AKT抑制劑對結直腸癌肝轉移患者腫瘤浸潤T淋巴細胞生物學活性的影響

徐本玲　周進學　袁龍　陳廣玉　韓露　秦鵬　高全立

鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院1生物免疫治療中心，2肝膽科，3普外科（鄭州450008）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是人類常見的惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)腫瘤相關的病死率中結直腸癌處于第3位［1］。由于生活方式的轉變，近年我國結直腸癌總體發(fā)病率呈上升趨勢。雖然，CRC的診斷和治療均取得了較快的發(fā)展，CRC的治療仍然以外科手術為主，然而許多患者因早期癥狀不明顯，就診時已屬中晚期，預后較差。研究表明，炎癥相關的腫瘤微環(huán)境與CRC患者較好的預后相關，因此對于CRC患者來說，免疫治療可能成為一種有效的新的治療方法。腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）具有特異性殺傷腫瘤細胞的功能。ROSENBERG等［2］利用TIL聯(lián)合全身放化療治療惡性黑色素瘤，將其臨床反應率提高到70%，明顯延長了患者的生存期，獲得了令人振奮的結果。研究［2-4］表明，惡性黑色素瘤患者對TIL的臨床反應率與TIL細胞中記憶細胞的表達，及TIL在回輸后能夠在體內(nèi)存在的時間長短有關。AKT抑制劑能夠增加惡性黑素瘤患者TIL中記憶細胞的數(shù)量及在實驗動物體內(nèi)的持久性［5］，但AKT抑制劑對TIL培養(yǎng)過程中免疫因素的影響尚無相關報道。

鑒于上述原因，本研究通過流式細胞學檢測AKT抑制劑對CRC肝轉移患者TIL增殖，分化及功能的影響，旨在探討一種有效增強TIL細胞功能及延長其在體內(nèi)存在的培養(yǎng)體系，從而為肝癌臨床治療提供新的思路及方法。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2016年1月至2016年12月入住鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院普外科行手術的結直腸癌肝轉移患者的組織標本。本研究經(jīng)鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準實施，標本采集均征得患者本人同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1試劑重組人IL?2為山東泉港藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，RetroNectin，GT?T551無血清培養(yǎng)基（人淋巴細胞培養(yǎng)基），CD3MAb均為北京寶日醫(yī)生物技術有限公司產(chǎn)品，抗 PD?1?FITC，抗 CD4?PerCP?cy5.5，抗CD4?FITC，抗Tim?3?PE，抗CD3?PEcy7，抗CD8?PerCP?cy5.5，抗 CD45RA?FITC，抗 CCR7?PEcy7，抗 CD25?APC，抗 FOXP3?PE，抗 Ki?67?PE，購自美國BIOLENG公司，抗IFN?γ?APC為eBiosci?ence產(chǎn)品。Elisa試劑盒（IFN?γ，IL?10，TNF?α）購自達科為生物技術有限公司。

1.2.2腫瘤組織的收集患者簽署知情同意書后，于手術當中將切下的腫瘤組織放到事先準備好的含有慶大霉素（900 IU/mL），青霉素（500 IU/mL）和鏈霉素（500 μg/mL）的GTT?551無血清培養(yǎng)基中，立即送往實驗室進行下一步的實驗檢測。

1.2.3TIL及腫瘤單細胞懸液的分離將腫瘤組織剪切成1～2 mm3的組織碎塊，放入事先配好的胰蛋白酶混合液中（含膠原酶Ⅰ1 μg/mL，膠原酶Ⅳ1 μg/mL，DNase 25 μg/mL，含2%的胎牛血清），然后將細胞放入自動旋轉儀上，置于37℃培養(yǎng)箱中，每30 min觀察1次，根據(jù)組織的消化情況，終止反應（加入胎牛血清，其終濃度為5%）。采用不同percoll密度進行梯度離心，收集40%percoll表面的腫瘤細胞，放入事先準備好的凍存液中（含80%的DMSO和10%人AB血漿和10%1640培養(yǎng)液），立即放入-80℃低溫冰箱備用。取40%和70%percoll中間白膜層的腫瘤浸潤淋巴細胞，分成IL?2組（6 000 IU/mL）和AKT組（培養(yǎng)過程中加入1 μmol/mL 的AKT抑制劑和6 000 IU/mL的IL?2）進行培養(yǎng)。根據(jù)細胞培養(yǎng)情況，進行傳代并計數(shù)。細胞培養(yǎng)至第10天，兩組均加入抗CD3抗體，繼續(xù)原培養(yǎng)液培養(yǎng)20 d。

1.2.4細胞增殖活性的測定每3天抽取培養(yǎng)孔中的TIL細胞1 mL，混勻，用胎盤藍計數(shù)細胞總數(shù)，實驗重復5次，計算平均值，根據(jù)細胞增殖倍數(shù)繪制生長曲線。

1.2.5細胞表型測定流式細胞學方法檢測AKT抑制劑對TIL的數(shù)量、組成和比例的影響。每5天每組取2×106的細胞進行流式檢測。分別吸取相應的熒光標記的特異性抗體各5 μL加入流式管，混合均勻，置于冰上避光孵育20 min。同時設各熒光減一同型對照管做對照。加2 mL FACS（含5%牛血清白蛋白和0.09%疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液）洗滌，離心棄上清后，300 μL的FACS重懸細胞，渦旋混勻，避光待上機分析。細胞中IFN?γ（anti?IFN?γ?APC，eBioscience），F(xiàn)oxp3，Ki?67 的檢測按照胞內(nèi)染色說明書進行。應用FlowJo軟件進行數(shù)據(jù)分析，記錄陽性細胞比例。

1.2.6細胞因子的測定在培養(yǎng)過程中的第5、10、15、20、25、30天分別取培養(yǎng)兩組的TIL細胞3 mL，以1 × 106/孔接種24孔板，培養(yǎng)24 h，收集上清檢測細胞因子的分泌情況。操作嚴格按Elisa試劑盒說明書進行。

1.2.7細胞毒性T淋巴細胞分泌IFN?γ能力的檢測取培養(yǎng)第25天的TIL和經(jīng)射線輻照過的自體腫瘤細胞共培養(yǎng)6 h，加入自體腫瘤細胞后2 h加入BFA，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，胞內(nèi)染色法比較兩組分泌IFN?γ細胞的差異。

1.3統(tǒng)計學方法應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料采用平均數(shù)±標準差進行描述。組間比較采用t檢驗。所有實驗均重復5次，所有檢驗均為雙側檢驗，P＜0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1TIL細胞的增殖活性從結直腸癌肝轉移患者的腫瘤組織中能夠成功培養(yǎng)出TIL細胞。筆者首先分析了AKT抑制劑對TIL細胞增殖的影響。結果顯示：IL?2組與AKT抑制劑組（AKTi組）相比，抗CD3抗體刺激前（第5、10天）和刺激后（第15、20、25、30天）各時間點細胞計數(shù)均無明顯差異，見圖1A。

圖1　IL?2組與AKTi組細胞生長曲線與PD?1+Tim?3+細胞的比較Fig.1　The growth curve and the expression of PD?1+Tim?3+on CD8+T cells in group IL?2 and AKTi

2.2TIL細胞的免疫表型PD?1及Tim?3共表達是T細胞耗竭的標志。動態(tài)檢測AKT抑制劑對TIL的免疫表型結果顯示：PD?1+Tim?3+的細胞占CD8+T細胞的比例在培養(yǎng)過程中先降低，在抗CD3抗體刺激后出現(xiàn)短暫上升，進而逐漸降低，但兩組間比較并無明顯差異。筆者的結果提示在培養(yǎng)過程中加入AKT抑制劑并沒有增加PD?1+Tim?3+細胞占CD8+T細胞的比例見圖1B。統(tǒng)計分析兩組調節(jié)T細胞CD4+CD25+Foxp3+占CD3+T細胞的比例，結果亦無明顯差異。

從培養(yǎng)的第5天起，AKT抑制劑組CD8+T細胞上中心記憶T細胞（Tcm，CCR7+CD45RA-）的比例明顯增高（13.98%vs.9.14%，P＜0.05），這種趨勢一直持續(xù)到抗CD3抗體刺激后。培養(yǎng)至第25天（抗CD3抗體刺激后第15天）時，AKT抑制劑組CD8+T細胞上中心記憶T細胞（Tcm）的比例最高，見圖2。

2.3TIL細胞上清中細胞因子的含量分別取各組培養(yǎng)第5、10、15、20、25和30天的培養(yǎng)上清，用Elisa細胞因子檢測試劑盒進行 IFN?γ，TNF?α和IL?10的檢測。結果顯示，IFN?γ和TNF?α隨著培養(yǎng)時間的延長，分泌量逐漸升高，且AKT抑制劑組IFN?γ的分泌量明顯高于IL?2組。IL?10的分泌量雖亦逐漸增加，但兩組比較無明顯差異，見圖3。

圖2　IL?2組與AKTi組細胞Tcm的比較Fig.2　The expression of Tcm on CD8+T cells in group IL?2 and AKTi

圖3　IL?2組與AKTi組不同時間點IFN?γ,TNF?α及IL?10的分泌情況Fig.3　The secretion profile of IFN?γ,TNF?α and IL?10 on CD8+T cells at different time point in group IL?2 and AKTi

2.4細胞毒性T淋巴細胞分泌IFN?γ能力的檢測因為培養(yǎng)第25天時，細胞的數(shù)量及Tcm的含量均較高，進而我們?nèi)∨囵B(yǎng)第25天的TIL細胞用自體腫瘤細胞檢測了TIL中細胞毒性T淋巴細胞分泌IFN?γ能力的差異。結果顯示：AKT抑制劑組分泌IFN?γ的細胞的比例明顯高于IL?2組（P＜ 0.05），代表性的流式圖見圖4。

圖4　自體腫瘤細胞刺激兩組TIL中細胞毒性T淋巴細胞分泌IFN?γ能力的代表性的流式圖Fig.4　A representative flow diagram of IFN?gamma stimulated by auto?tumor cells in cytotoxic T lymphocyte of TIL in group IL?2 and AKTi

3　討論

TIL治療的臨床反應率與TIL細胞中記憶細胞的表達，及其回輸后在體內(nèi)存在的時間長短有關。越來越多的研究結果提示如果回輸?shù)腡IL中含有較多的記憶細胞，會延長TIL回輸后在體內(nèi)的存活率，進而提高其治療效率［6］。這一觀點進一步在小鼠動物模型中得到證實，隨著TIL細胞逐漸分化成終末分化的T細胞，其抗腫瘤功能及在體內(nèi)持續(xù)存在的能力均減低［7］。因此，如果能夠提高TIL中免疫記憶細胞的數(shù)量，可能會增強TIL的抗腫瘤免疫效能，成為進展期腫瘤的有效治療手段。

PI3K/Akt/mTOR信號通路在CD8+T細胞分化及記憶形成中發(fā)揮重要作用。AKT信號的丟失或減弱不會影響T細胞的增殖及活性，但會導致已分化的細胞毒性T淋巴細胞的轉錄重排，使效應細胞轉化成記憶細胞［8］。本研究結果也表明從結直腸癌肝轉移的腫瘤組織中分離的浸潤的T淋巴細胞，在培養(yǎng)過程中加入AKT抑制劑，無論是在抗CD3抗體刺激前還是在抗CD3抗體刺激后，CD8+T淋巴細胞上的Tcm均高于IL?2組。由于過繼細胞免疫治療的效果，不僅取決于回輸?shù)募毎馁|量，而且回輸?shù)募毎臄?shù)量也非常重要。因此，本研究還對AKT抑制劑對TIL的增殖能力的影響進行了檢測，結果顯示，兩組TIL的增殖能力并無明顯差異。這一結果與文獻報道的AKT抑制劑在增加惡性黑色素瘤浸潤的T淋巴細胞中記憶細胞的擴增而并不影響其增殖能力的結果一致［5］。

PD?1不僅是細胞活化的標志，還是細胞免疫因子，當PD?1和Tim?3共表達時，往往提示細胞的功能障礙［10］。筆者進一步分析了AKT抑制劑對TIL細胞免疫表型的影響，結果顯示：PD?1+Tim?3+細胞的比例在抗CD3抗體刺激前逐漸降低，刺激后短暫升高，繼而又逐漸減低，但兩組比較并無明顯差異。這可能是因為腫瘤組織中CD8+T細胞的PD?1+Tim?3+表達較高，但由于體外培養(yǎng)過程中脫離了腫瘤的微環(huán)境，比例逐漸下降，但在抗CD3抗體刺激后出現(xiàn)短暫升高繼而下降的趨勢，這與文獻報道的細胞因子誘導的殺傷細胞在體外培養(yǎng)過程的趨勢一致［9］。調節(jié)T細胞的結果顯示，AKT抑制劑的加入并未增加抑制性調節(jié)T細胞的數(shù)量。對比兩組培養(yǎng)上清中細胞因子的分泌結果顯示：隨著時間的延長，IFN?γ的分泌量逐漸升高，且AKT抑制劑組明顯高于IL?2組。IL?10最初被認為是具有免疫抑制作用的抗炎分子，近年來的研究發(fā)現(xiàn)IL?10還具有免疫活化作用，可以通過對T細胞的免疫活化作用促進腫瘤特異性免疫監(jiān)視并減少致病性炎癥反應的發(fā)生［11］。本研究結果顯示IL?10及TNF?α隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸升高，這與MESIANO等［12］最近報道的動態(tài)監(jiān)測CIK細胞上清中細胞因子的變化一致。進而筆者用自體腫瘤細胞刺激檢測TIL中分泌IFN?γ的細胞，結果顯示AKT抑制劑組分泌IFN?γ的細胞明顯高于IL?2組，這與上清中檢測到的結果一致。

綜上所述，在傳統(tǒng)培養(yǎng)TIL的體系中加入AKT抑制劑，能夠增加其中心記憶T淋巴細胞的數(shù)量，增強其分泌IFN?γ的能力，且并不影響TIL的增殖，并未增加免疫抑制因子的數(shù)量，為TIL細胞的臨床安全應用提供了很好的借鑒。

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