乙肝病毒疫苗的研發(fā)現(xiàn)狀及未來(lái)展望

龔婭瓊，趙振鑫，黃薇錦，賴欣

（1.云南沃森生物技術(shù)股份有限公司，云南昆明 650000；2.福建天泉藥業(yè)股份有限公司，福建龍巖 364000；3.昆明冶金高等?？茖W(xué)校，云南昆明 650033；4.云南沃森生物技術(shù)股份有限公司，云南昆明 650000）

乙型肝炎病毒疫苗（下文簡(jiǎn)稱乙肝疫苗）是一種提純的乙肝表面抗原，主要的作用是預(yù)防肝炎。接種乙肝疫苗后，會(huì)對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生刺激，從而產(chǎn)生保護(hù)性抗體。體液中存在這種抗體，只要遇到乙肝病毒，抗體就會(huì)發(fā)揮作用，抑制感染，同時(shí)又不會(huì)對(duì)肝臟產(chǎn)生損傷，讓人體具備免疫乙肝病毒的能力。乙肝疫苗研發(fā)至今，已經(jīng)經(jīng)歷了三代，本文將依次展開(kāi)闡述。

1 乙肝疫苗的研發(fā)歷程

1.1 第一代：血源性乙肝疫苗（PDV）

20世紀(jì)70年代末，法國(guó)最先研制出PDV。時(shí)隔兩年，美國(guó)的PDV也通過(guò)了FDA的批準(zhǔn)，開(kāi)始投入使用，并將PDV命名為Heptavax。血源性乙肝疫苗中的丙種球蛋白超過(guò)90%[1]，它是乙肝疫苗免疫后從血液中采集的乙肝抗體效價(jià)的血清或者血漿，再通過(guò)低溫乙醇法制備成特異性免疫球蛋白。我國(guó)開(kāi)始在乙肝高發(fā)地區(qū)使用血源性乙肝疫苗的時(shí)間是1986年，之后將其納入到國(guó)家計(jì)劃免疫規(guī)劃中。經(jīng)過(guò)數(shù)十年的推廣和應(yīng)用，證明血源性乙肝疫苗是安全有效的，能夠預(yù)防并且控制乙型肝炎的發(fā)生。但與此同時(shí)，血源性乙肝疫苗也有一定的安全隱患，比如可能帶有血源性傳播的某些疾病。根據(jù)我國(guó)衛(wèi)生部的要求，2001年以后，PDV不再投入使用[2]，繼而出現(xiàn)的是第二代乙肝病毒疫苗。

1.2 第二代：基因工程乙肝疫苗

第二代疫苗又被叫做基因工程重組乙肝疫苗，指的是通過(guò)DNA重組技術(shù)，在酵母細(xì)胞或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因中插入乙肝病毒表面抗原基因片段[3]，經(jīng)過(guò)體外的培養(yǎng)增殖，形成乙肝表面抗原。收集表面抗原及提純后進(jìn)行相關(guān)制備，從而得到乙肝疫苗?；蚬こ桃呙缬捎谠牧先〔姆浅７奖?，并能夠進(jìn)行工業(yè)化的培養(yǎng)，所以疫苗的生產(chǎn)規(guī)模更大，價(jià)格也有了很大程度的下降。

現(xiàn)階段，乙肝病毒基因通過(guò)以下4種途徑在真核細(xì)胞中表達(dá)。（1）把S、S1或者（和）S2基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)為中華地鼠卵巢細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞，再用轉(zhuǎn)化的中華地鼠卵巢細(xì)胞株通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞大批培養(yǎng)制成乙肝疫苗[4]。（2）在疫苗病毒DNA的非必需區(qū)插入S、S1或（和）S2基因，組建成三重質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中華地鼠卵巢細(xì)胞，其中包含疫苗病毒DNA和乙肝病毒基因，然后用轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)制成乙肝疫苗。（3）把S、S1或（和）S2基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)為酵母，通過(guò)發(fā)酵轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞株，然后制成乙肝疫苗。（4）在昆蟲(chóng)核多角體病毒DNA非必需區(qū)內(nèi)插入S、S1或（和）S2基因，組建成蝶蛹與家蠶，其中含有HBV基因以及昆蟲(chóng)核多角體病毒DNA三重質(zhì)粒轉(zhuǎn)染[5]，最終培養(yǎng)制成乙肝疫苗。

以上4種表達(dá)途徑各有特點(diǎn)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的HBsAg蛋白，能夠分泌到細(xì)胞外面，抗原的提純比較簡(jiǎn)單，可以正確的糖基化，整合外源基因后，不會(huì)輕易的丟失和重排，所以適用于大規(guī)模、連續(xù)性的工業(yè)化生產(chǎn)。酵母表達(dá)系統(tǒng)能夠讓HBsAg糖基化[6]，具有非常理想的免疫原性，但產(chǎn)物卻無(wú)法大量的進(jìn)入細(xì)胞外，所以破碎細(xì)胞提純出抗原的步驟比較繁瑣。由于疫苗病毒的基因組容量很大，能夠插入外源基因的非必需區(qū)也很多，同一時(shí)間表達(dá)許多外源基因，很大程度上促進(jìn)了多價(jià)活疫苗的發(fā)展。

1.3 第三代：合成肽乙肝疫苗

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，國(guó)內(nèi)外將乙肝疫苗的研究重點(diǎn)開(kāi)始放在乙肝病毒前S基因方面。美國(guó)、德國(guó)、法國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)研發(fā)出了人工合成的前S多肽P120-154，并且在人體和黑猩猩上進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，前S多肽P120-154的免疫原性極強(qiáng)，黑猩猩在免疫后，能夠產(chǎn)生滴度很高的保護(hù)性抗體，從而免于乙肝病毒的侵襲。人工合成的前S多肽乙肝疫苗能夠讓對(duì)酵母疫苗、血源性疫苗沒(méi)有反應(yīng)的人產(chǎn)生抗體。

模擬HBsAg部分氨基酸110～137的順序以及化學(xué)合成的HBsAg多肽的抗原性很弱，如果要增強(qiáng)其免疫原性，則要和破傷風(fēng)類的毒素相互偶聯(lián)，形成復(fù)合蛋白分子，使用這種復(fù)合的蛋白分子制作疫苗，可同時(shí)預(yù)防破傷風(fēng)和乙肝。

2 乙肝病毒疫苗的現(xiàn)狀及未來(lái)展望

現(xiàn)在國(guó)家統(tǒng)一采購(gòu)的以及市面上見(jiàn)到的均為重組乙型肝炎疫苗，該類疫苗主要是由哺乳動(dòng)物細(xì)胞和酵母細(xì)胞通過(guò)基因重組等手段制備而成，主要現(xiàn)狀如下。

2.1 哺乳動(dòng)物細(xì)胞乙肝病毒疫苗

從哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的乙肝表面抗原，基本是天然的，因此被認(rèn)為是發(fā)展基因工程乙肝疫苗的重要系統(tǒng)[7]。1988年，法國(guó)巴斯德研究所研發(fā)出的哺乳動(dòng)物（CHO）細(xì)胞重組乙肝疫苗被批準(zhǔn)上市，這種疫苗中含有S和PreS2兩種抗原成分。20世紀(jì)90年代初，我國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所和長(zhǎng)春生物所等機(jī)構(gòu)共同研發(fā)出了中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞（CHO）所表達(dá)的基因工程乙肝病毒疫苗。之后的幾年，蘭州生物研究所、成都生物研究所、華北制藥集團(tuán)、武漢生物研究所、北京華爾盾公司等都得到了批文，每年生產(chǎn)的乙肝疫苗多達(dá)200萬(wàn)～600萬(wàn)支。

2.2 重組酵母乙肝疫苗（YDV）

美國(guó)Merck公司首先研發(fā)出了重組啤酒酵母乙肝疫苗，1986年，經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)后開(kāi)始應(yīng)用，商品名是Recombivax HB。1989年，SKB重組啤酒酵母乙肝疫苗（Engerix-B）同樣獲得美國(guó)FDA的批準(zhǔn)。二者的區(qū)別是[8]：Engerix-B含有的酵母蛋白＜5%，Recombivax HB含有的酵母蛋白＜1%。隨后，日本武田制藥、熊木、鹽野義、綠十字和美國(guó)安進(jìn)等機(jī)構(gòu)研發(fā)的YDV也相繼上市。我國(guó)的深圳康泰生物制藥公司、天壇生物技術(shù)公司每年生產(chǎn)的YDV分別是6 000萬(wàn)支、3 600萬(wàn)支，兩家公司都采購(gòu)了美國(guó)Merck公司的重組酵母乙肝疫苗技術(shù)。上海生物研究所采購(gòu)了SKB公司的重組酵母乙肝疫苗原液，每年的產(chǎn)量多達(dá)2 000萬(wàn)支。世界衛(wèi)生組織（簡(jiǎn)稱WHO）是全球最權(quán)威的疾病臨控機(jī)構(gòu)，目前，WHO已經(jīng)將乙肝納入需要消滅的病種[9]，可見(jiàn)對(duì)乙肝的預(yù)防極其重視。1991年，WHO建議兒童注射乙肝疫苗。1992年，世界衛(wèi)生大會(huì)倡議：五年內(nèi)各國(guó)在免疫擴(kuò)大計(jì)劃中納入乙肝疫苗。截至2011年，全世界把乙肝疫苗接種納入到免疫計(jì)劃中的國(guó)家共有179個(gè)，中國(guó)便是其中之一。當(dāng)前最主要的乙肝疫苗產(chǎn)品有以下幾種。

（1）Bimmugen。日本血清化學(xué)研究所（Chemo-Sero Therapeutic）研制而成，在日本的上市時(shí)間是1988年，主要的銷售公司是藤澤公司。中國(guó)、馬來(lái)西亞和東南亞各國(guó)已經(jīng)計(jì)劃將其上市。

（2）Engerix-B。英國(guó)Edinburgh大學(xué)和Biogen公司共同研制，HB疫苗由山啤酒酵母制成，SKB公司獲得銷售授權(quán)。1992年，Engerix-B在全世界的銷售額超過(guò)4億美元；1996年，增加到5.7億美元；截至2000年，銷售額是7億美元。在全球暢銷的處方藥物中，銷售額排在第68位。

（3）Recombivax。負(fù)責(zé)銷售的是默克公司，由Chiron公司提供乙肝疫苗的生產(chǎn)技術(shù)，在美國(guó)，唯一可以和Engerix-B競(jìng)爭(zhēng)的疫苗產(chǎn)品便是Recombivax[10]，盡管1992年的銷售額只有不到1億美元，但短短四年后，便達(dá)到了4.4億美元，血源性HB疫苗、重組酵母菌HB疫苗各占銷售量的一半。1999年，銷售額是3.1億美元，全球處方藥排名147位。

（4）Gen-hevac-B。這是法國(guó)巴斯德梅里公司（Pasteur Merieux）研制的CHO細(xì)胞HB疫苗，上市時(shí)間是1988年。菲律賓、馬來(lái)西亞、泰國(guó)和中國(guó)香港等國(guó)家與地區(qū)，目前還在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，陸續(xù)投入市場(chǎng)。

3 結(jié)語(yǔ)

如今，乙肝疫苗已經(jīng)發(fā)展了三代，在血源性疫苗被淘汰之后，第二代疫苗被廣泛應(yīng)用于全球各國(guó)家和地區(qū)，在取得成效的同時(shí)，也存在一些缺陷，比如接種后會(huì)出現(xiàn)無(wú)應(yīng)答反應(yīng)以及毒株變異，最終造成免疫逃逸。第三代是DNA疫苗，目前的研究尚處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的起步階段，無(wú)論是理論依據(jù)還是實(shí)驗(yàn)結(jié)論都不夠成熟，接種疫苗后的安全性還需要時(shí)間去驗(yàn)證。但筆者堅(jiān)信，在信息、科學(xué)飛速發(fā)展的21世紀(jì)，DAN疫苗的研發(fā)必然會(huì)有質(zhì)的飛躍。