人乳頭瘤病毒E6蛋白通過(guò)上調(diào)氯離子蛋白通道5的表達(dá)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移

趙凱旋，徐靜云，盧春

（南京醫(yī)科大學(xué)病原微生物學(xué)系，江蘇南京211166）

高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）持續(xù)感染是宮頸癌致病的關(guān)鍵因素，約99.7%的宮頸鱗狀細(xì)胞癌由HPV感染引起［1－2］。高危型HPV感染宮頸上皮細(xì)胞后可編碼兩種重要的致瘤蛋白——E6和 E7蛋白，以維持細(xì)胞的轉(zhuǎn)化特性［3－6］。研究顯示，E6通過(guò)結(jié)合并泛素化降解腫瘤抑制基因p53，阻斷細(xì)胞凋亡，E7則通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白pRb，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子E2F的釋放，從而調(diào)控細(xì)胞周期［7－8］，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。隨著 HPV E6蛋白在誘導(dǎo)宮頸癌發(fā)生的分子機(jī)制方面的研究不斷深入，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，HPV E6還可通過(guò)激活端粒酶活性、結(jié)合并降解含有PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白等途徑促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展［9］。深入研究HPV E6蛋白促進(jìn)宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制將有助于發(fā)現(xiàn)診斷和治療宮頸癌的有效靶標(biāo)。

氯離子蛋白通道5（chloride voltage-gated channel 5，CLCN5）基因編碼的蛋白主要定位于內(nèi)體膜，可促進(jìn)腎近端小管對(duì)白蛋白的攝取［10－12］。已有文獻(xiàn)證明CLCN5基因的突變可導(dǎo)致Dent病［13］。然而，CLCN5基因在腫瘤尤其是在宮頸癌中的作用卻未見報(bào)道。

本研究在 HPV18陽(yáng)性的HeLa細(xì)胞中敲低HPV E6后檢測(cè)CLCN5基因的表達(dá)。構(gòu)建含CLCN5基因的重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒以及CLCN5的小干擾RNA（siCLCN5）分別轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa細(xì)胞，觀察CLCN5在宮頸癌細(xì)胞遷移過(guò)程中的作用。

1　材料與方法

1.1　細(xì)胞與試劑

人宮頸癌HeLa細(xì)胞和人胚腎293T細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）；pCDNA3.1-3×Flag（簡(jiǎn)稱 pCDNA3.1）表達(dá)載體為本實(shí)驗(yàn)室保存；E6小干擾RNA（siE6）和siCLCN5由上海吉瑪公司合成；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）酶以及PCR所用的2×Phata HSMaster Mix購(gòu)自南京諾維贊科技有限公司；PCR引物由南京鉑尚生物技術(shù)有限公司合成；限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ和NotⅠ（日本TaKaRa公司）；T4連接酶（美國(guó)Thermo Scientific公司）；胎牛血清（Gibco公司）；LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）；抗CLCN5單克隆抗體（南京巴傲得生物科技有限公司）；抗α微管蛋白單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；抗HPV18 E6抗體（Abcam公司）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；Transwell小室（Millipore公司）。

1.2　E6和 CLCN5 siRNAs的轉(zhuǎn)染

將E6 siRNA和CLCN5 siRNA凍干粉瞬時(shí)離心至管底，加入無(wú)RNA酶水配制成終濃度為20μmol／L的樣品。選取生長(zhǎng)良好的HeLa細(xì)胞接種于6孔板。次日，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%匯合度時(shí)，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000分別將siRNAs及其陰性對(duì)照（NC）轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞中，6 h后將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。48 h后提取細(xì)胞總RNA和總蛋白，分別用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mRNA和目的蛋白的表達(dá)。

1.3　RT-qPCR檢測(cè)E6和CLCN5 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

用Trizol試劑分別提取轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照和E6 siRNA兩組細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，RT-qPCR檢測(cè)E6和CLCN5mRNA的表達(dá)水平。反應(yīng)體系：SYBR混合物10μL，上下游引物各0.4 μL，蒸餾水8.2μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃10 s、60℃30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后以95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s采集熔解曲線。

1.4　蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)HeLa細(xì)胞中E6和CLCN5蛋白的表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照和E6 siRNA的細(xì)胞，提取總蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜，經(jīng)5%脫脂牛奶封閉后將PVDF膜浸在E6和CLCN5一抗（用一抗稀釋液以1∶1 000的比例稀釋）中，4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜后，用相應(yīng)的二抗37℃孵育1 h，進(jìn)行蛋白顯色。

1.5　PCR擴(kuò)增CLCN5基因

根據(jù)CLCN5基因的核酸序列設(shè)計(jì)PCR上下游引物。上游引物（下劃線為 Bam HⅠ識(shí)別序列），下游引物A-3′（下劃線為NotⅠ識(shí)別序列）。以293T細(xì)胞基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增CLCN5序列。通過(guò)1%瓊脂糖核酸電泳鑒定PCR產(chǎn)物并進(jìn)行切膠回收。

1.6　過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1-CLCN5的構(gòu)建與鑒定

用限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ和NotⅠ分別雙酶切載體pCDNA3.1和切膠回收的PCR產(chǎn)物，雙酶切產(chǎn)物純化后經(jīng)T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸埃希菌DH5α中，涂板并挑取有氨芐西林抗性的菌落進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定及核酸序列測(cè)定。

1.7　CLCN5在宮頸癌HeLa細(xì)胞中的表達(dá)

用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000分別將空載體 pCDNA3.1和上述構(gòu)建好的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1-CLCN5轉(zhuǎn)染到宮頸癌HeLa細(xì)胞中，48 h后提取兩組細(xì)胞的總蛋白，蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證標(biāo)簽蛋白和CLCN5蛋白的表達(dá)。

1.8　Transwell遷移實(shí)驗(yàn)

將Transwell小室置于24孔板中，向下室加入500μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。將1×104個(gè)細(xì)胞重懸于200μL純DMEM培養(yǎng)基中，并接種至Transwell上室中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，甲醇固定15 min，結(jié)晶紫染色15 min，流水漂洗晾干后置于顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.9　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組均數(shù)間的比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　敲低HPV E6對(duì)宮頸癌細(xì)胞中CLCN5表達(dá)水平的影響

RT-qPCR和蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，E6的mRNA和蛋白水平被明顯敲低，且與對(duì)照組相比，敲低E6后CLCN5的mRNA和蛋白水平也顯著下降（圖1）。

圖1　敲低HPV E6對(duì)宮頸癌細(xì)胞CLCN5表達(dá)的影響

2.2　過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pCDN3.1-CLCN5的構(gòu)建與鑒定

以293T細(xì)胞基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增CLCN5基因，利用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，大小約2 490 bp（圖2左），與預(yù)期條帶大小一致。采用限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ和NotⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pCDNA3.1-CLCN5，結(jié)果顯示出兩條特異性片段，大片段為載體pCDNA3.1，大小為5 508 bp，小片段為基因 CLCN5，大小為2 490 bp（圖2右）。核酸序列測(cè)定及比對(duì)結(jié)果顯示，插入的CLCN5基因序列正確，提示重組質(zhì)粒 pCDNA3.1-CLCN5構(gòu)建成功。

圖2　重組質(zhì)粒pCDNA3.1-CLCN5的構(gòu)建與鑒定

2.3　過(guò)表達(dá)CLCN5對(duì)HeLa細(xì)胞遷移的影響

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，CLCN5在HeLa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)成功（圖3A）。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)CLCN5組的宮頸癌細(xì)胞的遷移數(shù)量明顯多于對(duì)照組（P＜0.01，圖3B），提示過(guò)表達(dá) CLCN5可以促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移。

2.4　敲低CLCN5基因?qū)eLa細(xì)胞遷移的影響

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siCLCN5后，HeLa細(xì)胞中CLCN5蛋白的表達(dá)水平得到有效抑制。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，敲低CLCN5后HeLa細(xì)胞遷移數(shù)量明顯減少，表明敲低CLCN5可顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移。見圖4。

圖4　敲低CLCN5對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞遷移的影響

3　討論

宮頸癌是導(dǎo)致女性癌癥死亡的第3主要原因［14］。其致病因素多種多樣，包括初次性生活的年齡、多個(gè)性伴侶、多次分娩、吸煙以及HPV的感染等。其中，高危型HPV的持續(xù)感染與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。HPV基因組包含早期基因區(qū)、晚期基因區(qū)以及長(zhǎng)控制區(qū)，由早期基因區(qū)編碼的E6、E7早期蛋白在病毒的生命周期及細(xì)胞轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，HPV E6蛋白通過(guò)E6AP泛素途徑降解p53是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的重要分子機(jī)制［15－16］。HPV E6可通過(guò)調(diào)節(jié)鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲［17］。且 E6可通過(guò)上調(diào) miRNA-20b的表達(dá)，靶向抑制TIMP-2，從而增加宮頸癌細(xì)胞的侵襲力。E6還可活化鈣調(diào)磷酸酶-NFAT信號(hào)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖［18］。HPV E6靶向 TRIM25和USP15后可拮抗細(xì)胞質(zhì)先天性免疫傳感器RIG-1的活化［19］。同時(shí)，E6還可通過(guò)分泌促炎細(xì)胞因子和趨化因子修飾細(xì)胞微環(huán)境，從而影響免疫應(yīng)答的功效［20］。充分了解和研究HPV E6蛋白的致病機(jī)制，對(duì)尋找預(yù)防和治療宮頸癌的潛在靶標(biāo)有重要意義。

既往研究結(jié)果表明，CLCN5基因突變可導(dǎo)致Dent病的發(fā)生，然而CLCN5基因在宮頸癌中的作用并未被闡明，且TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果顯示，CLCN5在宮頸癌中高表達(dá)。因此，我們猜測(cè)CLCN5可能參與調(diào)控了宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)選取了HPV18陽(yáng)性的HeLa細(xì)胞，采用RNA干擾技術(shù)敲低E6表達(dá)，結(jié)果顯示，CLCN5 mRNA和蛋白水平均顯著下調(diào)，提示HPV E6蛋白可能通過(guò)上調(diào)CLCN5的表達(dá)促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展，過(guò)表達(dá)和敲低CLCN5后的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也初步證實(shí)CLCN5具有促進(jìn)宮頸癌HeLa細(xì)胞遷移能力的作用。目前對(duì)于HPV E6蛋白調(diào)控CLCN5基因的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究，HPV E6蛋白可能通過(guò)結(jié)合并激活CLCN5啟動(dòng)子促進(jìn)CLCN5的表達(dá)；HPV E6蛋白還可能通過(guò)促進(jìn) p53降解上調(diào) CLCN5基因；此外，HPV E6蛋白可能通過(guò)抑制某些miRNAs的表達(dá)，使得CLCN5表達(dá)量增加，從而促進(jìn)宮頸癌的遷移。

綜上所述，本研究證實(shí)了 HPV E6蛋白對(duì)CLCN5基因的正調(diào)控作用，并且初步表明了CLCN5在宮頸癌細(xì)胞中具有促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用，為探索HPV E6蛋白調(diào)控CLCN5在腫瘤中的作用提供了線索，且CLCN5有望成為預(yù)防和治療宮頸癌的新靶點(diǎn)。

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