生物技術(shù)在脂肪酶生產(chǎn)中的應(yīng)用

徐鎖玉

（江蘇旅游職業(yè)學(xué)院，江蘇揚州 225000）

脂肪酶，又稱三酰甘油?；饷?，是一類能催化天然油脂水解生成甘油二脂、甘油單酯、甘油和游離脂肪酸的酶，也是一類能催化酯類化合物合成、酯交換等反應(yīng)的酶，普遍存在于動植物、微生物中，是一種重要的生物催化劑。關(guān)于脂肪酶最早的報道，要追溯到1834年兔胰脂肪酶活性的研究。這些年來，研究者對脂肪酶進入了深入研究。目前，脂肪酶及酶制劑已被廣泛應(yīng)用于食品加工、制藥、污水處理等行業(yè)。

動植物原料提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法是脂肪酶的制備方法。提取法是以富含脂肪酶的動植物組織為原料進行提取，該法分離提純工藝復(fù)雜、產(chǎn)量低。化學(xué)合成法是在分析酶的氨基酸組成順序的基礎(chǔ)上再化學(xué)合成，此法成本高。生物發(fā)酵法是指通過人工控制微生物生長繁殖而獲得酶，受環(huán)境影響小、資源充足、生產(chǎn)脂肪酶的酶周期短，效率高、生產(chǎn)成本低，此外，微生物脂肪酶的作用酸堿度區(qū)間、溫度范圍以及底物專一性比動植物脂肪酶的優(yōu)勢更明顯，故該種酶的應(yīng)用前景也最為光明。當(dāng)下市售商品化脂肪酶主要源于各種微生物的發(fā)酵培養(yǎng)。近年來，國外學(xué)者在產(chǎn)脂肪酶菌種的篩選與分離、發(fā)酵條件的控制等方面做了大量研究，為微生物脂肪酶的工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 脂肪酶生產(chǎn)菌的篩選與分離

脂肪酶在微生物中普遍存在，有65個屬的微生物生產(chǎn)脂肪酶，包括28個屬的細(xì)菌、4個屬的放線菌、10個屬的酵母菌、23個屬的其他真菌。

微生物脂肪酶的生產(chǎn)主要有固、液兩種發(fā)酵法。固態(tài)發(fā)酵（SSF）主要采用來源于工業(yè)三廢、植物油加工廠、牛奶加工廠等的霉菌（酒曲菌屬、曲霉、青霉菌、地絲菌數(shù)、毛霉菌屬、根毛霉屬等）生產(chǎn)。Santis-Navarro等利用植物油廢棄物進行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶，發(fā)現(xiàn)在4.5L反應(yīng)罐中高溫（溫度高于45℃）固體發(fā)酵發(fā)酵20天，能獲得活力120000UA/g的脂肪酶[1]。

液態(tài)發(fā)酵（SME）法主要利用的是細(xì)菌、酵母菌及少部分霉菌。其中細(xì)菌主要是桿菌屬：枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、噬堿芽孢桿菌、產(chǎn)堿桿菌屬、節(jié)細(xì)菌屬、芽孢桿菌、假單胞菌伯克氏、色素細(xì)菌；酵母菌：皺褶假絲酵母、膠紅假絲酵母、熱帶假絲酵母、柱狀假絲酵母、畸形假絲酵母、南極假絲酵母、木糖畢赤酵母及星狀毛孢子菌等。ThiagoA.Marques[2]等利用一種新型康氏木霉液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)脂肪酶，脂肪酶的活性最高能達108.7U/mL。MarimuthuKrishnaveni從土壤樣品中篩選出了可以產(chǎn)生脂肪酶的金黃色葡萄球菌MTCC10787，該法經(jīng)濟高效[3]。

2 脂肪酶生產(chǎn)條件研究

發(fā)酵法生產(chǎn)脂肪酶，除了篩選出高效產(chǎn)脂肪酶的菌株，其生產(chǎn)條件也很重要。生產(chǎn)條件主要包括培養(yǎng)溫度、pH、溶氧及培養(yǎng)基組分。其中培養(yǎng)基類別往往決定了組分種類、含量。培養(yǎng)基一般分人工合成、天然和混合培養(yǎng)基。人工合成培養(yǎng)基成分明確，天然培養(yǎng)基一般為工業(yè)、農(nóng)業(yè)殘余物?；旌吓囵B(yǎng)基是前兩者混合。WaelAbdelmoez用油脂化工廢棄物做培養(yǎng)基，通過皺褶假絲酵母ATCC 14830液態(tài)深層發(fā)酵制得脂肪酶，活性最高能達10 U/mL[4]。

為考察溫度、pH、溶氧及培養(yǎng)基等因素對脂肪酶生產(chǎn)的綜合影響，研究者一般經(jīng)單因素、正交試驗及響應(yīng)面等統(tǒng)計實驗設(shè)計法，以提高脂肪酶產(chǎn)量。Chien-Hung Liu等[5]研究了影響伯克氏菌屬發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的因素，發(fā)現(xiàn)當(dāng)曝氣量從0.5調(diào)節(jié)到2時，能使脂肪酶生產(chǎn)速率從0.057提高至0.076 U／（ml·h），由此可見溶氧量增加會促進脂肪酶的生產(chǎn)。RafaelResendeMaldonado等[6]考察了溫度、初始pH、蛋白胨和豆油濃度對地霉菌產(chǎn)脂肪酶的影響，得到最優(yōu)條件為溫度30℃、初始pH7.0、3.0%蛋白胨、0.5%豆油，此時產(chǎn)量16U/mL。G. Kishan[7]對解脂假絲酵母生產(chǎn)脂肪酶培養(yǎng)基的關(guān)鍵成分進行了正交試驗設(shè)計，試驗表明麻花含量6.0%、葡萄糖2.0%、MnCl20.2% 和KH2PO40.2%時，得脂肪酶的最大生產(chǎn)量9.40U/mL。ChristinaPapagora等[8]采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化了德巴利酵母菌體外生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基成分，發(fā)現(xiàn)酵母提取物5.0%、蛋白胨10%、K2HPO44.0%、MgSO4·H2O 1.0%、葡萄糖13.1%、橄欖油19%、pH值6.4為最佳條件，此時脂肪酶活7.44 U/mL，比之前高 2.28倍。Mar? a Guadalupe Sanchez-Otero[9]利用響應(yīng)曲面法顯著改善了地芽孢桿菌CCR11生產(chǎn)脂肪酶的效率，得出營養(yǎng)肉湯的最優(yōu)濃度3.8 g/L和最佳溫度39.5℃。再經(jīng)驗證實驗，證實最優(yōu)條件下脂肪酶的產(chǎn)量達到（2283.70±118.36）U/mL，比未優(yōu)化前高6.7倍。

3 其他提高酶產(chǎn)量的生物學(xué)方法

提高脂肪酶產(chǎn)量的方法，除優(yōu)化生產(chǎn)過程的培養(yǎng)條件，還可采用其他手段，譬如誘變育種、異源表達、定點突變、定向進化等。

3.1 誘變育種

高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)酶菌株逐漸成為其應(yīng)用研究開發(fā)的關(guān)鍵。除尋找天然優(yōu)質(zhì)菌株，誘變育種也是一種有效手段。誘變育種是用物理或化學(xué)誘變劑處理菌株提高其突變率，再篩選出少數(shù)滿足要求的突變株。誘變劑主要有亞硝酸、紫外線、亞硝基胍、快中子、硫酸二乙酯等，正突變篩選劑一般有溴化乙錠、膽鹽、克霉唑、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉、丁酸、三丁酸甘油酯和己酸等。此法一般可將脂肪酶產(chǎn)量提高10倍左右，最大可達40倍。楊帆等用紫外誘變了從深海環(huán)境中篩選一株產(chǎn)低溫脂肪酶菌株，在誘變劑量81%時，得到一株能穩(wěn)定遺傳的正突變株UM3，此時酶活達2540～2710 U/mg，比原始菌株提高34%～39%[10]。

3.2 異源表達

異源表達是指將某來源的脂肪酶基因在另一生物體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)實現(xiàn)表達，常見于在微生物及病毒中的表達。郭勇亮將米根霉基因組作為模板，參照NCBI公布的米根霉脂肪酶基因序列進行引物設(shè)計，試驗后得到編碼米根霉脂肪酶前導(dǎo)肽序列及成熟序列的基因——ProROL，在此基礎(chǔ)上，展開pPIC9KProROL質(zhì)粒的構(gòu)建，線性化后電轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母菌株GS115，最后再經(jīng)過嚴(yán)格篩選，成功得到陽性重組菌。搖瓶及7 L罐發(fā)酵結(jié)果顯示，以p-NPP為底物，搖瓶誘導(dǎo)3.5天后上清液酶活為10.6 U/mL。實現(xiàn)了脂肪酶的高效異源表達[11]。王建榮等[12]利用同源克隆法獲得了門多薩假單胞菌P10脂肪酶基因的全長序列，經(jīng)檢測表明，該基因的DNA全長序列為801bp，編碼267個氨基酸，經(jīng)推測，這是一種相對分子量為29.95kU的蛋白。然后再通過將該脂肪酶基因連接到pPICZαA載體上，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，最后轉(zhuǎn)化到畢赤酵母X-33中。脂肪酶基因在畢赤酵母X-33中實現(xiàn)分泌表達，搖瓶發(fā)酵液上清酶活最大可達8U/mL。

3.3 定點突變

定點突變指通過PCR等手段定向改變目的DNA片段，包括堿基的添加、刪除、點突變等。較之化學(xué)突變和自然突變，定點突變具有突變率高、重復(fù)性好的等優(yōu)點，已被廣泛用于酶性能的改善。為獲得耐熱型PLD，JasminaDamnjanovic等[13]嘗試了定點突變組合突變體的高通量篩選方法。采用在鏈霉菌屬PLD特定的氨基酸位點引入隨機突變的方法，篩選獲得熱穩(wěn)定性最好的D40H/T291Y突變體，試驗表明：較之野生型，該突變體的酶活在65℃條件下的半衰期更長。

3.4 定向進化

酶的體外定向進化是人為地有計劃地通過突變和體外重組酶的基因進而得到高性能脂肪酶的方法[12]。較之自然進化，定向進化法只作用于突變后的分子群，更有計劃與目的性。然而保證基因突變庫的豐富性與多樣性是該方法成功的前提，再者還依賴于合適的篩選壓力及高靈敏度高通量的篩選檢測技術(shù)。劉浩[14]等對圓弧青霉堿性脂肪酶I（PCL）進行了定向進化，通過重疊PCR和易錯PCR技術(shù)，最終得到兩株熱穩(wěn)定性明顯提高的變異體L41P和G47I。

4 展望

21世紀(jì)是生命科學(xué)的世紀(jì)，脂肪酶的生產(chǎn)也要依靠于生物技術(shù)。要將更多先進的生物技術(shù)運用到脂肪酶的生產(chǎn)、應(yīng)用研究中，不斷改良菌株，提高酶活，提升酶特性，是今后的發(fā)展方向。