wú)法形成熒光納米簇，從而建立了檢測(cè)ATP的靈敏方法。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Cu NPs對(duì)ATP的檢測(cè)限為81 pmol/L，比Ag NCs更高。該方法同樣也適用DNA等大分子的檢測(cè)。

4.3 檢測(cè)核酸

M NCs也可用于DNA[66 - 68]和micro RNA[69 - 71]等核酸檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，熒光DNA-Ag NCs的形成具有高度的序列依賴性，可基于此特性檢測(cè)核酸。例如，Zhang等[66]用兩種不同序列的DNA loop模板合成兩種Ag NCs，開(kāi)發(fā)了一種同時(shí)檢測(cè)H1N1基因和H5N1基因的方法。模板P1(或P2) 由不同成核序列的莖環(huán)以及含H1N1基因(或H5N1基因) 識(shí)別序列的雙鏈組成。當(dāng)加入H1N1基因(或H5N1基因) 時(shí)，莖環(huán)打開(kāi)，成核序列與Ag+結(jié)合，在還原劑NaBH4的作用下形成綠色(或橙色) 熒光的DNA-Ag NCs。P1模板合成的綠色熒光DNA-Ag NCs最大發(fā)射光為507 nm，P2模板合成的橙色熒光DNA-Ag NCs的最大發(fā)射光為597 nm。將兩種DNA-Ag NCs混合，分別用不同波長(zhǎng)的光進(jìn)行激發(fā)，實(shí)現(xiàn)了H1N1基因和H5N1基因的同時(shí)檢測(cè)。DNA-M NCs與恒溫指數(shù)放大反應(yīng)結(jié)合，可以提高檢測(cè)靈敏度。Ye等[71]通過(guò)設(shè)計(jì)特殊的DNA模板“AXAXB”，結(jié)合恒溫指數(shù)放大法，合成的Ag NCs對(duì)micro RNA的檢測(cè)限低達(dá)2 amol/L。

4.4 檢測(cè)蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是構(gòu)成細(xì)胞的基本有機(jī)物質(zhì)，與生命及各種形式的生命活動(dòng)緊密聯(lián)系在一起。適配體可與靶分子高親和力，高特異性結(jié)合。將適配體與熒光M NCs結(jié)合，可提高蛋白質(zhì)檢測(cè)的選擇性[24,72 - 74]。與其他檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法相比，其優(yōu)勢(shì)在于不需要額外的標(biāo)記分子(如染料等) ，因此方法更有效，成本降低。Martinez等[72]首次報(bào)道了以適配體功能化的DNA-Ag NCs檢測(cè)蛋白質(zhì)。DNA模板由凝血酶適配體和富C堿基組成，所合成的DNA-Ag NCs具有良好的光穩(wěn)定性。加入凝血酶后，熒光被猝滅，該方法對(duì)凝血酶的檢出限為1 nmol/L。由于適配體的高特異性，該方法對(duì)凝血酶具有良好的選擇性，其他蛋白質(zhì)的加入不會(huì)引起熒光猝滅。利用類似的“turn off”模式，實(shí)現(xiàn)了酶活性的檢測(cè)[73]。當(dāng)然，也可利用“turn on”模式實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的檢測(cè)[24,74]。例如，Yang等[74]通過(guò)設(shè)計(jì)兩條DNA探針P1和P2，實(shí)現(xiàn)了PDGF BB的高靈敏檢測(cè)。P1由PDGF BB適配體序列和發(fā)卡序列組成，P2由與P1發(fā)卡互補(bǔ)的序列和富C序列組成。當(dāng)向P1中加入PDGF BB和P2后，P1的適配體序列與PDGF BB結(jié)合，發(fā)卡打開(kāi)，發(fā)卡序列與P2中相應(yīng)的互補(bǔ)序列進(jìn)行配對(duì)，從而使富C序列裸露出來(lái)。加入Ag+和NaBH4后，產(chǎn)生熒光DNA-Ag NCs。該方法對(duì)PDGF BB的檢出限為0.37 nmol/L。

4.5 細(xì)胞標(biāo)記和成像

DNA-M NCs作為一種新型熒光探針，具有合成簡(jiǎn)單、粒徑小、毒性低、光穩(wěn)定性好，靶向性等優(yōu)點(diǎn)，逐漸應(yīng)用于細(xì)胞標(biāo)記與成像、細(xì)胞核染色等研究領(lǐng)域。目前，利用DNA-M NCs進(jìn)行細(xì)胞靶向成像主要分為兩種方式。第一種是先合成DNA-M NCs，再修飾生物素或抗體等特異性識(shí)別分子，通過(guò)“生物素-親和素”或“抗原-抗體”識(shí)別模式[75 - 76]對(duì)細(xì)胞進(jìn)行靶向成像；第二種是一步法合成適配體(sgc8c[77 - 78]、MUC-1[79 - 80]、AS1411[80 - 83]) 功能化的DNA-M NCs，以“適配體-靶標(biāo)”識(shí)別模式對(duì)細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別與成像，這種方法集合成和修飾為一體，無(wú)需再額外修飾識(shí)別分子。例如，Wang等[77]以sgc8c-A6-C12為模板，一步法合成了具有特異性識(shí)別功能的DNA-Ag NCs。其中sgc8c為識(shí)別適配體，A6為連接堿基，C12為Ag NCs的成核序列。利用sgc8c對(duì)CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞表面和細(xì)胞核的特異性識(shí)別作用，實(shí)現(xiàn)了CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞的靶向成像。除利用DNA-Ag NCs進(jìn)行單一熒光成像外，也可將DNA-Ag NCs與其他功能材料進(jìn)行復(fù)合，進(jìn)行雙模式成像。例如，Xu等[83]利用EDC/NHS連接PEG -Cd2O3和AS1411-Ag NCs，PEG -Cd2O3作為核磁共振成像(MR)造影劑，AS1411-Ag NCs作為熒光標(biāo)記物，實(shí)現(xiàn)了MCF-7癌細(xì)胞的MR和熒光雙模式成像。

5 結(jié)論與展望

DNA-M NCs是研究最為廣泛和最具特色的M NCs之一。DNA-M NCs具有超小尺寸、光化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、熒光光譜可調(diào)、生物相容性良好等優(yōu)點(diǎn)，使其成為構(gòu)建化學(xué)生物傳感平臺(tái)的新型熒光探針，在分析檢測(cè)、細(xì)胞成像等領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。盡管DNA-M NCs在分析化學(xué)中具有一定進(jìn)展，但其進(jìn)一步發(fā)展面臨一些挑戰(zhàn)。第一，缺少通用有效的方法設(shè)計(jì)DNA序列；第二，DNA-M NCs的合成機(jī)理及結(jié)構(gòu)研究尚處于初步階段；第三，與常見(jiàn)的有機(jī)染料和半導(dǎo)體量子點(diǎn)相比，DNA-M NCs的量子產(chǎn)率較低且成本較高，限制了其在分析檢測(cè)中的靈敏度和商業(yè)化推廣；第四，多數(shù)分析方法基于熒光猝滅，環(huán)境中多種已知或未知的因素也會(huì)造成熒光猝滅，選擇性有待提高。面對(duì)這些挑戰(zhàn)，需進(jìn)一步改進(jìn)、創(chuàng)新合成方法和深入的理論研究，以合成更穩(wěn)定、具有更好發(fā)光性能的DNA-M NCs。我們相信，DNA-M NCs作為一種超小且環(huán)境友好的熒光材料，在分析化學(xué)中有著光明的未來(lái)。

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