用于腫瘤靶向性X線CT造影劑和抗腫瘤藥物傳遞的多功能含碘納米粒子的制備和表征

朱 穎 ，張 巖 ，陳　研 ，楊曉英

（1.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300070；2.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，天津 300211）

計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的非侵入性成像診斷技術(shù)之一，在臨床已經(jīng)使用大半個(gè)世紀(jì)。為增強(qiáng)軟組織的對(duì)比度，人們研制了多種CT造影劑。目前臨床上廣泛使用的水溶性造影劑均為三碘苯環(huán)的衍生物，如碘海醇、碘帕醇、碘普羅胺、泛影葡胺等。然而，由于這些CT造影劑均為含碘小分子，在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間短，無(wú)選擇性，大劑量使用又會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重不良反應(yīng)及部分患者過敏的問題，因而極大地限制了它們?cè)谝恍┎课蝗缒[瘤、肝、淋巴結(jié)等部位的靶向成像和血管造影[1]。過去十幾年中，研究者利用納米粒子的可體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)、實(shí)體瘤組織的高通透性和滯留效應(yīng)（EPR效應(yīng)）、容易進(jìn)行表面修飾及整合多功能于一體等獨(dú)特的性能來解決這一問題。大量研究集中于將臨床應(yīng)用的碘代小分子發(fā)展成碘代納米粒子，包括乳液[2-3]、脂質(zhì)體[4-7]、脂質(zhì)蛋白[8-9]、聚合物納米粒子[10-14]和不溶性納米材料[15]等。這些納米材料的主要目的是增加碘的濃度和達(dá)到一定粒徑，使其對(duì)比度能高于常規(guī)水溶性CT對(duì)比劑，并達(dá)到與臨床所用碘代小分子對(duì)比劑不一樣的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)效果。此外，一些研究將具有高吸收X線性能的金屬和無(wú)機(jī)納米粒子引入碘對(duì)比劑，用以增加其對(duì)比性能。如金元素由于具有比碘高的原子序數(shù)以及對(duì)X線衰減貢獻(xiàn)較大的光電效應(yīng)，受到廣泛關(guān)注，許多基于Au納米粒子的對(duì)比劑用于體內(nèi)X線CT成像[16-18]。我們之前的研究[19]和Peng等[20]的研究結(jié)果均表明，當(dāng)金與碘這兩種高度不透X線的元素結(jié)合在一起時(shí)，二者具有協(xié)同作用，顯示出顯著增強(qiáng)的X線衰減效應(yīng)。為將納米粒子靶向到腫瘤組織，實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向性藥物遞送和生物成像，通常采用配體-受體結(jié)合系統(tǒng)或抗體-抗原結(jié)合系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向作用。葉酸（FA）是應(yīng)用較早的腫瘤靶向分子，與其在正常組織中的表達(dá)水平相比，F(xiàn)A受體在大腸癌、卵巢癌和乳腺癌等上皮惡性腫瘤中過表達(dá)[21-23]。研究表明，F(xiàn)A是FA受體的高親和配體（Kd≈10-10mol/L）[24]，F(xiàn)A修飾的載體可以通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被FA受體高表達(dá)的細(xì)胞高效攝取[25]。本研究采用沉淀聚合法制備了含碘聚合物納米粒子P(MATIB-co-MBA-co-GMA)，并將FA分子修飾到該納米粒子表面，然后在該納米粒子內(nèi)部和表面沉積金納米粒子（AuNP），最終得到P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子，作為腫瘤靶向性X線CT造影劑，同時(shí)以該納米粒子為載體，以抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素（DOX）為藥物模型，研究了該納米粒子作為抗腫瘤藥物輸送載體的性能，以期獲得能同時(shí)實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向性成像和藥物遞送的納米粒子系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)腫瘤的診治一體化。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器

1.1.1試劑N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA）購(gòu)自天津中信凱泰化工有限公司，純度為98%，使用前用丙酮重結(jié)晶；甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）、乙二胺（EDA）、偶氮二異丁腈（AIBN）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）均購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司；氯金酸（HAuCl4）購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）購(gòu)自西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；DOX購(gòu)自上海浩然生物技術(shù)有限公司。

1.1.2儀器核磁共振波譜儀（Bruker,400MHZ Advance）；透射式電子顯微鏡（Hitachi，HT7700）（TEM）；傅立葉變換紅外光譜儀（Bruker，Tensor 27）（FT-IR）；紫外-可見吸收光譜儀（JASCO，V-570）（UV-vis）；激光粒度儀（Malvern，Zetasizer Nano-ZS）；CT 掃描儀（PHILIP MX-16 SLICE）；Countstar自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司，IC 1000）；CO2培養(yǎng)箱（Forma Scientific）；酶標(biāo)儀（Promega，GloMax-Multi）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1單體化合物2-甲基丙烯酰（3-酰胺-2，4，6-三碘苯甲酸）(MATIB)的合成在50 mL的雙頸圓底燒瓶中加入16 mL用分子篩干燥的N,N-二甲基乙酰胺（DMA）溶液，然后加入3-氨基-2,4,6-三碘苯甲酸（4.0 g），超聲使其完全溶解。圓底燒瓶上面依次連接冷凝管、標(biāo)口玻璃彎形干燥管，冷凝管通水，將圓底燒瓶置于油浴中加熱，使反應(yīng)體系維持在25℃之下，使用5 mL的注射器將甲基丙烯酰氯（2.5 mL）緩慢逐滴滴加到溶解有3-氨基-2,4,6-三碘苯甲酸的DMA的溶液中，滴加完成之后，將該反應(yīng)體系溫度升高到50℃，并使該反應(yīng)體系維持50℃繼續(xù)反應(yīng)12 h，反應(yīng)結(jié)束后，將上述反應(yīng)液在25℃下緩慢滴入80 mL水中，持續(xù)攪拌反應(yīng)5 h后，將所得沉淀依次用超純水、乙腈洗滌3遍。所得產(chǎn)物放于50℃的真空干燥箱中干燥。使用無(wú)水乙醇對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行重結(jié)晶，然后置于50℃的真空干燥箱中干燥。

1.2.2含碘聚合物納米粒子P（MATIB-co-MBA-co-GMA）的制備在250 mL的圓底燒瓶中，稱取單體MATIB（900 mg），加入144 mL乙腈，14.4 mL乙醇，超聲使其完全溶解，然后加入交聯(lián)劑MBA（150 mg）和引發(fā)劑 AIBN（22 mg），使其溶解。將圓底燒瓶置于85℃油浴中加熱，使反應(yīng)體系在30 min內(nèi)沸騰并回流。反應(yīng)65 min時(shí)加入GMA（110 mg），反應(yīng)80 min時(shí)終止反應(yīng)。反應(yīng)體系快速降溫后，產(chǎn)物離心（12 000 r/min，20 min）獲得，用乙腈洗 3次，在真空干燥箱中干燥至恒重，得到P(MATIB-co-MBA-co-GMA)含碘納米粒子。

1.2.3FA修飾的含碘聚合物納米粒子P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA的制備向無(wú)水甲醇（6 mL）中加入P（MATIB-co-MBA-co-GMA）納米粒子40 mg，超聲使其分散，加入 EDA（3 mL），25 ℃下攪拌 2 d，離心得到 P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-EDA 納米粒子，用無(wú)水甲醇洗3次，在真空干燥箱中干燥至恒重。

將 FA（40 mg）超聲溶于 DMSO（4 mL），與 EDC（35 mg）和 NHS（21 mg）混合，37 ℃下攪拌 60 min，將前一步得到的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-EDA納米粒子（40 mg）加入該黃色透明液體中，繼續(xù)避光攪拌 4 d，離心得到 P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA納米粒子，用DMSO和水洗至紫外-可見吸收光譜儀檢測(cè)不到上清液中的FA分子。

1.2.4AuNP在含碘聚合物納米粒子P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA上的沉積取P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA納米粒子15 mg，溶于10 mL去離子水中，另取 HAuCl4·2H2O（15 mg）溶于 5 mL 去離子水中，加入該納米粒子水溶液中，避光下磁力攪拌 24 h，然后將反應(yīng)液離心（12 000 r/min，20 min），沉淀產(chǎn)物用去離子水洗3遍，將其重新分散于20 mL去離子水中，之后在快速攪拌下，迅速加入含有3.5 mL NaBH4（200 mmol/L）的NaOH（100 mmol/L）溶液，當(dāng)NaBH4加入后，溶液體系由淺黃立即變?yōu)樯罴t色，繼續(xù)磁力攪拌120 min，產(chǎn)物離心并用去離子水洗3遍，即得到P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FAAuNP納米粒子。

1.2.5P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP 納米粒子的表征分別取各步所得的納米粒子分散液，滴在碳膜銅網(wǎng)上，待自然晾干后于TEM下觀測(cè)并攝片記錄。分別用Nano measurer軟件測(cè)量TEM圖片中納米粒子（＞100個(gè)）的直徑，采用激光粒度儀統(tǒng)計(jì)各納米粒子在溶液中的Zeta電位、粒徑和粒徑分布情況。采用FT-IR光譜儀分別檢測(cè)各步所得納米粒子的紅外特征光譜圖。樣品分別與溴化鉀以1∶50的比例在研缽中研磨混勻后，壓溴化鉀窗片，用傅里葉-紅外光譜儀掃描樣品，得出樣品的紅外吸收光譜圖。采用UV-vis吸收光譜儀分別檢測(cè)各步所得納米粒子的UV-vis吸收光譜圖。

1.2.6P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP 納米粒子的CT造影性能對(duì)P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子溶液的體外CT造影性能進(jìn)行測(cè)定，即測(cè)定該納米粒子溶液的體外CT值。首先采用電感耦合等離子體質(zhì)譜分別測(cè)定P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP和 P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA納米粒子中的碘含量和金含量，然后將其分別配制成一系列不同碘濃度的水溶液，用飛利浦MX-16SLICE型CT成像儀進(jìn)行CT成像斷層掃描，分別讀取各溶液中3處不同位置處的CT值，同時(shí)對(duì)比醫(yī)用碘海醇溶液的CT值。CT成像斷層掃描的各種參數(shù)為：層厚1.5 mm；間距0.75 mm；電壓90 kV；電流34 mAs。以讀出的各CT值為縱坐標(biāo)，各溶液的碘濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行作圖，CT值均為3次讀數(shù)的平均值。

1.2.7P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP 納米粒子的載藥和釋藥性能將一系列不同初始濃度的DOX溶液分別與相同量的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP（0.5 mg/mL）溶液混合均勻，置于搖床上，室溫條件下避光溫和地振搖24 h，離心得到負(fù)載DOX的納米粒子，并通過UV-vis吸收光譜儀測(cè)定上清溶液在480 nm處的吸收，計(jì)算得到上清溶液中DOX的濃度。初始溶液中DOX的總量與負(fù)載后上清溶液中的DOX的量之差即為負(fù)載在該聚合物納米粒子上的藥量。納米粒子的載藥量和包封率按照公式（1）和（2）計(jì)算得到：

其中Wadministereddose指初始溶液中DOX的質(zhì)量，Wresidualdoseinsolution指負(fù)載后上清溶液中DOX的殘余量，Wnanoparticles指用于載藥的納米粒子的質(zhì)量。

根據(jù)載藥性能檢測(cè)結(jié)果，制備載藥（DOX溶液初始濃度為 414 μg/mL）P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子（1.0 mg/mL），測(cè)定負(fù)載DOX后的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子分別在不同pH值的PBS緩沖溶液（50 mmol/L，pH 6.0或7.4）中37℃下的體外釋藥性能。即將載藥納米粒子分散于8 mL水中，分為2等份，分別置于截留分子量為3 500的透析袋中，再將透析袋分別置于不同pH條件下的60 mL緩沖溶液中，緩慢攪拌進(jìn)行釋藥，每個(gè)條件平行做3組。在每個(gè)設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)從釋藥容器內(nèi)取出1.5 mL溶液，測(cè)定其在480 nm處的紫外吸收，計(jì)算得到其中DOX的濃度。為保持藥物釋放體系的體積不變，每次取樣后向容器內(nèi)補(bǔ)加相同條件的等量新鮮的緩沖鹽溶液。以停止釋藥實(shí)驗(yàn)時(shí)穿過透析膜釋放的藥物分子總量表示累積釋放藥量。

1.2.8P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP 納米粒子的細(xì)胞吸收性能采用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察負(fù)載DOX的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子的入胞能力，以負(fù)載DOX的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-AuNP納米粒子作為對(duì)照.分別將終濃度為1 μg/mL的負(fù)載DOX的 P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子和P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-AuNP納米粒子與人乳腺癌MCF-7細(xì)胞孵育0.5 h后，通過共聚焦熒光顯微鏡觀察。進(jìn)一步采用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)該納米粒子的腫瘤細(xì)胞靶向性。

1.2.9P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP 納米粒子的細(xì)胞毒性將負(fù)載DOX的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子和 P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-AuNP納米粒子按照不同DOX濃度配制一系列載藥納米粒子溶液，以游離DOX溶液做對(duì)照。

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7培養(yǎng)于含10%胎牛血清FBS和1%青/鏈霉素的細(xì)胞DMEM培養(yǎng)液中，在5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將MCF-7細(xì)胞按約每孔5 000個(gè)細(xì)胞的濃度接種于96孔板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后，將一系列不同濃度的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子溶液加入其中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的吸光值，按公式（3）計(jì)算上述細(xì)胞的相對(duì)存活率。對(duì)于載藥納米粒子，按 0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5 μg/mL的DOX濃度分別加入載藥納米粒子溶液和游離DOX溶液到MCF-7細(xì)胞中，并按照上述方法測(cè)定其細(xì)胞存活率。

其中，W為相對(duì)細(xì)胞存活率，A為實(shí)驗(yàn)孔吸光值，A0為空白孔吸光值，A1為對(duì)照孔吸光值。

2　結(jié)果

2.1單體化合物MATIB的表征產(chǎn)物MATIB的化學(xué)結(jié)構(gòu)采用核磁共振波譜氫譜進(jìn)行表征，如圖1所示，在其氫譜圖中1.95 ppm處出現(xiàn)-CH3的質(zhì)子峰，5.92 ppm和5.56 ppm處出現(xiàn) =CH2的質(zhì)子峰，8.35 ppm處出現(xiàn)Ar-H處的質(zhì)子峰，9.93 ppm為Ar-COOH中的質(zhì)子峰，13.95 ppm為-NH-中的質(zhì)子峰。因而從該核磁譜圖可以確定MATIB的結(jié)構(gòu)。

圖1MATIB在DMSO-d6中的1H NMR譜圖Fig 11H NMR(400 MHz)spectrum of MATIB in DMSO-d6

2.2納米粒子的結(jié)構(gòu)與形貌表征P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子的制備方法如圖2所示，先將3-氨基-2，4，6-三碘苯甲酸進(jìn)行甲基丙烯?；?，得到可用于聚合的單體化合物MATIB。再將其與MBA和GMA通過沉淀聚合方法進(jìn)行共聚反應(yīng)，得到具有交聯(lián)結(jié)構(gòu)和表面有環(huán)氧基團(tuán)修飾的含碘聚合物納米粒子P（MATIB-co-MBA-co-GMA）。然后通過EDA在納米粒子表面引入氨基，并進(jìn)一步通過EDC縮合反應(yīng)將FA分子修飾在納米粒子表面，得到P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA納米粒子。最后，通過還原法在納米粒子上原位沉積AuNP，得到P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子。

圖2P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP納米粒子的制備示意圖Fig 2 Schematic illustration for preparation of P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles

2.2.1TEM表征由圖3可知，所制備的納米粒子均為表面光滑、大小均一的球形，并具有較好的分散性。P(MATIB-co-MBA-co-GMA)納米粒子平均粒徑為102 nm，當(dāng)表面修飾了FA分子并沉積了AuNP后，所得的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子平均粒徑為135 nm，并且在其上可觀察到均勻分布的粒徑小于5 nm的AuNP。

2.2.2FT-IR光譜和UV-vis吸收光譜 P（MATIB-co-MBA-co-GMA）納米粒子和P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子的FTIR光譜和UV-vis吸收光譜在P（MATIB-co-MBA-co-GMA）納米粒子的FT-IR光譜中可以看到1 657 cm-1和1 517 cm-1處分別出現(xiàn)了屬于酰胺基團(tuán)中的C=O伸縮振動(dòng)峰和N-H的彎曲振動(dòng)峰，即酰胺I帶和酰胺II帶，在1 731 cm-1處出現(xiàn)了屬于羧基的C=O伸縮振動(dòng)峰。當(dāng)與FA分子連接并沉積了AuNP后，所得的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子中原先屬于羧基的C=O伸縮振動(dòng)峰消失，并且屬于酰胺基團(tuán)的酰胺I帶和II帶譜峰的位置均發(fā)生了位移，說明FA分子通過酰胺鍵成功修飾到納米粒子表面。在P（MATIB-co-MBA-co-GMA）納米粒子的UV-vis吸收光譜中可以看到，在250 nm處出現(xiàn)了屬于納米粒子中苯環(huán)共軛體系的特征吸收峰，在修飾FA分子后，在304 nm處出現(xiàn)了FA分子相對(duì)應(yīng)的吸收峰，相比游離FA分子在280 nm處的吸收峰紅移了24 nm。在P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子的UV-vis吸收光譜中位于500nm左右的屬于AuNP的吸收峰極其微弱，可能由于相比苯環(huán)的特征吸收峰較弱所致。而屬于納米粒子中苯環(huán)共軛體系的特征吸收峰出現(xiàn)在226 nm處，發(fā)生了24 nm的藍(lán)移，可能AuNP的沉積導(dǎo)致其與苯環(huán)共軛體系發(fā)生了一定程度的電子轉(zhuǎn)移（圖4）。

圖3P(MATIB-co-MBA-co-GMA)(A)和P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP(B)納米粒子的TEM圖片F(xiàn)ig 3 TEM images of P(MATIB-co-MBA-co-GMA)(A)and P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP(B)nanoparticles

圖4A.P(MATIB-co-MBA-co-GMA)納米粒子、P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP納米粒子和FA的FTIR光譜；B.P(MATIB-co-MBA-co-GMA)納米粒子、P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA納米粒子、P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP納米粒子和FA的UV-vis吸收光譜Fig 4 FTIR spectra of P(MATIB-co-MBA-co-GMA)nanoparticles,P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles and FA(A)and UV-vis absorbance spectra of P(MATIB-co-MBA-co-GMA)nanoparticles,P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA nanoparticles,P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles and FA(B)

2.2.3粒徑分析與Zeta電位如表1所示，各步所得納米粒子用激光粒度分析儀測(cè)定的水力直徑（Dh）均小于200 nm，且比TEM照片中所得相應(yīng)納米粒子的平均粒徑（Dn）偏大，這是由于各納米粒子在水溶液中均有一定程度的溶脹所致。同時(shí)，各步所得納米粒子在水溶液中均具有較窄的粒徑分布，PDI值由0.002到0.077之間不等，說明所制備的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子粒徑非常均勻，且在水溶液中具有很好的分散性。從Zeta電位的表征結(jié)果可以看出，P（MATIB-co-MBA-co-GMA）納米粒子的 Zeta電位為（-51.3±2.1）mV，這是由于其表面連有大量羧基和環(huán)氧基所致。當(dāng)與EDA連接后，表面大部分變成了氨基，因而Zeta電位變?yōu)椋?16.2±0.4）mV，明顯正向移動(dòng)，說明EDA被成功接上。當(dāng)修飾了FA分子后，其又變?yōu)椋?49.3±1.4）mV，這是由于FA分子有兩個(gè)羧基，通常以γ羧基與載體材料相連，而保留游離α羧基，所以Zeta電位又負(fù)向移動(dòng)。

2.3納米粒子的性能表征

2.3.1體外X線衰減性能通過ICP-MS檢測(cè)得到P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA納米粒子中的I含量約為 47.9%，P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子中的I含量約為31.9%，Au含量為12.6%（表1）。以不同的I濃度配制一系列兩種納米粒子的溶液，然后進(jìn)行CT成像，讀取相應(yīng)的CT值，得到這兩種納米粒子溶液隨碘濃度變化的體外X-射線衰減關(guān)系圖（圖5）?？梢钥闯觯SI濃度增大，X-線的衰減能力逐漸增強(qiáng)，沉積了AuNP的納米粒子其CT值明顯高于相同I含量下的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA納米粒子溶液的CT值，說明AuNP的摻入顯著增強(qiáng)了其CT造影性能。

表1　各步所得納米粒子的粒徑、粒徑分布、Zeta電位、I和Au的含量Tab 1　The size,size distribution,Zeta-potentials and content of I and Au in nanoparticles from every step

圖5P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA納米粒子和P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP納米粒子的I含量與X線衰減關(guān)系Fig 5 Relationship of X-ray attenuation with I concentration in P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA nanoparticles and P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNPnanoparticles invitro

2.3.2載藥釋藥性能如圖6A所示，在一定范圍內(nèi)，P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP 納米粒子的載藥量隨著DOX溶液初始濃度的增加而不斷增大，而包封率則隨著DOX溶液初始濃度的增加而不斷減小。當(dāng)DOX溶液的初始濃度為1 500 μg/mL時(shí)，其載藥量為51.3%，包封率為34.2%。此時(shí)納米粒子的載藥量達(dá)到飽和，不再隨初始DOX的量的增加而增大。

DOX在不同pH下的釋放曲線如圖6B所示，6 h內(nèi)釋藥速率較快，之后DOX的釋放速率變得緩慢，48 h后，在pH6.0的PBS溶液中DOX釋放率約為25%，明顯高于在pH 7.4的緩沖溶液中的釋放速率，說明DOX在該納米粒子中的釋放具有一定的pH響應(yīng)性。

2.3.3細(xì)胞吸收及體外靶向性能如圖7所示，分別將終濃度為1 μg/mL的負(fù)載DOX的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子和 P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP納米粒子與人乳腺癌MCF-7細(xì)胞孵育0.5 h后，從共聚焦熒光顯微鏡的觀察可以看出，在負(fù)載DOX的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子處理的細(xì)胞中可以看到明顯的紅色DOX熒光，說明P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子可以攜載DOX很好地進(jìn)入細(xì)胞，而P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-AuNP納米粒子攜載DOX的入胞能力明顯較差。流式細(xì)胞儀的進(jìn)一步檢測(cè)也得到了相同的結(jié)果（圖7h），說明經(jīng)FA修飾的納米粒子對(duì)腫瘤細(xì)胞具有一定的主動(dòng)靶向性，其能夠通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被FA受體高表達(dá)的MCF-7細(xì)胞更高效地結(jié)合和攝取。

圖6A.P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP納米粒子在不同初始濃度DOX溶液時(shí)的載藥量和包封率；B.不同pH值時(shí)DOX從P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP納米粒子中的釋放Fig 6 The drug loading capacity and encapsulation efficiency of P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles with different initial DOXconcentrations(A)andtheDOXreleasefromP(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNPnanoparticlesunderdifferentpHvalues(B)

圖7MCF-7細(xì)胞分別與P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP納米粒子和負(fù)載DOX的P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP納米粒子在37℃孵育0.5 h后的共聚焦熒光顯微鏡照片（a-f）和相關(guān)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果（h）Fig 7 Confocal fluorescence microscope photos(a-f)and the flow cytometry results(h)of untreated MCF-7 cells,P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles and DOX-loaded P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP nanoparticles incubated with MCF-7 cells at 37℃for 0.5 h

2.3.4細(xì)胞毒性本研究采用MTT實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估 P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP 納米粒子的細(xì)胞毒性及其載藥納米粒子對(duì)腫瘤細(xì)胞MCF-7的殺傷作用，如圖8所示?？梢钥闯?，當(dāng)P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子濃度低于100 μg/mL時(shí)細(xì)胞生存活性在80%以上，未顯示出明顯毒性。在載藥納米粒子中，隨DOX濃度增加，負(fù)載DOX的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子和P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-AuNP納米粒子分別處理的MCF-7細(xì)胞活性均顯示得到很好的抑制，二者的IC50分別為0.33 μg/mL和0.65 μg/mL。結(jié)果表明，有FA修飾的載藥納米粒子顯示出對(duì)腫瘤細(xì)胞更好的殺傷性能。但相比游離DOX的IC50（0.11 μg/mL），二者對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力相對(duì)較低，這主要是因?yàn)镈OX在納米粒子中的釋放較慢，在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)未達(dá)到完全釋放。負(fù)載DOX的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子在5 μg/mL的DOX濃度下可殺死約94%的MCF-7細(xì)胞，此時(shí)納米粒子的濃度約為10μg/mL，納米粒子本身遠(yuǎn)不至于產(chǎn)生細(xì)胞毒性。這些結(jié)果表明，負(fù)載DOX的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子易被MCF-7細(xì)胞高效攝取，并在細(xì)胞內(nèi)釋放出DOX發(fā)揮殺傷作用，從而減少對(duì)正常組織細(xì)胞的傷害。

圖8A.P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP納米粒子對(duì)MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞毒性；B.負(fù)載DOX的P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP納米粒子、P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP納米粒子和游離DOX對(duì)MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞毒性Fig 8 Relative cellular viability of MCF-7 cells after treatment with P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles(A),DOX loaded P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP nanoparticles,DOX loaded P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-AuNP nanoparticles and free DOX(B)

3　討論

本研究首先制備了含碘單體化合物MATIB，從核磁譜圖確定了其結(jié)構(gòu)。然后采用沉淀聚合法制備了FA修飾并沉積了AuNP的含碘聚合物P(MATIB-co-MBA-co-GMA)-FA-AuNP納米粒子。通過TEM、FT-IR光譜、UV-vis吸收光譜及各步所得納米粒子的粒徑、粒徑分布、Zeta電位、I和Au的含量確定了P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FAAuNP納米粒子的結(jié)構(gòu)和表面形貌。通過納米粒子溶液隨碘濃度變化的體外X-射線衰減關(guān)系圖可以看出 P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP 納米粒子具有較好的X線衰減效應(yīng)，并優(yōu)于沒有AuNP摻雜的納米粒子，說明AuNP的摻入顯著增強(qiáng)了其CT造影性能。載藥和釋藥結(jié)果表明，該納米粒子對(duì)DOX的負(fù)載量可達(dá)到51.3%，并具有pH響應(yīng)的藥物釋放性能。通過共聚焦熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀的觀察，可以得知該納米粒子對(duì)MCF-7腫瘤細(xì)胞具有一定的主動(dòng)靶向性，其能夠通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被FA受體高表達(dá)的MCF-7細(xì)胞更高效地結(jié)合和攝取。細(xì)胞毒性表征結(jié)果顯示，該納米粒子具有較低的細(xì)胞毒性，并可以高效攜載抗腫瘤藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞并殺死腫瘤細(xì)胞。

綜上結(jié)果，本研究制備的P（MATIB-co-MBA-co-GMA）-FA-AuNP納米粒子顯示了可同時(shí)作為X線CT造影劑和抗腫瘤藥物輸送載體的能力，有潛力成為腫瘤診治一體化的診療劑。

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