采用全外顯子測序分析技術(shù)診斷X連鎖慢性肉芽腫病一家系

許珊珊， 李奇淵,2， 吳謹準， 陳國兵， 朱碧溱， 谷為岳

慢性肉芽腫病(chronic granulomatous disease，CGD)是一種罕見的原發(fā)性免疫缺陷病，是因編碼NADPH氧化酶的基因缺陷引起。CGD的遺傳方式有X連鎖隱性遺傳(XR-CGD)及常染色體隱性遺傳(AR-CGD)等，其中X連鎖隱性遺傳更為常見[1]。XR-CGD是由編碼NADPH氧化酶的蛋白亞基gp91phox的CYBB基因突變引起[2-4]。2015年7月15日，筆者醫(yī)院收治1例臨床表現(xiàn)為反復感染，入院24 h內(nèi)迅速死亡的患者，采用二代測序方法進行全外顯子測序分析，對患者及家屬進行Sanger測序驗證，發(fā)現(xiàn)該患者攜帶CYBB基因上一個錯義突變(c.949T>A, p.M312K)，為半合子突變，確診為XR-CGD，報道如下。

1 病例介紹

1.1臨床資料 患者，男性，1歲3月，以“發(fā)熱10余天”為主訴入院?；颊呷朐呵?0余天無明顯誘因出現(xiàn)發(fā)熱，經(jīng)退熱抗感染治療無效，伴精神差、納差。出生后正常接種卡介苗?；純?月大時出現(xiàn)左腋下淋巴結(jié)腫大，生后多次反復發(fā)熱，反復發(fā)生肛周膿腫及頭皮癤腫。入院查體：體溫36.0 ℃，脈搏116 min-1，呼吸32 min-1，血壓120/68 mmHg(1 mmHg=133.3 Pa)，動脈血氧飽和度(arterial oxygen saturation，SaO2)96%。面色蒼白，精神差，全身皮膚散在陳舊性皮疹，部分有結(jié)痂，左腋下可及一腫大淋巴結(jié)，大小約4 cm×5 cm，邊界清楚，無觸痛，余淺表淋巴結(jié)未觸及腫大。咽充血，咽后壁可見一潰瘍，未見分泌物。頸軟。雙肺呼吸音粗，未聞及干、濕啰音。心音有力，律齊，心前區(qū)聞及Ⅱ/Ⅵ收縮期雜音。腹稍脹，肝肋下4～5 cm可及腫大，脾肋下未觸及腫大，腸鳴音4 min-1，肛周及外陰皮膚潮紅，未見破損。病理征陰性，CRT 1 s。入院后患兒生命征不穩(wěn)定，出現(xiàn)休克癥狀，予擴容補液、抗感染、呼吸機輔助通氣，予血管活性藥物、輸注血液制品、鎮(zhèn)靜等對癥處理。后患兒出現(xiàn)心跳驟停，經(jīng)搶救無效于2015-07-16死亡。

1.2二代測序 在知情同意的前提下，采集患者及其家屬全血各2 mL(EDTA抗凝血)，使用血液基因組中量提取試劑盒(Blood Gen Midi Kit，中國CWBIO公司)提取全基因組DNA。參考文獻及OMIM數(shù)據(jù)庫、NCBI數(shù)據(jù)庫的信息，將人類已知的全部(約2萬個)基因的基因組外顯子區(qū)域定制羅氏Nimble Gen捕獲探針，進行全外顯子捕獲。合格的基因組DNA被Cavoris儀隨機打斷至200 bp左右，片段化DNA在Klenow Fragment、T4 DNA polymerase和T4PNK的作用下進行末端補平修復。在聚合酶體系下，使上一步得到的修復產(chǎn)物在3′末端加上A堿基，最后在兩端加上接頭。加上接頭后的連接產(chǎn)物經(jīng)4～6輪LM-PCR擴增，將文庫與探針雜交60～68 h，使用鏈霉素磁珠進行洗脫，洗脫產(chǎn)物經(jīng)10輪LM-PCR擴增。PCR產(chǎn)物在Illumina hiseq2500平臺標準化上機測序，測序數(shù)據(jù)利用Illumina的軟件進行分析處理。參考序列為hg19基因組。根據(jù)測序深度及突變質(zhì)量，對檢測到的變異進行過濾篩選，依據(jù)1000Genomes Project，Exome Variant Server (EVS)及Exome Aggregation Consortium (ExAC)數(shù)據(jù)庫，濾除人群中突變頻率>1%的變異，去除內(nèi)含子變異、同義變異(除外位于剪切位點的變異)等，篩選出可能致病的變異，同時使用SIFT等軟件對篩選出的突變對蛋白功能的影響進行預(yù)測。結(jié)合患兒的臨床表現(xiàn)及遺傳方式，得到可能致病的突變。

1.3一代測序(Sanger法)驗證 根據(jù)CYBB基因所驗證位點序列設(shè)計引物，采用PCR方法進行擴增。PCR擴增產(chǎn)物用ABI 3730XL測序儀測序，基因序列分析采用DNASTAR軟件進行序列分析和比對。

1.4結(jié)果

1.4.1實驗室檢查結(jié)果 該患兒血液免疫功能相關(guān)檢查基本正常(表1)。

表1 患兒血液實驗室檢查相關(guān)結(jié)果

1.4.2測序結(jié)果 目標區(qū)域平均測序深度為66.08，目標區(qū)域覆蓋度99.7%，89.76%目標區(qū)域>10×覆蓋度，78.11%目標區(qū)域>20×覆蓋度。

二代測序方法進行全外顯子測序分析，發(fā)現(xiàn)患者的CYBB基因第9外顯子存在半合子突變，進一步對患者及其家屬用Sanger測序法驗證該位點的突變情況，證明患者CYBB基因攜帶一個已知錯義突變(c.949T>A, p.M312K)，來源于母親及外婆(圖1)，而其小姨并未攜帶該突變(參考序列NM-000397.3)。全外顯子測序結(jié)果還顯示，與免疫缺陷性疾病有關(guān)的3個基因存在堿基變異(表2)，但后續(xù)通過遺傳方式及與臨床表型的關(guān)聯(lián)程度排除了該3個變異的致病性。

2 討 論

A：患者家系圖，其母親、外祖母均為該突變的攜帶者；B：患者及其父母、外婆、小姨Sanger測序驗證CYBB基因c.949堿基改變. 參考序列NM-000397.3.圖1 患者家系圖及測序圖譜Fig 1 Pedigree and Sanger sequencing resultsof the family

Tab2Summary of variations in other genes related with immunodeficiency disease revealed by whole exome sequencing in this patient

基因染色體位置核酸改變氨基酸改變Rs編號突變類型SELPChr1c．1334G>C(E9)p．445，A>Grs116959152雜合NCF2Chr1c．836G>A(E8)p．279，T>Mrs13306581雜合ZAP70Chr2c．66G>T(E3)p．22，E>D-雜合

CGD是一種罕見的原發(fā)性免疫缺陷病，是由吞噬細胞功能缺陷引起的，發(fā)病率大約為1/250 000～1/200 000。其主要臨床表現(xiàn)是嚴重的反復的細菌及真菌感染，以及因反復炎癥造成的胃腸道、泌尿生殖道等器官的肉芽腫增生。臨床診斷主要依靠典型的臨床癥狀、硝基四唑氮藍(NBT)試驗及中性粒細胞呼吸爆發(fā)試驗等[5-6]，確診仍需依靠基因檢測。本研究中，患者入院時已處于感染導致膿毒血癥的狀態(tài)，后迅速出現(xiàn)休克，于入院第2天搶救無效死亡。結(jié)合患者既往多次感染病史，考慮其患有某種免疫缺陷病，患者死亡時免疫功能相關(guān)檢查(體液免疫及細胞免疫功能)尚未回報，因此在征得患者家屬同意的情況下，及時外送基因檢測公司進行全外顯子測序，最終證實了XR-CGD的診斷?；仡櫺苑治鲈摶颊叩呐R床表現(xiàn)，與CGD相符。其主要表現(xiàn)為反復感染，感染部位累及皮膚(頭皮、肛周)及肺，同時還有卡介苗接種同側(cè)腋窩淋巴結(jié)腫大。實驗室檢查提示，細胞及體液免疫功能正常。因此，對于臨床上有患者出現(xiàn)反復感染，懷疑免疫缺陷，但常規(guī)細胞免疫及體液免疫功能卻正常的患者，應(yīng)考慮CGD可能。

CGD是因編碼NADPH氧化酶的基因缺陷引起。NADPH氧化酶由5個蛋白亞單位組成：gp91phox，p22phox，p47phox，p67phox，p40phox。其中XR-CGD是最常見的類型，約占CGD病例的60%，是由編碼gp91phox蛋白的CYBB基因突變引起[3-4]。CYBB基因位于Xp21.1，該基因長30 kb，包含13個外顯子。據(jù)HGMD網(wǎng)站報道，截止至2015年12月已發(fā)現(xiàn)CYBB基因突變700余種，最常見的突變類型是錯義突變。不同的突變引起吞噬細胞gp91phox蛋白功能表達的不同，從而引起氧化酶功能障礙[2]。

本例患者攜帶的突變?yōu)閏.949T>A，引起第312位蛋白質(zhì)由蛋氨酸變?yōu)橘嚢彼?。該突變由Lee于2008年報道[7]，Lee的研究中攜帶該突變的患者的臨床表現(xiàn)為肺膿腫、肛周膿腫及淋巴結(jié)炎，無結(jié)核及卡介苗接種并發(fā)癥。本研究中，患者接種卡介苗的同側(cè)腋窩淋巴結(jié)出現(xiàn)明顯腫大，余淋巴結(jié)未見腫大，但因未行淋巴結(jié)活檢，未能推測其是否有淋巴結(jié)結(jié)核或卡介苗感染。Lee等報道，17例患者中有14例患有結(jié)核或卡介苗相關(guān)并發(fā)癥，患病率較高[7]。在我國，卡介苗屬于計劃免疫的部分，一般在生后3 d內(nèi)接種，所以對于有免疫缺陷病家族史的患兒，避免接種卡介苗可減少結(jié)核或卡介苗感染的發(fā)病率。目前美國已采用TREC試驗對重癥聯(lián)合免疫缺陷病(severe combined immunodeficiency, SCID)進行篩查[8]，期待未來能針對CGD、SCID等免疫缺陷病開展新生兒篩查。

Roos等還報道過1例CYBB基因第312位蛋白質(zhì)改變的病例[2]。該患者的947位堿基T被替換為G，從而導致蛋氨酸變?yōu)榫彼?，進行蛋白表達及酶學測定后，判定其為x91+型，即gp91phox蛋白表達正常，NADPH氧化酶活性缺失[4]。本病例與該病例相比，同為第949位堿基發(fā)生改變，導致312位蛋白質(zhì)變?yōu)榫彼峄蛸嚢彼幔呔袔д姾傻膫?cè)鏈，同為堿性氨基酸。所以推測c.949T>A(p.M312K)可能也為x91+型，可引起酶活性基本缺失。

近幾年，隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展，費用降低，測序速度加快，已成為罕見單基因遺傳病診斷的重要方法之一。通過二代測序技術(shù)，可以快速地對目的基因組合或全外顯子進行測序，使得對罕見病、疑難病的診斷變得更加容易[9]。如本例患者，病情進展迅速，入院1 d內(nèi)即死亡，臨床實驗室檢查尚來不及完善，而通過二代測序技術(shù)進行全外顯子測序分析，明確診斷，并可對家屬提供遺傳咨詢。由于同時對全外顯子進行測序，測序結(jié)果可能會提示多個基因攜帶變異。如本研究全外顯子測序結(jié)果顯示了另外3個與免疫缺陷性疾病有關(guān)的基因上存在堿基變異。與SELP基因及NCF2基因相關(guān)的疾病為遺傳性IgE反應(yīng)過敏癥及遺傳CGD細胞色素B陽性2型，均為常染色體顯性遺傳，但在此2個基因上發(fā)現(xiàn)的變異均為NCBI dbSNP數(shù)據(jù)庫中記載的已知SNP位點，其臨床意義為良性。因ZAP70突變引起的選擇性T細胞缺陷病為常染色體隱性遺傳病，該患者攜帶ZAP70雜合突變，故不會致病。所以全外顯子測序檢測出的這3個基因變異均無臨床意義。這就需要臨床醫(yī)師進行鑒別分析，過濾或剔除無用信息，找到真正的致病突變。

綜上所述，對于臨床癥狀不典型，或因不可抗拒原因(如患者死亡)而造成臨床資料不完善，無法進行臨床診斷時，采用二代測序技術(shù)進行目的基因組合或全外顯子測序，可以幫助醫(yī)師明確診斷，并對患者家庭提供可靠的遺傳咨詢。

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