以松材線蟲為靶標生物防治技術(shù)研究

徐紅梅 趙青 殷濤

摘 要： 松材線蟲病是林業(yè)上一種毀滅性病害，在中國仍呈蔓延趨勢。松材線蟲病生物防治研究的目標可以是媒介昆蟲（松墨天牛），也可以是松材線蟲。本文綜述了以松材線蟲為靶標的生物防治技術(shù)研究進展。

關(guān)鍵詞： 松材線蟲病；松材線蟲；生物防治

中圖分類號：S763.16 文獻標識碼：A 文章編號：1004-3020（2018）01-0051-05

Advances in Biological Control Targeting on Bursaphelenchus xylophilus

Xu Hongmei（1） Zhao Qing（2） Yin Tao（2）

（1.Hubei Academy of Forestry Wuhan 430075；2.Hubei Forest Pest Control and Quarantine Station Wuhan 430079）

Abstract： As a destructive disease ， pine wilt disease remained propagating trend in China.Biological control could target on insect vector（Monschamus alternatus） or pathogenic nematodes （B.xylophilus）.Advances in biological control targeting on B.xylophilus was reviewed in this paper.

Key words： Pine wilt disease；B.xylophilus；biological control

松材線蟲病是林業(yè)上一種毀滅性病害，屬國際重要檢疫對象，主要分布于美國、加拿大、墨西哥、日本、中國、韓國、朝鮮、法國、尼日利亞和葡萄牙等多個國家。目前，中國松材線蟲病仍呈發(fā)展蔓延趨勢，直接經(jīng)濟損失數(shù)億元[1]。

國內(nèi)外一直重視松材線蟲病防治技術(shù)研究，并提出了許多有效的防治措施，主要有營林技術(shù)、物理防治、化學(xué)防治幾大類?？傮w說來，松材線蟲病的防治仍然面臨著諸多困難。例如，防治成本高，部分地區(qū)松材線蟲防治經(jīng)費甚至高于松樹經(jīng)濟價值；大量使用化學(xué)藥劑易產(chǎn)生3“R”問題，即殘留（residue）、抗性（resisitance）、再猖獗（resurgence），尤其是殺線藥劑毒性很強，隱患多。近年來，人們注重利用具有殺線活性的動物、植物、微生物對松材線蟲病開展生物防治研究。

松材線蟲由媒介昆蟲—松墨天牛從患病木中攜帶而出，松墨天牛補充營養(yǎng)或產(chǎn)卵時侵染到健康樹中。松材線蟲（病原線蟲）、松墨天牛（傳播媒介）和松樹（寄主）三者之間的生物學(xué)聯(lián)系構(gòu)成了松材線蟲病的侵染循環(huán)。松材線蟲病生物防治的目標可以是傳播媒介松墨天牛，也可以是松材線蟲（或其攜帶的致病細菌）。目前有關(guān)松墨天牛的生物防治研究和利用報道較多，直接以松材線蟲或其攜帶的致病細菌為靶標的生物防治研究相對薄弱。

1 松材線蟲生防真菌

對于松材線蟲具有生防潛力真菌可分為捕食真菌、內(nèi)寄生真菌和產(chǎn)毒真菌幾大類。

1.1 捕食松材線蟲真菌

捕食線蟲真菌是自然界中廣為分布的線蟲天敵，能產(chǎn)生捕食器官捕食線蟲。捕食性真菌捕捉線蟲的方式一是收縮環(huán)捕捉器套住松材線蟲，從而殺死線蟲并在蟲體內(nèi)繁殖；另一方式是三維菌網(wǎng)粘纏線蟲，從而致死線蟲，吸收其營養(yǎng)并在其體內(nèi)繁殖。

Saiki等從松樹汁液中分離到一種捕食性真菌-節(jié)叢孢屬真菌（Arthrobotrys sp.），對松材線蟲病具有防治效果[2]。莫明和等研究表明，指狀節(jié)叢孢（A.dactyloide）的3個菌株對松材線蟲和擬松材線蟲均表現(xiàn)出較高的捕食率，接種7 d后對松材線蟲和擬松材線蟲的捕食率分別達到了98.08%，91.16%，86.30%和96.28%，90.45%，85.38%[3]。鄢小寧等從海南橡膠根圍土壤分離到了一株少孢節(jié)叢孢（A.oligospora）真菌，該菌對松材線蟲捕食作用較強，在CMA培養(yǎng)基上捕食率最高[4]。Wang等對2個Drechslerella dactyloides菌株研究表明，2個菌株對松材線蟲均具有很高的捕食能力，其中一個菌株接種24 h后捕捉力可達100%[5]。

1.2 內(nèi)寄生真菌

Esteya vermicola是首例報道的松材線蟲內(nèi)寄生真菌，其新月形孢子能黏附在線蟲蟲體上誘導(dǎo)其感染。Wang等從森林土壤中感病的線蟲體內(nèi)分離出多個E.vermicola新菌株，生測表明其中一個菌株在4～5 d內(nèi)就能感染致死幾乎全部供試松材線蟲，溫室試驗和2年林間試驗表明接種的真菌能在松樹內(nèi)生長并感染松材線蟲，證明該菌具有較大生防潛力[6]。

除此之外，Harposporium sp.是目前已發(fā)現(xiàn)的另一種松材線蟲內(nèi)寄生真菌，其孢子能附著在松材線蟲體表，孢子萌發(fā)時侵入蟲體內(nèi)繁殖并殺死線蟲[7]。

1.3 產(chǎn)毒真菌

自從上世紀60年代Olthof提出真菌次生代謝產(chǎn)物毒殺線蟲理論以來，從產(chǎn)毒真菌中篩選殺線活性物已成為研究熱點。董錦艷等記載，1997年以前共發(fā)現(xiàn)90余種殺線真菌毒素，來源于50多株殺線蟲真菌，分布在擔(dān)子菌、子囊菌和半知菌。測試線蟲大部分為腐生線蟲（Caenorhabditis elegans）、根結(jié)線蟲和胞囊線蟲（Heterodera spp），對于松材線蟲有毒殺活性的代謝物較少[8]。

Kawazu等從真菌菌株D1084中分離到兩種殺線成分，命名為bursaphelocides A和B，100μg的毒素A和B對松材線蟲有活性[9]。孫建華等從土壤真菌中篩選出有極強抗松材線蟲活性的總狀共頭酶（Syncephalastrum racemosum），與松材線蟲一起培養(yǎng)48 h后松材線蟲全部死亡。該菌株（Sr18）活性成分為該菌的代謝產(chǎn)物，是一種水溶性的中性物質(zhì)，具極強的殺線活性[10-11]。董錦艷等報道日本亮耳菌（Lampteromyces japonicus）對松材線蟲有毒殺活性。供試菌株為采自貴州的日本亮耳菌野生型菌株、馴化型菌株和由野生型菌株繼代培養(yǎng)出的退化型菌株，其中退化型菌株對松材線蟲毒殺活性最高 [12]。向紅瓊等檢測了糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreaus）液體培養(yǎng)菌絲體粗提毒素對松材線蟲的毒殺活性，發(fā)現(xiàn)丙酮粗提毒素活性極強，一倍稀釋液15～20 min對松材線蟲擊倒率為100%[13]。

張建平等發(fā)現(xiàn)糙皮側(cè)耳、香菇（Lentinus edodes）、黑木耳（Auricularia auricula）、擬管革裥菌（Lenzites trabea）、粘褶菌（Gloeophyllum trabeum）、潔麗香菇（Lentinus lepideus）、雜色云芝（Polyporus versicolor）等7株木腐菌都對松材線蟲具有一定的抑殺作用，松材線蟲在粘褶菌和糙皮側(cè)耳菌落上完全不能存活[14]。Dong和Zhu等研究表明，近160株淡水真菌供試菌株中黑團孢屬（Periconia）、核孢殼屬（Caryospora）、透孢黑團殼屬（Massarina）、擬殼二孢（Pseudohalonectria）、黑孢殼屬（Melanospora）、長棒孢屬（Camposporium）、蛇孢球殼屬（Ophioceras）等屬的大部分菌株培養(yǎng)濾液或菌絲粗提物對松材線蟲有毒殺活性，并從1個菌株培養(yǎng)物的粗提物中純化出4個具有殺線活性化合物[15-16]。

李國紅等報道了一種殺線蟲側(cè)耳屬擔(dān)子菌（Pleurotus sp.），在12 h內(nèi)松材線蟲的致病率達90%以上，其活性組分不需要誘導(dǎo)可穩(wěn)定生成，水溶性[17]。Dong等研究了181株擔(dān)子菌對松材線蟲的毒殺活性，其中26株真菌菌絲培養(yǎng)濾液具有殺線活性[18]。Liu等對40株青霉（Paecilomyces sp.）真菌的甲醇提取物進行了殺線活性測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)11株對松材線蟲有殺線活性，并從其中一個菌株的提取物中分離純化出一種新的殺線化合物[19]。

綜上所述，對松材線蟲具有毒殺潛力真菌資源較為豐富，已有一定研究基礎(chǔ)并具有開發(fā)應(yīng)用前景，但大部分研究停留在菌株篩選及活性物質(zhì)粗提層面，未深入到相關(guān)毒素組分與結(jié)構(gòu)研究。

2 松材線蟲生防細菌

細菌較真菌生長快，易培養(yǎng)，應(yīng)用細菌防治植物寄生線蟲研究已取得較大進步，并且有許多成功應(yīng)用實例。如寄生性細菌Pasteuria penentrans已被成功地用于防治根結(jié)線蟲。

2.1 殺線細菌

有關(guān)松材線蟲生防細菌活性菌株分離和篩選研究也逐漸增多。Zheng等對206株植物內(nèi)生細菌進行了殺線活性測試，其中92株細菌對秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）有殺線活性，70株細菌對松材線蟲有殺線活性，其中一個缺陷短波單胞菌（Brevundimonas diminuta）菌株LCB-3對兩種線蟲殺線活性最強，并從其培養(yǎng)上清液中分離到一個具有殺線活性化合物[20]。朱麗梅等從馬尾松上分離到的300多株菌株中篩選出一株對松材線蟲具有較高毒性的拮抗細菌JK-JS3，并鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）[21]。牛秋紅等從農(nóng)田植物根部土壤中分離獲得了198株細菌，經(jīng)過毒性測試篩選出松材線蟲生防細菌6株，Bacillus sp. NS-3菌株對松材線蟲的殺滅活性最高，該細菌液體培養(yǎng)上清液和上清蛋白粗提物處理松材線蟲48 h后線蟲的死亡率分別達到50%和100%[22]。羅蘭等從51株蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）菌株中篩選出2個菌株，研究表明其對松材線蟲的致死率分別大于50%和75%[23]。其它的芽孢桿菌也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)具有殺線活性，如側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacillus lateosporus）的多個菌株對松材線蟲都表現(xiàn)出較強毒殺作用。

2.2 新型生防細菌

在美國、加拿大和墨西哥，松材線蟲病并未對松林造成嚴重危害，而在中國、日本和韓國，松樹線蟲病引起松樹的大量死亡，給國民經(jīng)濟和生態(tài)系統(tǒng)造成嚴重損失。這一現(xiàn)象引起了許多專家學(xué)者的注意。美國是松材線蟲病的發(fā)源地，如今松材線蟲病在美國并不嚴重，很可能是美國的松材線蟲致病性較弱。依據(jù)松材線蟲多種病原復(fù)合致病學(xué)觀點，松材線蟲蟲株致病性弱的原因不是松材線蟲本身，而很可能是線蟲體表攜帶的細菌不同。學(xué)者推測，可能美國松材線蟲所攜帶的細菌經(jīng)過了長期的演替已發(fā)展到一個高級階段，美國松材線蟲所攜帶的細菌致病性弱，對環(huán)境的適應(yīng)性強。如果能分離篩選出致病性弱適應(yīng)性強的細菌，釋放到中國松林，來替代松材線蟲體表致病性強的細菌，將有望改變松林微生態(tài)環(huán)境，有助于解決松材線蟲病的防治問題。

南京林業(yè)大學(xué)森林病理實驗室從美國松材線蟲體表分離篩選到一株嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomnas maltophilia）Smal-007，該菌有致病力弱、定殖和替代能力強、對環(huán)境安全無毒等特點，具有防治松材線蟲病的潛能[24-26]。該項成果和專利技術(shù)已經(jīng)在安徽、福建等地推廣應(yīng)用，結(jié)果表明在松林中噴灑Smal-007菌株發(fā)酵液后，林間松樹枯死率下降明顯，對松材線蟲病的防治效果在90%以上，對松材線蟲病的控制效果理想。

3 植物毒素及殺線活性

植物在長期與昆蟲協(xié)同進化過程中，產(chǎn)生了許多種具有殺蟲活性的次生代謝產(chǎn)物。根據(jù)文獻記載，具有殺線蟲活性的植物約有102科226屬316種，研究較多的有菊科、楝科、豆科、十字花科、茄科、禾本科、大戟科、罌粟科、夾竹桃科、含羞草科、百合科等[27]。

隨著人們對松材線蟲研究的深入，許多種植物的提取物對松材線蟲的毒殺潛力已經(jīng)得到很好的評價和印證。Kawazu等最先使用棉球?qū)嶒灧y定了31科61種陸地植物對松材線蟲的毒殺活性，在劑量為每球20 mg時，菊科植物菌陳蒿（Artemisia capillaris）、大薊（Cirsium japonicum）、劍葉金雞菊（Coreopsis lanceolata）、一年蓬（Erigeron annuus），薔薇科植物華東山櫻（Prunus verecunda）、地榆（Sanguisorba officinalis），五加科植物樹參 （Dendropanax trifidius），及大戟科植物油桐（Aleurites fordii）、日本油桐（A.cordata）、白木烏桕（Sapium japonicum）、烏桕（Triadica sebifera）等4科的11種植物的甲醇粗提物對松材線蟲表現(xiàn)出毒殺活性[28]。

Matsuda等報道豆科植物苦參（Sophora flavescens）根部的甲醇提取物對松材線蟲具有很強的毒殺作用，其活性成分被證實為N-甲基野靛堿和臭豆堿。從苦參的地上部分分離到苦參堿殺線蟲活性很弱，槐果堿和槐胺堿具有較強的殺線蟲活性，槐果堿的活性又高于槐胺堿[29]。

Muhammad等使用棉球?qū)嶒灧y定了馬來群島以民間藥用植物和傳統(tǒng)食用蔬菜為主的42科79種植物甲醇粗提物對松材線蟲的毒殺活性。在劑量為每球20 mg時有19科27種植物的粗提物表現(xiàn)出對松材線蟲的毒殺活性。姜科8種植物對松材線蟲都不具有毒殺能力，故推斷姜科植物不含殺線蟲活性物質(zhì)。Muhammad發(fā)現(xiàn)胡椒科植物胡椒 （Piper nigrum）、蔞葉（Piper betle）對松材線蟲具有很好的毒殺作用，研究表明胡椒科植物的有效成分是丙烯基酚類化合物[30]。

趙博光對野生灌木苦豆子（Sophora alopecuroides）中提取的苦豆堿的研究表明，使用含苦豆堿的培養(yǎng)基培養(yǎng)松材線蟲5 d后對線蟲的半致死量為0.026 3 mg/ml；濃度為0.1 mg/ml、0.026 3 mg/ml時，藥后15d對線蟲的致病率分99.9%和94.3%。經(jīng)林間試驗證實，用苦豆堿小面積治療感病黑松，防治效果明顯，同時還發(fā)現(xiàn)苦豆堿制劑具有內(nèi)吸性，對松材線蟲病有良好的預(yù)防作用，該成果已申請國家專利。在實驗的基礎(chǔ)上，提出了官能團對（FGP）的概念，提出了雙稠哌啶類型生物堿分子結(jié)構(gòu)與殺線蟲活性間的關(guān)系的假說，比較圓滿地解釋了N-甲基金雀花堿、臭豆堿、苦參堿、槐果堿、槐胺堿、苦豆堿、金雀花堿、鷹爪豆堿等8種生物堿的結(jié)構(gòu)與其殺線蟲活性間的關(guān)系[31-34]。文艷華等報道毛魚藤（Derris elliptica）根對松材線蟲有極強殺線蟲活性，經(jīng)該抽提物處理后，松材線蟲的增殖比率小于10%；三尖杉（Cephalotaxus fortunei）莖葉、粗榧（Cephalotaxus sinensis）葉、白刺花（Sophora viciifolia）種子、紫斑牡丹（Paeonia suffruticosa）莖有強殺線活性，松材線蟲的增值比率為10%～25%；野菊（Dendranthema indicum）全株有中等殺線蟲活性，松材線蟲的增殖比率為25%～40%[35]。

巨云為等用苦楝（Melia azedarach）樹皮和果實的乙醇提取物對松材線蟲進行生物活性試驗，發(fā)現(xiàn)兩種提取物在100μg/g時對松材線蟲皆具很強的致死作用，其中樹皮提取物的殺線蟲效果稍優(yōu)于果實提取物[36]。

由此可見，植物中針對松材線蟲天然毒素很多。除了苦豆堿、金雀花堿、鷹爪豆堿、槐果堿、槐胺堿、苦參堿、甲基野靛堿、臭豆堿、野靛堿等生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)與作用機制做了較為深入研究外，其它活性成分種類和結(jié)構(gòu)未做具體研究。從殺線植物中分離提取天然殺線活性物質(zhì)，并以這些物質(zhì)為模板進行人工合成，篩選出高效、經(jīng)濟、安全的線蟲控制劑研究已成為一個重要研究方向。

4 討論

全球農(nóng)業(yè)線蟲生防領(lǐng)域，第一代商品制劑由于活菌劑容易受到土壤抑菌作用和環(huán)境因素影響，常常出現(xiàn)施用效果不穩(wěn)定現(xiàn)象，因此人們更加關(guān)注第二代產(chǎn)品開發(fā)，即菌株次生代謝產(chǎn)物的研究與開發(fā)，目前第二代產(chǎn)品開發(fā)多停留于實驗室研究階段。

對一種供試線蟲毒力高的菌株（或代謝物），對另一種供試線蟲不一定具備高毒力。因此，以松材線蟲為靶標的生物防治研究應(yīng)采用松材線蟲為測試線蟲來衡量供篩選菌株或代謝物生防潛力的高低。松材線蟲生物防治研究在菌株篩選和部分代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)、致病機理等方面已取得一定進展，要使這些科研成果更好的應(yīng)用于松材線蟲病防治實踐，應(yīng)針對不同種類的生物資源開展更加深入、系統(tǒng)研究。

參 考 文 獻

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