鈷酞菁功能化聚合物整體柱的制備及用于轉(zhuǎn)鐵蛋白糖肽的富集

張文娟,　宋乃忠,　賈　瓊(吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 吉林 長(zhǎng)春 130012)

蛋白質(zhì)糖基化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式,普遍存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,對(duì)蛋白質(zhì)的功能、結(jié)構(gòu)有著重要影響,并在許多生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。大量研究表明糖蛋白可以作為多種疾病的生物標(biāo)記物[1,2]。質(zhì)譜是分析蛋白質(zhì)糖基化的強(qiáng)大工具,但大多數(shù)糖蛋白是低豐度蛋白質(zhì),難以達(dá)到質(zhì)譜的靈敏度或存在質(zhì)譜分析電離效率較差等問(wèn)題[3]。因此,對(duì)復(fù)雜樣本中的糖蛋白進(jìn)行有效富集分離是實(shí)現(xiàn)高效糖蛋白鑒定的必要前提。常見(jiàn)的糖蛋白或糖肽富集策略包括凝集素親和層析法[4]、硼酸親和富集法[5]、肼化學(xué)富集法[6]和親水作用色譜法[7]。由于聚合物整體柱具有滲透性高、穩(wěn)定性高、傳質(zhì)速度快等優(yōu)勢(shì)[8],已被成功用于糖蛋白或糖肽的富集。為了提高富集選擇性,通常對(duì)聚合物整體材料進(jìn)行改性,改性材料包括金納米粒子[9]、氧化石墨烯[10]和硼酸[11]等。

酞菁(Pcs)是一種具有18個(gè)π電子的大共軛體系化合物,由4個(gè)異吲哚亞基通過(guò)氮原子連接在一起[12]。酞菁分子環(huán)內(nèi)有一個(gè)空穴,可以與70余種金屬離子形成金屬酞菁(MPc)[13]。金屬酞菁及其衍生物已廣泛應(yīng)用于電化學(xué)傳感[14]、氣體傳感[15]和光動(dòng)力治療藥物[16]等。在酞菁環(huán)外周或者軸向位置引入各種取代基可以提高其在水和有機(jī)溶劑中的溶解度[17]。金屬酞菁配合物可以和不同的分析物通過(guò)中心金屬配位作用、π-π相互作用、氫鍵和范德華力結(jié)合[18]。Yu等[19]通過(guò)銅酞菁和功能單體之間的氫鍵作用合成了銅酞菁分子印跡聚合物,成功用于腐殖酸中酞菁類似物的分離;Candiano等[20]證實(shí)阿爾新藍(lán)(具有外周取代酞菁結(jié)構(gòu)的典型染料)能夠特異性結(jié)合糖蛋白和糖胺聚糖。盡管酞菁在糖肽分離富集方面具有潛在能力[21],但根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)查表明,很少有研究報(bào)道酞菁在分離領(lǐng)域中的應(yīng)用。

轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)是血漿中主要結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)鐵的糖蛋白,分子質(zhì)量約為80 kDa,主要負(fù)責(zé)運(yùn)載由胃腸道吸收的鐵和由紅細(xì)胞降解釋放的鐵[22]。在本工作中,將四羧基酞菁鈷(CoPcTc)引入聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯)(GMA-EDMA)整體柱,作為聚合物整體柱微萃取(PMME)[23]的材料,并結(jié)合電噴霧四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(ESI-Q-TOF MS)用于轉(zhuǎn)鐵蛋白糖肽的富集,并證明其具有很高的糖肽富集選擇性。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　儀器、試劑與材料

Nicolet is5型傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR, Thermo Nicolet公司,美國(guó)); microTOF-Q Ⅱ型電噴霧四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(Bruker Daltonics公司,美國(guó)); DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(上海羌強(qiáng)實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司); LSP01-1A型注射泵(保定蘭格恒流泵有限公司)。

GMA、EDMA、Tf(純度≥98%)、牛血清白蛋白(BSA)、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺和胰蛋白酶(Sigma Aldrich公司,美國(guó));環(huán)己醇、月桂醇、乙二胺、3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)、N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和尿素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);丙酮、氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸(HCl)、乙腈(ACN)、甲醇、偶氮二異丁腈(AIBN)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲酸(FA)和碳酸氫銨(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所);六水合氯化鈷(CoCl256H2O)、鉬酸銨((NH4)2Mo2O7)和偏苯三酸酐(鄭州阿爾法化工有限公司);石英毛細(xì)管(530 μm,河北永年光纖廠)。所有試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2　CoPcTc的合成

根據(jù)參考文獻(xiàn)[24,25]制備CoPcTc:將充分研磨的1.50 g偏苯三酸酐、6.00 g尿素、0.06 g (NH4)2Mo2O7、1.38 g CoCl256H2O混合均勻,加入帶有回流冷凝和攪拌裝置的100 mL燒瓶中,攪拌條件下加熱至160 ℃并保持3 h,然后繼續(xù)升溫至230 ℃反應(yīng)6 h。將得到的固體用沸水洗至濾液無(wú)色,再將其用100 mL 2 mol/L NaOH溶液在100 ℃下水解12 h,靜置、冷卻至室溫后,過(guò)濾,用濃鹽酸調(diào)節(jié)濾液的pH值至2。靜置過(guò)夜,過(guò)濾并收集沉淀,將得到的產(chǎn)物用大量的水、甲醇、丙酮清洗數(shù)次,最后于80 ℃真空干燥。

1.3　聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整體柱的制備

首先根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[26]對(duì)毛細(xì)管管壁(20 cm×530 μm)進(jìn)行硅烷化處理:依次用丙酮、1 mol/L NaOH、超純水、1 mol/L HCl、水、丙酮各沖洗30 min。將含60%(v/v)γ-MAPS試劑的丙酮溶液注入毛細(xì)管中,兩端用硅膠密封,置于烘箱中,于55 ℃加熱14 h,用丙酮沖洗30 min,再用氮?dú)獯蹈伞?/p>

制備聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整體柱包括以下3個(gè)步驟:(1)稱取適量單體GMA(173 μL)和EDMA(114 μL)、致孔劑環(huán)己醇(655 μL)和月桂醇(70 mg)以及引發(fā)劑AIBN(4 mg),超聲30 min,混合均勻,通入氮?dú)?0 min除去氧氣和氣泡。將上述得到的聚合反應(yīng)液注入處理過(guò)的毛細(xì)管中,毛細(xì)管兩端用硅膠密封,于60 ℃反應(yīng)24 h。反應(yīng)完成后,將得到的整體柱用甲醇沖洗，去除未反應(yīng)的單體和致孔劑。(2)將乙二胺溶液以100 μL/min的流速通過(guò)預(yù)先制備的聚(GMA-EDMA)整體柱,30 min后將柱兩端用硅膠密封,于70 ℃反應(yīng)4 h[27]。反應(yīng)完成后,用過(guò)量的水沖洗整體柱至中性。(3)將CoPcTc(10 mg)超聲分散在0.5 mL DMF溶液中,然后加入DCC(13.24 mg),攪拌20 min,然后以50 μL/min的流速通過(guò)氨基修飾的聚(GMA-EDMA)整體柱,直至有藍(lán)色溶液流出[28],然后用硅膠密封柱兩端,在室溫下反應(yīng)24 h。將得到的聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整體柱分別用甲醇和純水沖洗。

1.4　樣品前處理

稱取1 mg標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)鐵蛋白樣品,溶解于1 mL 50 mmol/L碳酸氫銨溶液中,于95 ℃加熱變性10 min,冷卻至室溫后加入10 mmol/L二硫蘇糖醇,于56 ℃反應(yīng)1 h,再加入20 mmol/L碘乙酰胺,在室溫下于暗處反應(yīng)45 min。按照底物:胰蛋白酶=30∶1的質(zhì)量比加入胰蛋白酶,于37 ℃水浴條件下酶解16 h,然后在室溫下加入2 μL甲酸終止反應(yīng)。酶解液置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹29]。

牛血清白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白的混合樣品也按照上述方法進(jìn)行處理。

1.5　糖肽富集

將0.3 mL上樣溶液(含80%(v/v)ACN和0.1%(v/v)FA的水溶液)以30 μL/min的流速推過(guò)整體柱(3 cm),然后將0.4 mL轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解液以10 μL/min的流速流經(jīng)整體柱,再用2 mL上樣溶液以50 μL/min的流速去除非糖肽。最后用解析液(含50%(v/v)ACN和0.1% (v/v)FA的水溶液)以4 μL/min的流速推過(guò)整體柱,收集解析液10 min,將得到的解析液通過(guò)質(zhì)譜分析。

1.6　質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧電離源,正離子模式(ESI+);離子源溫度:110 ℃;電噴霧電壓:2.3 kV;掃描范圍:m/z800～2 000;毛細(xì)管電壓:3 500 V;碰撞解離能量:10 eV;去溶劑氣體:氮?dú)?去溶劑溫度:200 ℃;去溶劑氣體流速：8 L/min。

2　結(jié)果與討論

2.1　CoPcTc加入量的選擇

聚(GMA-EDMA)整體柱具有均一多孔的結(jié)構(gòu),有利于快速傳質(zhì)。當(dāng)在聚合液中加入CoPcTc的含量為5 mg或10 mg時(shí),整體柱的多孔結(jié)構(gòu)依然存在;當(dāng)CoPcTc的加入量超過(guò)15 mg時(shí),用甲醇溶液沖洗時(shí),發(fā)現(xiàn)整體柱的通透性變差。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用加入10 mg CoPcTc制備的聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整體柱。

圖 1　(a) CoPcTc、(b)聚(GMA-EDMA)整體柱和(c)聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整體柱的紅外光譜圖Fig. 1　FT-IR spectra of (a) CoPcTc, (b) poly(GMA-EDMA) monolith and (c) poly(GMA-EDMA-CoPcTc) monolith CoPcTc: cobalt phthalocyanine tetracarboxylic acid; GMA: glycidyl methacrylate; EDMA: ethyleneglycol dimethacrylate.

2.2　聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整體柱的表征

CoPcTc、聚(GMA-EDMA)整體柱和聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整體柱的紅外光譜圖見(jiàn)圖1。如圖1a所示,1 150、1 092、944和739 cm-1處的吸收峰為酞菁化合物的特征吸收峰,說(shuō)明形成了酞菁大環(huán)結(jié)構(gòu)[30]; 3 430 cm-1處的吸收峰屬于 -OH的伸縮振動(dòng)吸收峰;1 664和1 332 cm-1處的吸收峰屬于C=O伸縮振動(dòng)峰和C-O伸縮振動(dòng)峰,證明合成的酞菁分子中含有羧基基團(tuán)。如圖1b所示,1 740 cm-1處的吸收峰屬于GMA和EDMA分子上的C=O伸縮振動(dòng)峰;圖1c中新出現(xiàn)的1 652 cm-1處的吸收峰為整體柱上酰胺鍵的特征峰[31],證明CoPcTc已經(jīng)成功鍵合在聚(GMA-EDMA)整體柱上。

2.3　聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整體柱對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白糖肽的富集

考察了聚(GMA-EDMA)整體柱和聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整體柱對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解液中糖肽的富集性能。在富集前,由于非糖肽的質(zhì)譜信號(hào)較強(qiáng),抑制了糖肽的信號(hào),只能得到4條糖肽。經(jīng)過(guò)聚(GMA-EDMA)整體柱和氨基修飾的聚(GMA-EDMA)整體柱富集后,分別可以得到6條和7條糖肽,但是糖肽信號(hào)依然較弱。然而,經(jīng)過(guò)聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整體柱富集后,非糖肽的信號(hào)幾乎已經(jīng)消除,原本非常微弱的糖肽信號(hào)的峰強(qiáng)度有顯著增強(qiáng),共檢測(cè)到17個(gè)糖肽信號(hào),且發(fā)現(xiàn)多個(gè)富集前未能檢測(cè)到的糖肽信號(hào)峰,具體的氨基酸序列見(jiàn)表1。CoPcTc能夠提高對(duì)糖肽的富集能力,這主要是由于CoPcTc的鈷原子能夠和肽段之間產(chǎn)生配位作用,更重要的是CoPcTc結(jié)構(gòu)中異吲哚基上的氮基團(tuán)可以和糖肽形成氫鍵作用[20],從而提高了富集選擇性。為進(jìn)一步說(shuō)明聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整體柱對(duì)糖肽的富集選擇性,用質(zhì)量比為1 000∶1的牛血清白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白的混合物作為樣品進(jìn)行分析,富集前后分別得到2個(gè)和6個(gè)糖肽信號(hào)(見(jiàn)表1)。證明修飾的整體材料具有抗非糖肽信號(hào)干擾的能力。

表 1　標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解液、牛血清白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白混合酶解液通過(guò)不同整體柱富集得到的轉(zhuǎn)鐵蛋白糖肽信息Table 1　Detailed information of glycopeptides enriched from transferrin (Tf) digests and the digests mixture of bovine serum albumin and transferrin by different monoliths　m/z

Tf: transferrin; BSA: bovine serum albumin. N*:N-glycosylation site.

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估了聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整體柱對(duì)糖肽富集的檢測(cè)靈敏度,分別對(duì)濃度為1.8×10-9mol/L和8.8×10-10mol/L的轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解液進(jìn)行富集,結(jié)果見(jiàn)圖2。

對(duì)于1.8×10-9mol/L的酶解液,得到6個(gè)糖肽信號(hào);對(duì)于8.8×10-10mol/L的酶解液,其質(zhì)譜圖中依然可以觀察到3個(gè)糖肽信號(hào),說(shuō)明本方法具有對(duì)微量樣品分析的潛力。

圖 2　聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整體柱對(duì)(a)1.8×10-9mol/L和(b)8.8×10-10mol/L的轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解液富集的質(zhì)譜圖Fig. 2　Mass spectra of (a) 1.8×10-9mol/L and (b) 8.8×10-10mol/L Tf digest after enrichment by poly(GMA-EDMA-CoPcTc) monolith Peak identifications were the same as those in Table 1.

3　結(jié)論

本文將CoPcTc引入到聚(GMA-EDMA)整體柱中,制備了新型的聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整體柱,建立了一種PMME-ESI-Q-TOF MS的方法,成功用于轉(zhuǎn)鐵蛋白糖肽的富集。CoPcTc和糖肽之間的配位和氫鍵作用增強(qiáng)了糖肽的富集效率和選擇性。本工作不僅提供了一種新的高效富集糖肽的材料,還進(jìn)一步開(kāi)拓了金屬酞菁的應(yīng)用領(lǐng)域。

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