魁蚶C型凝集素基因cDNA的克隆及表達分析*

沈淑芳 朱 玲 李加琦,3 薛素燕,3 李 陽 陳瓊琳 毛玉澤,3 莊志猛 方建光,3

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魁蚶C型凝集素基因cDNA的克隆及表達分析*

沈淑芳1,2朱 玲2①李加琦2,3薛素燕2,3李 陽1,2陳瓊琳1,2毛玉澤2,3莊志猛2方建光2,3

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；2. 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實驗室 青島 266071)

通過cDNA末端快速擴增(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)技術(shù)克隆得到魁蚶() C型凝集素(C-type lectin，Sb-Lec1)基因，該基因全長為700 bp，其中，5′-UTR為29 bp，3′-UTR為167 bp，開放閱讀框長度為504 bp，編碼167個氨基酸，包括長度為23個氨基酸的信號肽序列、129個氨基酸的糖識別結(jié)構(gòu)域(CRD)以及參與二硫鍵形成的6個半胱氨酸。預(yù)測蛋白分子量為19.11 kDa，理論等電點為4.74。多序列比對結(jié)果顯示，Sb-Lec1基因CRD編碼的氨基酸序列與長牡蠣()、紫貽貝()和海灣扇貝() C型凝集素的同源性分別為38%~40%、34%~35%和38%~39%，Sb-Lec1基因編碼的氨基酸序列與其他物種的凝集素基因具有相似的結(jié)構(gòu)，均含有形成二硫鍵的4個保守半胱氨酸。系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示，魁蚶先與貝類聚為一支，再與脊椎動物聚在一起，表明魁蚶Sb-Lec1基因在進化樹上的位置與其傳統(tǒng)分類所處位置一致。采用熒光定量PCR技術(shù)，檢測了Sb-Lec1基因在組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)其在肝胰腺、血淋巴、鰓、外套膜、閉殼肌、斧足中均有表達，其中，肝胰腺表達量最高。同時，分析了Sb-Lec1基因在鰻弧菌()刺激下的mRNA表達量變化情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，菌刺激組Sb-Lec1基因mRNA在各檢測組織中的表達量均顯著上調(diào)(<0.05)，隨著刺激時間的延長，表達量呈先升高后降低的趨勢。本研究表明，魁蚶Sb-Lec1基因在機體免疫防御方面發(fā)揮重要功能。

C型凝集素；魁蚶；鰻弧菌；基因克??；基因表達

C型凝集素(C-type lectin)是最早發(fā)現(xiàn)的動物凝集素，種類繁多，幾乎存在于所有的多細(xì)胞生物中(Robinson,2006)。作為固有免疫中一類重要的模式識別受體(PRR)，能夠?qū)Ｒ恍缘刈R別病原相關(guān)分子模式(PAMP)，與糖類可逆結(jié)合，在病原菌入侵過程中參與“非己”識別，并能激活一系列免疫防御反應(yīng)，從而吸附和凝集異物，促進機體清除和殺滅異物(Tamplin,1989; 張峘, 2010)。C型凝集素具有鈣離子依賴性，它們均含有約130個氨基酸殘基構(gòu)成的糖識別結(jié)構(gòu)域(Carbohydrate-recognition domain，CRD) (Drickamer,1993)。每個CRD在空間上形成雙環(huán)狀結(jié)構(gòu)，4個高度保守的Cys形成的2對二硫鍵保持了該結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，含有4個Ca2+結(jié)合位點，其中Ca2+結(jié)合位點2與糖基特異性結(jié)合有關(guān)(Zelensky2005)。大多數(shù)C型凝集素可以與D型甘露糖(D- mannose)、D型葡萄糖(D-glucose)這一類的Man型配體(Man-type ligands)或D型半乳糖(D-galactose)及其衍生物(Gal型配體，Gal-type ligands)結(jié)合(Kolatkar,1996)，在免疫識別方面發(fā)揮重要作用。

C型凝集素作為凝集素家族中研究最多的一類，越來越受到廣泛的關(guān)注。近幾年，軟體動物C型凝集素的研究越來越普遍，對于其在免疫方面的功能研究越來越深入。目前，已在皺紋盤鮑() (王圣, 2015)、合浦珠母貝()(胡鈺婷等, 2011)、海灣扇貝()(Zhu,2008)、櫛孔扇貝()(Wang,2007)等軟體動物中發(fā)現(xiàn)并克隆獲得C型凝集素的全長序列。

魁蚶()是一種大型海洋底棲經(jīng)濟貝類，具有較好的市場前景和開發(fā)利用價值，在太平洋西北部淺海區(qū)域廣泛分布(唐啟升等, 1994)。作為亞洲一種重要的經(jīng)濟貝類(Mao,2013)，近幾年由于過度捕撈、環(huán)境污染、海洋生態(tài)系統(tǒng)惡化、不健康養(yǎng)殖導(dǎo)致病害發(fā)生，致使魁蚶資源減退(劉寒苗等, 2017)。魁蚶作為一種軟體動物，固有免疫是其抵御外界病原侵害的主要方式。迄今為止，國內(nèi)外對于魁蚶自身免疫系統(tǒng)組成、特點和功能的研究逐漸深入，有關(guān)魁蚶免疫相關(guān)基因的報道越來越多，如殺菌滲透性增強蛋白(BPI)和脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)(Mao,2013)、過氧化氫基因(CAT)(黃永歡等, 2016)、半乳糖凝集素(SbGal)(鄭利兵等, 2015)、大防御素(SbBDef1)(Li, 2012)、錳超氧化物歧化酶(SbMnSOD)(Zheng, 2015)、鐵蛋白(SbFer)(Zheng, 2016)等基因，另外，血細(xì)胞作為魁蚶的重要免疫部位，對其分類和免疫作用也有研究(周麗青等, 2013)。然而，對魁蚶凝集素的研究幾乎空白，因此，深入開展魁蚶凝集素相關(guān)的研究，可以豐富魁蚶免疫系統(tǒng)，為進一步研究魁蚶的免疫防御機制提供材料。

本研究在魁蚶轉(zhuǎn)錄組文庫的基礎(chǔ)上，篩選得到魁蚶C型凝集素Sb-Lec1基因，運用RACE技術(shù)擴增得到cDNA全長，同時，運用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測該基因在魁蚶中的組織表達情況及其在鰻弧菌()刺激后的表達響應(yīng)情況，探究該基因在魁蚶免疫應(yīng)答方面的作用，從而為魁蚶病害防治以及育種提供資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用魁蚶購自山東省萊州市長漁水產(chǎn)有限公司。殼長約為60 mm，于25℃實驗室充氣暫養(yǎng)，暫養(yǎng)約1周后開始實驗，期間投喂螺旋藻，實驗處理前2 d停止投喂。鰻弧菌為本實驗室保存的菌種。

1.2 魁蚶C型凝集素全長的克隆

1.2.1 總RNA的提取 Trizol(TaKaRa，日本)法提取總RNA：解剖組織，用研磨棒充分研磨后，12000 r/min離心5 min后，取上清液，加入200 μl氯仿，劇烈震蕩3 min，靜置后，離心15 min。取上清液400 μl，加入相同體積的異丙醇，上下顛倒混勻，–20℃沉降核酸。75%乙醇洗滌核酸，干燥后，DEPC水溶解核酸，用DNase(Progema，美國)去除基因組DNA。1.0%瓊脂糖檢測RNA完整性，核酸分析儀(Eppendorf)檢測其純度和濃度。

1.2.2 基因全長的克隆與測序 根據(jù)獲得的魁蚶C型凝集素的部分序列，設(shè)計特異性引物用于擴增Sb-Lec1基因的全長。利用載體上的通用引物T7與特異性引物Sb-Lec1-F1擴增Sb-Lec1基因的3￠末端，用pBluescript SK(+/-)載體上的通用引物T3與特異性引物Sb-Lec1-R1擴增Sb-Lec1基因的5￠末端(表1)。具體步驟：擴增體系為25 μl，內(nèi)含cDNA模板1.0 μl，10×PCR Buffer 2.5 μl，1.5 μl of MgCl2(25 mmol/L)，dNTPs Mixture(2.5 mmol/L) 2.0 μl，正向引物、反向引物各1.0 μl (10 μmol/L)，酶(1U) 0.2 μl，ddH2O 15.8 μl；3￠RACE反應(yīng)程序： 94℃ 30 s，57.5℃ 30 s，72℃ 30 s，33個循環(huán)，5′RACE反應(yīng)程序為94℃ 35 s，57℃ 35 s，72℃ 35 s，32個循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物后，將目的條帶切膠回收、純化。純化獲得的片段與pMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞TOP10中。獲得的陽性克隆子經(jīng)菌液PCR鑒定后，由青島海大藍科公司測序。

1.2.3 基因序列分析、同源比對及進化分析 將篩選拼接得到的魁蚶凝集素基因全長序列，利用NCBI的ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig. cgi)程序進行開放閱讀框分析，預(yù)測編碼氨基酸序列；利用ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)對C型凝集素分子量(Mw)及理論等電點pI進行預(yù)測；SignalIP 4.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/)查找C型凝集素信號肽；SMART (http://www. expasy.ch/SMART)進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析；ExPASy PROSITE(http://prosite.expasy.org/)查找形成二硫鍵的半胱氨酸。用NCBI的Blastp(http: //blast.ncbi.nlm. nih.gov/)對序列進行同源檢索，選取不同物種的C型凝集素氨基酸序列，用DNAman8.0軟件與魁蚶Sb-Lec1氨基酸序列進行同源性比對分析，在此基礎(chǔ)上用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 引物序列

Tab.1 Primers used in this study

1.3 魁蚶C型凝集素基因?qū)牷【碳さ捻憫?yīng)

1.3.1 鰻弧菌刺激 將魁蚶個體隨機分為對照組和處理組，為鰻弧菌刺激實驗做準(zhǔn)備。鰻弧菌用LB液體培養(yǎng)基重懸后，擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD600 nm=0.4 (1 OD=5×108CFU/ml)(鄭利兵等, 2015)，取一定體積的菌液離心后取沉淀，用同體積的PBS懸浮沉淀備用。用微量注射器向處理組個體的前閉殼肌處注射 50 μl菌懸液，然后放回原養(yǎng)殖槽內(nèi)。分別在注射后0、2、4、8、12、24、48、72 h，隨機選取4個個體解剖，取血(4℃，12000 r/min 離心15 min，收集血細(xì)胞沉淀)、外套膜、閉殼肌、斧足、鰓、肝胰腺，用于提取總RNA，對照組注射等量的PBS(0.1 mol/L, pH=7.4)，每個時間點取4個個體作為對照。

1.3.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 為了檢測魁蚶凝集素基因的組織分布以及其在鰻弧菌刺激下的響應(yīng)狀態(tài)，將解剖獲得的各種組織提取總RNA，根據(jù)PrimeScriptTMRT reagent kit (TaKaRa，日本)試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為進行qRT-PCR的模板。根據(jù)獲得的魁蚶C型凝集素全長，運用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計qRT-PCR引物qSb Sb-Lec1-F2、qSb Sb-Lec1-R2(表1)，β-actin作為內(nèi)參基因，運用ABI7500熒光定量PCR儀進行實驗，反應(yīng)參照SYBR?Premix ExTM(TaKaRa，日本)試劑盒說明書進行。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μl：SYBR?Premix ExTMⅡ(2×)，10 μl；PCR正向引物(10 μmol/L)，0.4 μl；PCR反向引物(10 μmol/L)，0.4 μl；ROX Reference DyeⅡ(50×)，0.4 μl；cDNA模板，2.0 μl；DEPC水，6.8 μl，反應(yīng)程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。實驗設(shè)置4個平行組。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 實驗數(shù)據(jù)分析 根據(jù)軟件獲得的每個反應(yīng)的T值，對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，采用2-DDCT方法(Livak,2001)進行。根據(jù)每個樣品的4個平行實驗所得的數(shù)據(jù)計算相對表達量平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2.1 Sb-Lec1基因cDNA序列分析

運用PCR和RACE技術(shù)擴增Sb-Lec1基因3￠、5￠端，經(jīng)過拼接，該基因的全長為700 bp，其中5￠-UTR為29 bp，3￠-UTR為167 bp。開放閱讀框(Open reading frame，ORF)長度為504 bp，編碼167個氨基酸，預(yù)測的分子量為19.11 kDa，理論等電點為4.74，其起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，polyA加尾信號為AATAAA(圖1)。

信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，該氨基酸序列第1~23個氨基酸為其信號肽序列，運用Smart預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，第2~155個氨基酸為魁蚶C型凝集素的糖識別結(jié)構(gòu)域(CRD)，該CRD含有的參與二硫鍵形成的6個半胱氨酸，分別位于Cys27、Cys38、Cys56、Cys129、Cys146、Cys154，其中，Cys56、Cys129、Cys146、Cys154為其保守的半胱氨酸，分別在Cys56和Cys154、Cys129和Cys146之間形成 2個二硫鍵。在CRD區(qū)域中具有決定糖結(jié)合的特異性序列為“EPN”和“WND”(圖1)。

圖1 魁蚶Sb-Lec1基因全長cDNA及推測的氨基酸序列

下劃線部分表示信號肽序列，終止密碼子用星號標(biāo)出；結(jié)構(gòu)域用波浪線標(biāo)出，陰影部分為Sb-Lec1的6個半胱氨酸，帶框的氨基酸序列為糖結(jié)合位點，polyA信號序列AATAAA用雙下劃線標(biāo)出

The putative signal peptide is underlined. The asterisk (*) indicated the stop codon. The carbohydrate-recognition domains (CRD) were wave-underlined and six conserved disulfide-bonded cysteine residues that define the CRD were indicated by shadow. The sugar binding sites were enclosed in a box. PolyA signal AATAAA was double underlined

2.2 Sb-Lec1基因cDNA同源分析

運用NCBI將拼接得到的Sb-Lec1基因CRD編碼氨基酸序列進行同源分析。結(jié)果顯示，魁蚶Sb-Lec1基因CRD編碼的氨基酸序列與其他物種具有一定的相似性，例如，與海灣扇貝(FJ469995、FJ469996)相似性分別為39%、38%，與紫貽貝()(KP125900、KP125901)相似性分別為34%、35%，與長牡蠣() (XM_011438591、XM_011452629、XM_011450108)的相似性分別為40%、41%、38%，與九孔鮑()(JN314432)的相似性為38%，與皺紋盤鮑()(EF103335)的相似性為36%，與文昌魚() (XM_ 002613005.1)的相似性為35%，與網(wǎng)紋鳉() (XM_008414919)的相似性為33%，與家蠅()(XM_011296834)的相似性為41%。

DNAMAN軟件將Sb-Lec1基因與上述物種C型凝集素基因進行序列比對(圖2)，結(jié)果顯示，Sb-Lec1基因所編碼的氨基酸序列與其他物種的凝集素基因具有相似的結(jié)構(gòu)，如都含有形成二硫鍵4個保守的半胱氨酸，糖結(jié)合位點幾乎都具有獨特的“WND”和“EPN”結(jié)構(gòu)。用Mega 6.0軟件以鄰位相接法(NJ法)構(gòu)建基因系統(tǒng)Sb-Lec1進化樹，在該系統(tǒng)進化樹中，魁蚶先與海灣扇貝、長牡蠣、九孔鮑、紫貽貝、菲律賓蛤仔等軟體動物聚為一起，再與文昌魚、網(wǎng)紋鳉、紅鰭東方鲀()、半滑舌鰨()幾種魚類聚在一起(圖3)。

2.3 Sb-Lec1基因組織分布

以β-actin作為內(nèi)參，檢測Sb-Lec1基因在不同組織中的表達(圖4)。結(jié)果顯示，Sb-Lec1基因在肝胰腺、血細(xì)胞、鰓、斧足、閉殼肌、外套膜6種組織中均有表達，且表達量存在差異。Sb-Lec1基因在肝胰腺中表達量最大，為閉殼肌的21.92倍(0.05)，其次是在血細(xì)胞中，其表達量為閉殼肌的8.40倍(0.05)。

2.4 Sb-Lec1基因在鰻弧菌感染后的表達響應(yīng)

運用qRT-PCR檢測魁蚶血細(xì)胞、肝胰腺、外套膜、閉殼肌、鰓、斧足6種組織中的Sb-Lec1基因?qū)牷【碳さ捻憫?yīng)(圖5)。結(jié)果顯示，鰻弧菌刺激后，Sb-Lec1基因在6種組織中的表達量較對照組均呈現(xiàn)出明顯上升的趨勢。以對照組Sb-Lec1基因的表達量為基準(zhǔn)，鰻弧菌刺激2 h后，肝胰腺、血細(xì)胞中的表達量明顯高于對照組，分別為對照組的4.67倍和11.53倍；而在鰓和斧足中，8 h的表達量出現(xiàn)明顯的上升趨勢，分別為對照組的4.50倍和2.83倍；在閉殼肌中，刺激2 h就開始出現(xiàn)表達量顯著升高的現(xiàn)象，在4 h時達到最高，為對照組的9.55倍；在外套膜中，刺激4 h時的表達量明顯升高且達到最大值，為對照組的19.55倍，隨后各組織表達量均出現(xiàn)回落現(xiàn)象。由此可見，經(jīng)鰻弧菌刺激后，Sb-Lec1基因在各組織中的表達量表現(xiàn)為先升高后降低的變化趨勢。

3 討論

由于無脊椎動物缺乏類似于脊椎動物的獲得性免疫系統(tǒng)，只有依靠固有免疫來防止病原的感染，以維持機體的正常生命活動。C型凝集素作為固有免疫系統(tǒng)重要的體液免疫因子，參與固有免疫的多種途徑，包括抗原的識別與清除(張峘, 2010)，在Ca2+存在下能夠特異性識別病原微生物表面的糖類物質(zhì)，引起一系列免疫反應(yīng)，從而有效地清除入侵的病原微生物(邢建曉等, 2016)，在軟體動物尤其是貝類中得到廣泛研究。本研究在以前研究的基礎(chǔ)上，將魁蚶作為對象，對其免疫相關(guān)基因研究進行補充，通過構(gòu)建魁蚶高通量測序轉(zhuǎn)錄組文庫，并利用RACE技術(shù)獲得了魁蚶Sb-Lec1基因全長cDNA；檢測了其mRNA在魁蚶中各組織的分布情況和在外源微生物刺激下表達量的變化，對探討C型凝集素在固有免疫防御中發(fā)揮的作用具有重要意義。

圖2 不同物種C型凝集素氨基酸序列比對

各物種GenBank登錄號為海灣扇貝1(FJ469995)，海灣扇貝2(FJ469996)，紫貽貝1(KP125900)，紫貽貝2(KP125901)，長牡蠣1(XM_011438591)，長牡蠣2(XM_011452629)，長牡蠣3(XM_011450108)，九孔鮑(JN314432)，皺紋盤鮑(EF103335)，文昌魚(XM_002613005)，網(wǎng)紋鳉(XM_008414919)，家蠅(XM_011296834)。黑色背景表示相同的氨基酸，灰色表示性質(zhì)相似的氨基酸，保守的半胱氨酸用三角形標(biāo)出

1(FJ469995),2(FJ469996),1(KP125900),2 (KP125901)1(XM_011438591),2(XM_011452629),3(XM_011450108),(JN314432),(EF103335)(XM_002613005)(XM_008414919),(XM_011296834). The identical amino acids were shown with black shadow and the similar amino acids were indicated by gray shadow. The cysteines constituting disulfide bonds in the structure domain acids were marked with black triangle “▲”

圖3 NJ法構(gòu)建Sb-Lec1基因系統(tǒng)進化樹

圖4 Sb-Lec1 mRNA在不同組織中的表達分布

不同字母表示組織之間Sb-Lec1基因表達量差異顯著(<0.05)。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(=4)表示，下同

Significant differences among tissues were indicated with different alphabets at<0.05.Values were shown as Mean±SD (=4), the same as below

結(jié)構(gòu)分析顯示，Sb-Lec1基因含有1個由23個氨基酸構(gòu)成的信號肽序列，說明該C型凝集素基因編碼的蛋白質(zhì)是通過經(jīng)典的分泌方式分泌到細(xì)胞外起作用。Sb-Lec1含有1個CRD，具有豐富的二硫鍵，這與許多貝類C型凝集素的結(jié)構(gòu)相似，如文蛤()Mm-Lec1和合浦珠母貝Po-Lec1序列中也包含1個CRD和6個保守的半胱氨酸(胡鈺婷等, 2011；李猛等, 2015)，而櫛孔扇貝C型凝集素基因Cflec-3和Cflec-4中分別含有3個和4個CRD，海灣扇貝AiCTL-6中含有1個CRD(張峘, 2010)。在C型凝集素中，一般含有EPN基域和WND基域與Ca2+共同作用完成對糖基分子的結(jié)合(胡鈺婷等, 2011)，Sb-Lec1含有參與糖基特異性識別的基序EPN和WND，EPN可以對甘露糖進行識別，且僅在膠原凝集素和選凝素中存在(陳政良等, 1997)。所以，Sb-Lec1有可能是一種膠凝集素或選擇凝集素，而WND基序一般只在脊椎動物中有高保守性(胡鈺婷等, 2011)。研究發(fā)現(xiàn)，文蛤Mm-Lec1中含有糖基化位點QPN，可識別半乳糖(李猛等, 2015)，而海灣扇貝AiCTL-6中含有1個EPD基序，櫛孔扇貝Cflec-5含有的基序為EPN(張峘, 2010)，這些基序與Ca2+共同作用參與對糖類的識別，在魁蚶Sb-Lec1基因中含有WND的特殊性，可能與物種的差異有關(guān)，有待進一步研究。

圖5 鰻弧菌感染后魁蚶6種組織中Sb-Lec1 mRNA的表達

A：肝胰腺；B：血細(xì)胞；C：鰓；D：閉殼?。籈：斧足；F：外套膜與對照組相比，1個星號表示組間差異顯著(<0.05)，2個星號表示組間差異極顯著(<0.01)

A: Hepatopancreas; B: Hemocytes; C: Gill; D: Adductor muscle; E: Foot; F: Mantle. Compared with the control group, significant differences were indicated with an asterisk at<0.05, and with two asterisks at<0.01

將魁蚶Sb-Lec1基因與其他種類進行同源比對分析并構(gòu)建進化樹，比對結(jié)果顯示，魁蚶Sb-Lec1基因與其他序列同源性在33%~41%之間，且都具有1個結(jié)構(gòu)域和4個保守的半胱氨酸，與長牡蠣、家蠅的相似性最高，為41%，與網(wǎng)紋鳉的相似性最低，為33%。進化樹分析結(jié)果顯示，魁蚶Sb-Lec1基因與軟體動物親緣關(guān)系較近，與魚類關(guān)系較遠(yuǎn)，與其分類地位一致。將魁蚶與其他物種的CRD所編碼的氨基酸序列進行同源性和相似性比對，發(fā)現(xiàn)它們的同源性與相似性并不是很高。在張峘(2010)的研究中，櫛孔扇貝的Cflec-3基因與其他物種的相似性為40%~56%，海灣扇貝AiCTL-6基因與其他物種的相似性為45%~54%，可見C型凝集素是一個進化較快的基因，但具有高保守性特征序列。

qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，Sb-Lec1基因在魁蚶所有組織中均有表達，這與其他貝類C型凝集素基因的研究結(jié)果基本一致。Sb-Lec1基因在肝胰腺中的表達量最高，血細(xì)胞次之，外套膜中的表達量最少，在合浦珠母貝中，Po-LEC1 mRNA在不同組織中的均有表達量，消化腺中最高，血細(xì)胞中最低(胡鈺婷等, 2011)，而文蛤Mm-Lec1 mRNA在所檢測組織中都有表達，其中，鰓中表達量最高(李猛等, 2015)；海灣扇貝中AiCTL1和AiLec基因分別在海灣扇貝的血細(xì)胞和肝胰腺中表達量最高(Zhu,2009)；櫛孔扇貝Cflec-4基因只在肝胰腺和性腺中表達，而在其他組織中檢測不到mRNA的表達。鰓是軟體動物中免疫系統(tǒng)的“第一道防線”，肝臟和血液是行使免疫功能的主要組織器官。在不同種類的貝類、不同組織中表達量不同，可能是由于不同物種C型凝集素的分布及發(fā)揮功能不同造成的。

在弧菌刺激下，不同時間、不同組織中Sb-Lec1基因表達量均出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(<0.05)，這與文蛤(李猛等, 2015)和櫛孔扇貝(胥煒等, 2005)等的表達模式相同。在櫛孔扇貝中，C型凝集素在血細(xì)胞中的表達量較低，但在鰻弧菌刺激后，6 h時表達量達到最大，隨后表達量逐漸減弱，而在文蛤中，弧菌感染6 h時，Mm-CTL基因表達量明顯上升，在12 h時達到最高值，隨后有所下降，說明C型凝集素基因的表達受微生物刺激的誘導(dǎo)。本研究表明，魁蚶Sb-Lec1基因能夠參與免疫激活反應(yīng)，并能維持機體的穩(wěn)態(tài)，參與機體的免疫和防御，為進一步研究C型凝集素的免疫功能提供了依據(jù)。

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(編輯 馬璀艷)

Molecular Cloning and Expression Analysis of C-Type Lectin from

SHEN Shufang1,2, ZHU Ling2①, LI Jiaqi2,3, XUE Suyan2,3, LI Yang1,2, CHEN Qionglin1,2, MAO Yuze2,3, ZHUANG Zhimeng2, FANG Jianguang2,3

(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2.Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 3. Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071)

The current study cloned the full-length cDNA of C-type lectin (Sb-Lec1) using RACE (Rapid amplification of cDNA ends) method fromwith 700 bp that includes a 5′ UTR of 29 bp and 3′ UTR of 167 bp. The 504 bp open reading frame (ORF) encodes a polypeptide of 167 amino acids, including a signal peptide of 23 amino acids, one carbohydrate-recognition domain (CRD) motif of 129 amino acids and 6 cysteines involved in the formation of disulfide bond. The predicted protein molecular weight is 19.11 kDa, with a theory isoelectric point of 4.74. Multiple sequences alignment and phylogeny analysis showed that the identity of Sb-Lec1 gene shared with,, andwas 38%~40%, 34%~35%, and 38%~39%, respectively. The amino acids of CRD motif had many similarities with other species such as 4 conserved Cys. Phylogenetic analysis revealed two main branches including all C-type lectin of molluscs and the C-type lectin of vertebrate, and that the deduced polypeptide of Sb-Lec1 had the characteristics of the C-type lectin family. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was used to assess the mRNA expression in all tested tissues, including hemocytes, foot, adductor muscle, mantle, gill, and hepatopancreas. The highest and lowest Sb-Lec1 mRNA were in hepatopancreas and adductor muscle, respectively.challange induced Sb-Lec1 mRNA expression in all tested tissues (<0.05). These results showed that Sb-Lec1 gene may play an important role in immune defense.

C-type lectin;;; Gene clone; Gene expression

ZHU Ling, E-mail: zhuling@ysfri.ac.cn

2016-12-21,

S968.3

A

2095-9869(2018)01-0128-09

10.11758/yykxjz.20161221001

http://www.yykxjz.cn/

朱 玲，副研究員，E-mail: zhuling@ysfri.ac.cn

* 國家自然基金委員會-山東省人民政府聯(lián)合資助海洋科學(xué)研究中心項目(U1406403)、國家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目(201205031; 201305043)和國家貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-48)共同資助[This work was supported by National Natural Science Foundation of China (NSFC)-Shandong Joint Fund for Marine Science Research Center(U1406403), National Marine Public Welfare Research Project (201205031; 201305043), and Modern Agro-Industry Technology Research System (CARS-48)]. 沈淑芳，E-mail: shenshufanga@126.com

2017-01-06

沈淑芳, 朱玲, 李加琦, 薛素燕, 李陽, 陳瓊琳, 毛玉澤, 莊志猛, 方建光. 魁蚶C型凝集素基因cDNA的克隆及表達分析. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2018, 39(1): 128–136

Shen SF, Zhu L, Li JQ, Xue SY, Li Y, Chen QL, Mao YZ, Fang JG. Molecular cloning and expression analysis of C-type lectin from. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(1): 128–136