米曲霉基因工程技術(shù)的進(jìn)展

張智敏 莊淼 金鋒杰

（南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210037）

米曲霉因其特有的生理生化性質(zhì)以及安全無(wú)毒性，被美國(guó)食品藥品管理局（Food and drug adiministration，F(xiàn)DA）及世界衛(wèi)生組織列為食品級(jí)安 全 菌 株（Generally recognizedas safe，GRAS）［1］，被廣泛用于食品、飼料、曲酸生產(chǎn)、釀酒等發(fā)酵工業(yè)和食品加工業(yè)。2005年，隨著米曲霉全基因組序列被破譯，標(biāo)志著米曲霉全基因組時(shí)代的來(lái)臨，結(jié)合基因工程技術(shù)進(jìn)一步推動(dòng)了米曲霉的發(fā)展。與同源性較近的構(gòu)巢曲霉和煙曲霉相比，米曲霉基因組要大7-9 Mb［2］，并且比釀酒酵母的基因組大25 Mb［3］。我們發(fā)現(xiàn)米曲霉相對(duì)于植物和哺乳動(dòng)物具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌、合成能力以及快速生長(zhǎng)，易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，與大腸桿菌和酵母相比也具有強(qiáng)大的翻譯后修飾功能［4］，因此被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞工廠生產(chǎn)多種酶制劑。另外米曲霉還可以用于生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物，如青霉素、曲酸等。當(dāng)然在米曲霉外源表達(dá)過(guò)程中依然存在著一些不足，如mRNA的不穩(wěn)定性［5］，錯(cuò)誤折疊的外源蛋白被自身蛋白酶分解導(dǎo)致外源蛋白產(chǎn)量降低［6］。全基因組的破譯與隨之不斷發(fā)展的基因工程技術(shù)的有效結(jié)合為克服這些不足提供了可能，基于表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed sequence tag，EST）的基因組學(xué)研究和DNA微矩陣技術(shù)的應(yīng)用為深入研究米曲霉外源表達(dá)系統(tǒng)提供了條件［7］，推動(dòng)了米曲霉外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)的研究。這些不斷發(fā)展的基因工程新技術(shù)共同為今后米曲霉的研究鋪展了新的途徑，并為其工業(yè)應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

1 米曲霉轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的基礎(chǔ)研究

在工業(yè)應(yīng)用中，建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是應(yīng)用米曲霉表達(dá)外源蛋白的前提。相對(duì)于酵母和大腸桿菌，米曲霉存在著堅(jiān)韌的細(xì)胞壁，這對(duì)于后期轉(zhuǎn)化有一定的阻礙，因此常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法不僅成本高，且效率低下，如電擊法、基因槍法。為了提高轉(zhuǎn)化率以及降低成本，目前普遍采用的是PEG/CaCl2介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法［8］。

1.1 選擇性標(biāo)記基因的應(yīng)用

常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記基因，如pyrG、niaD、sC、adeA/adeB和argB等；致突型或建立特殊代謝途徑的標(biāo)記基因，如amdS、ptrA等。其中最早開(kāi)發(fā)建立也是目前應(yīng)用最廣泛的是Mattern［9］開(kāi)發(fā)的基于乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶基因（pyrG）的米曲霉轉(zhuǎn)化體系和Kitamoto［10］硝酸鹽還原酶營(yíng)養(yǎng)缺陷型（niaD）轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。之后通過(guò)UV變異以及基因敲除等技術(shù)構(gòu)建了含有多個(gè)篩選標(biāo)記基因缺陷株的米曲霉多重轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，可以在同一菌株中進(jìn)行多個(gè)基因的導(dǎo)入或刪除等基因工程操作［11-12］，為以后米曲霉的生產(chǎn)應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

1.2 染色體加工技術(shù)的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用

在以往的對(duì)米曲霉的基礎(chǔ)研究當(dāng)中，導(dǎo)致米曲霉基礎(chǔ)研究滯后的一個(gè)最主要原因是基因敲除技術(shù)，即同源重組轉(zhuǎn)化效率的低下。Takahashi等［13］通過(guò)敲除非同源末端連接（Nonhomologous end-joining，NHEJ）相關(guān)基因ku70、ku80和ligD等基因，大幅度提高了米曲霉的同源重組效率，從而提高了米曲霉的基因敲除效率。隨著同源重組效率的大幅度提高，Takahashi等還開(kāi)發(fā)了染色體大片段刪除技術(shù)［14-15］，為后面大片段刪除染色體上不必要甚至有害片段提供了技術(shù)支持。由于米曲霉中依然存在著類(lèi)似黃曲霉的毒素合成相關(guān)基因簇，盡管正常情況下是不表達(dá)的，但是也存在著一定的風(fēng)險(xiǎn)，通過(guò)大片段染色體的刪除技術(shù)可以將這些基因簇全部刪除。Jin等［16］在此基礎(chǔ)上對(duì)米曲霉第7條染色體進(jìn)行了基因組縮短實(shí)驗(yàn)，并成功地去除了大部分非必需的冗長(zhǎng)片段以及毒素合成相關(guān)基因簇，不僅促進(jìn)了淀粉酶的生產(chǎn)并且避免了一些對(duì)人體有害的副產(chǎn)物產(chǎn)生。以上這些技術(shù)的開(kāi)發(fā)為今后米曲霉的生產(chǎn)利用開(kāi)辟了一條新的途徑。

除此之外，米曲霉并沒(méi)有有性生殖，因此在生產(chǎn)應(yīng)用方面具有一定的局限性。例如，不能通過(guò)有性雜交獲得更優(yōu)良的生產(chǎn)菌株。Hara等［17］將第8條染色體縮短菌株與第7條染色體縮短菌株分別原生質(zhì)體化并進(jìn)行融合，獲得了兩條染色體同時(shí)縮短的融合體菌株。通過(guò)大片段染色體刪除技術(shù)結(jié)合原生質(zhì)體融合技術(shù)，很有效的解決了這一困擾米曲霉研究者多年的問(wèn)題，并為今后更好的進(jìn)行染色體加工獲得優(yōu)良菌株的選育提供了很好的技術(shù)手段。另外，利用大片段染色體刪除技術(shù)，Jin等［18］還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix，BHLH）家族轉(zhuǎn)錄因子SclR，研究表明SclR不僅能通過(guò)促進(jìn)菌絲融合從而促進(jìn)菌核的形成，同時(shí)還能有效促進(jìn)細(xì)胞核之間的融合能力，為今后通過(guò)細(xì)胞核融合技術(shù)選育優(yōu)良菌種提供了更大的可行性空間［19］。以上研究表明，染色體大片段刪除技術(shù)對(duì)于發(fā)現(xiàn)和探索功能基因的研究也具有重要價(jià)值。

2 米曲霉外源表達(dá)系統(tǒng)的研究

作為工業(yè)生產(chǎn)菌株以及近年來(lái)作為細(xì)胞工廠的廣泛應(yīng)用，米曲霉外源蛋白表達(dá)的研究也越來(lái)越受人們的重視，如何優(yōu)化外源表達(dá)系統(tǒng)對(duì)于米曲霉在工業(yè)上的應(yīng)用意義深遠(yuǎn)。通過(guò)分析米曲霉外源表達(dá)的優(yōu)缺點(diǎn)，結(jié)合近年來(lái)不斷發(fā)展的基因工程技術(shù)，“揚(yáng)長(zhǎng)避短”共同提高米曲霉的外源表達(dá)。

2.1 降低米曲霉自身蛋白酶活性

與原核生物如大腸桿菌的生產(chǎn)/分泌系統(tǒng)相比，在米曲霉中表達(dá)的外源蛋白經(jīng)歷真核翻譯后修飾，包括糖基化和蛋白質(zhì)折疊等。由于這些原因，米曲霉被認(rèn)為是表達(dá)高等真核生物蛋白的最突出的宿主之一［20］。外源蛋白生產(chǎn)很多限制因素，如轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平、分泌過(guò)程和細(xì)胞外降解等［21］。但是目前來(lái)說(shuō)米曲霉自身的蛋白酶是抑制表達(dá)外源蛋白的最主要問(wèn)題，因?yàn)橥庠吹鞍紫鄬?duì)同源蛋白更容易被蛋白酶分解。為了增加外源蛋白的產(chǎn)量，研究人員嘗試了各種生物學(xué)方法。例如，在低溫下進(jìn)行下游處理、較早的將產(chǎn)物與蛋白酶分離、運(yùn)用蛋白酶抑制劑等，這樣處理雖然可以減少水解作用，但是從效果來(lái)看并不樂(lè)觀，因?yàn)樵S多外源蛋白在蛋白產(chǎn)生的過(guò)程中就會(huì)發(fā)生降解［22］。Jin等［23］通過(guò)UV定向變異和選擇標(biāo)記性基因敲除技術(shù)，獲得了具有腺嘌呤（Adenine）和精氨酸（Arginine）營(yíng)養(yǎng)缺陷型的新性狀，最終構(gòu)建多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，并通過(guò)構(gòu)建酸性蛋白酶PepE和三肽酶TppA雙基因敲除菌株來(lái)表達(dá)外源人溶菌酶（Human lysozyme，HLY）基因，使酶產(chǎn)量提高20倍以上。Yoon等［24］在此基礎(chǔ)上連續(xù)敲除5個(gè)蛋白酶基因（tppA、pepE、nptB、dppIV和dppV），同時(shí)破壞5個(gè)蛋白酶基因顯示出外源蛋白牛凝乳酶（CHY）的產(chǎn)量比此前的雙基因敲除（tppA、pepE）提高了34%。Yoon等［11］又進(jìn)一步利用選擇標(biāo)記性基因pyrG可以反復(fù)循環(huán)使用的特點(diǎn)敲除了另外5個(gè)蛋白酶基因（alpA、pepA、AopepAa、AopepAd和cpI），結(jié)果顯示人溶菌酶和牛凝乳酶蛋白產(chǎn)量分別是參照株的3.2倍和3.8倍。為了更精準(zhǔn)的探究影響外源蛋白分泌的蛋白酶基因，Yoon等［25］破壞編碼液泡蛋白分選受體的Aovps10基因，結(jié)果顯示CHY和HLY的最大細(xì)胞外生產(chǎn)水平分別提高了3倍和2.2倍，說(shuō)明Aovps10在外源蛋白降解中起重要作用。之前研究蛋白酶基因（tppA，pepE）的雙重敲除菌株改善了人類(lèi)溶菌酶（HLY）的生產(chǎn)，但是溶菌酶表達(dá)質(zhì)粒由于其整合到基因組中而不能被去除，因此Nemoto等［26］重新構(gòu)建了tppA，pepE破壞菌株作為外源蛋白質(zhì)生產(chǎn)的宿主，通過(guò)UV變異分離出了HLY-超生產(chǎn)突變體。隨后，從突變體中除去含有溶菌酶基因的導(dǎo)入質(zhì)粒，將得到的菌株命名為AUT菌株。Nemoto等利用AUT菌株進(jìn)行外源蛋白生產(chǎn)，結(jié)果顯示HLY和CHY的產(chǎn)量分別比參照菌株高2.6-3.2倍。Yaver 等［27］研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)palB基因被破壞后，米曲霉的脂肪酶表達(dá)量增加。Zhu等［28］破壞三肽基肽酶基因AosedD成功獲得了轉(zhuǎn)化菌株，轉(zhuǎn)化菌株的CHY和HLY的最大產(chǎn)量分別比參照菌落提升了約2.9倍和1.7倍，這表明AoSedD在外源蛋白降解中起重要作用。緊接著Zhu 等［29］在原本高表達(dá)AUT1菌株中再敲除掉兩個(gè)Aovps10和AosedD，結(jié)果表明CHY和HLY的生產(chǎn)水平相對(duì)于AUT1菌株分別提高了1.6倍和2.1倍。

2.2 分泌外源蛋白路徑的優(yōu)化

絲狀真菌分泌生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)常會(huì)受限于一些瓶頸問(wèn)題：包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)折疊、易位、運(yùn)輸和分泌等，外源蛋白的大量表達(dá)將導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic reticulum，ER）超負(fù)荷、蛋白折疊能力的下降以及激活未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)（Unfolded protein response，UPR）［30］。ER 折疊酶和分子伴侶（Molecular chaperones）相關(guān)基因的過(guò)表達(dá)可以部分緩解ER超負(fù)荷。例如，BipA和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（Protein disulfide isomerase，PDI）的基因過(guò)表達(dá)可以有效幫助提高外源蛋白生產(chǎn)［31-32］。而液泡蛋白質(zhì)分選（Vacuolar protein sorting）、自體吞噬（autophagy）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體貨物受體（Endoplasmic reticulum-Golgi cargo receptors）相關(guān)基因也影響著米曲霉外源蛋白的生產(chǎn)［33-34］。

2.3 融合目標(biāo)蛋白到內(nèi)源性分泌酶載體蛋白

為了提高外源蛋白的表達(dá)量除了降低自身蛋白酶的活性，還可以將外源蛋白基因與自身高分泌蛋白基因融合表達(dá)［35］。目前研究表明將外源蛋白基因融合到米曲霉自身高分泌內(nèi)生蛋白基因的末端，能有效的降低外源蛋白被米曲霉自身蛋白酶分解［36］。Ohno 等［37］通過(guò)比較CHY與自身淀粉酶基因融合和非融合基因的兩種米曲霉菌株，得出結(jié)論當(dāng)將CHY與淀粉酶（AmyB）基因融合表達(dá)時(shí)，生產(chǎn)水平增加約2倍。Tsuchiya 將［38］小牛前凝乳酶 cDNA 片段與米曲霉葡萄糖淀粉酶基因（glaA）部分片段融合重組表達(dá)小牛凝乳酶，在浸沒(méi)培養(yǎng)中重組表達(dá)的凝乳酶是凝乳酶基因直接連到 glaA 啟動(dòng)子下游表達(dá)量的5倍。

2.4 其他生物技術(shù)研究方法的應(yīng)用

紫外線照射等引起的隨機(jī)突變是一種比較傳統(tǒng)有效提高絲狀真菌外源蛋白生產(chǎn)能力的方法。如前所述，使用HLY作為篩選指標(biāo)，分離了米曲霉超生產(chǎn)突變株（AUT1-8）。我們進(jìn)一步利用二代測(cè)序技術(shù)和比較基因組學(xué)，第一次在米曲霉變異菌株中成功確定了蛋白生產(chǎn)相關(guān)的變異位點(diǎn)［39］。誘變處理通常分兩個(gè)途徑：化學(xué)物理誘變和基因調(diào)控誘變。誘變處理是目前常用的研究方法，具有操作簡(jiǎn)單成本低等特點(diǎn)，但是具有不可操控性。米曲霉全基因組的破譯和生物技術(shù)的發(fā)展，為人為通過(guò)基因調(diào)控米曲霉功能奠定了基礎(chǔ)。

Ham等［40］通過(guò)y射線的處理野生型米曲霉獲得四代穩(wěn)定曲酸KA最高產(chǎn)量突變體，在麥芽提取物蔗糖培養(yǎng)基（MES）中，KA產(chǎn)量分別是其野生型菌株的2.03倍和1.9倍。人為敲除和反義RNA，可以達(dá)到基因調(diào)控誘變的目的。反義rRNA可以與mRNA分子特異結(jié)合，使mRNA分子沉默，從而抑制該rRNA的加工與翻譯。敲除一些功能基因能改變米曲霉某一功能以及部分表型，如提高部分酶的產(chǎn)量、菌核、菌絲的形態(tài)變化、色素的改變等［41］。Murthy等［42］利用UV處理米曲霉得到一個(gè)高產(chǎn)酸性蛋白酶的菌株，產(chǎn)量為親菌的5.6倍。Wang等［43］利用基因重組等技術(shù)獲得突變體菌株RIII-7，高果糖基轉(zhuǎn)移酶（FTase）活性180 U g-1是原始菌株的2倍，在發(fā)酵培養(yǎng)中，達(dá)到最大值353 U/g。

一直認(rèn)為米曲霉沒(méi)有活性化轉(zhuǎn)座子（Transposon），近年發(fā)現(xiàn)其不僅有活性化轉(zhuǎn)座子（Tc1/marinertype transposable element）和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（LTR-retrotransposable element）的存在，而且在適當(dāng)?shù)臈l件下在米曲霉中可以產(chǎn)生多拷貝現(xiàn)象［44-45］。這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)有望今后在米曲霉中構(gòu)建多拷貝外源蛋白生產(chǎn)菌株從而提高外源蛋白生產(chǎn)能力。

3 米曲霉次生代謝產(chǎn)物的分析

作為發(fā)酵生產(chǎn)菌株，米曲霉不僅能生產(chǎn)大量淀粉酶和蛋白酶，同時(shí)還能生產(chǎn)大量有用的次級(jí)代謝產(chǎn)物，但是這方面的研究進(jìn)展相對(duì)緩慢。隨著近年大量曲霉菌基因組測(cè)序的展開(kāi)，通過(guò)比較基因組學(xué)，可以預(yù)測(cè)一些物質(zhì)的生產(chǎn)，而其中只有很少的一部分代謝產(chǎn)物的相關(guān)基因簇被掌握［46-47］。例如，通過(guò)基因組比較發(fā)現(xiàn)，在米曲霉中保留有生產(chǎn)青霉素的基因簇，而且保持非常高度的完整性，但產(chǎn)量極低。通過(guò)人為調(diào)控基因的高效表達(dá)，使青霉素的產(chǎn)量提高了100倍［48］。除了青霉素以外，米曲霉還生產(chǎn)曲酸等有用次級(jí)代謝產(chǎn)物［49］。綜上所述，盡管近年對(duì)曲霉菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展［50-51］，但是還有很多未知領(lǐng)域等待進(jìn)一步的發(fā)現(xiàn)。

4 問(wèn)題及展望

米曲霉全基因組序列的破譯，為深刻理解米曲霉的遺傳背景和生產(chǎn)性能，快速挖掘其作為工業(yè)生產(chǎn)菌株的潛能，提供了豐富、可靠的遺傳信息，大力推動(dòng)了米曲霉的相關(guān)研究。而隨后的米曲霉基因工程新技術(shù)的建立和快速發(fā)展，更是為其生產(chǎn)菌株的育種和工業(yè)生產(chǎn)利用開(kāi)辟了更多可能的途徑。近年來(lái)的研究雖然一定程度上提高了米曲霉的外源蛋白酶制劑等有用物質(zhì)的生產(chǎn)能力，但與預(yù)期還相差甚遠(yuǎn)。

目前，除了上述外源蛋白表達(dá)中存在的瓶頸問(wèn)題，還有以下一些問(wèn)題需要進(jìn)一步克服，如（1）酶提取過(guò)程中如何保證較高的活性；（2）部分強(qiáng)啟動(dòng)子的導(dǎo)入，如cbh1啟動(dòng)子會(huì)被葡萄糖和其它的容易利用的碳源抑制；（3）目前在工業(yè)生產(chǎn)中，大分子物質(zhì)如麥麩、米糠、青貯飼料、玉米及豆粕等難以被米曲霉所利用，因此利用生物技術(shù)進(jìn)行改良使其能降解吸收大分子物質(zhì)，從而降低生產(chǎn)成本并減少原材料廢棄物帶來(lái)的污染；（4）大量產(chǎn)生的外源蛋白對(duì)于米曲霉本身會(huì)產(chǎn)生一定的不良影響；（5）在米曲霉生長(zhǎng)后期存在反抑制調(diào)控，高濃度產(chǎn)物會(huì)抑制米曲霉的發(fā)酵生產(chǎn)。雖然Ichinose等［52］通過(guò)刪除單creA和雙creA / creB基因片段，在一定程度上提高了在高濃度誘導(dǎo)糖培養(yǎng)后期的淀粉酶活性，但效果并不明顯。

另外，盡管全基因組序列已經(jīng)被破譯，但米曲霉大多數(shù)基因功能尚不明確，對(duì)其生產(chǎn)利用仍存在諸多限制。因此今后仍有很多未知功能基因和領(lǐng)域需要進(jìn)一步的發(fā)現(xiàn)和探索。而近年逐步發(fā)展起來(lái)的組學(xué)新技術(shù)，如比較蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)等為今后功能基因的研究和蛋白分泌途徑的探索開(kāi)創(chuàng)了全局性思維和新視野。綜上，如何將基因工程技術(shù)和米曲霉的生產(chǎn)應(yīng)用完美結(jié)合，獲得高效生產(chǎn)菌株的育種，依然存在很大的空間有待今后更深入的研究和探索。