CD44和NANOG在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及其臨床意義*

侯小滿，林雪艷，田永杰

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院婦科，山東 濟(jì)南 250021)

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是婦科最常見的惡性腫瘤之一，死亡率居婦科惡性腫瘤首位。由于大部分患者確診時已進(jìn)展至晚期，且極易發(fā)生化療耐藥，導(dǎo)致其五年生存率始終徘徊在30%～40%?！澳[瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)學(xué)說”認(rèn)為，在腫瘤實質(zhì)中，存在小部分具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，同時具備自我更新和分化的能力，并介導(dǎo)腫瘤化療耐藥和復(fù)發(fā)[1]。CD44家族是一類跨膜糖蛋白，同屬于細(xì)胞黏附受體，參與細(xì)胞生長、分化和遷移等生物學(xué)過程[2]，因其特殊的生物學(xué)功能，諸多研究將CD44分子作為分離和鑒定CSCs的表面標(biāo)記物[3]。NANOG作為核轉(zhuǎn)錄因子，于多能胚胎干細(xì)胞高表達(dá)，極少在成體組織中表達(dá)，除外“干性”維持，NANOG在腫瘤生發(fā)中的作用亦受到越來越多的關(guān)注[4]。目前，對上皮性卵巢癌中CD44和NANOG關(guān)系的研究不多見，本研究擬通過免疫組織化學(xué)法來檢測CD44和NANOG在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)并探討其臨床意義，為分離鑒定卵巢癌腫瘤干細(xì)胞提供理論依據(jù)；同時利用Western blot法檢測經(jīng)不同濃度順鉑(cisplatin)處理后的卵巢癌SKOV3細(xì)胞中CD44和NANOG蛋白表達(dá)水平的變化，探討化療對腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響。

材　料　和　方　法

1　組織標(biāo)本

收集2013年1月～2015年12月于山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院婦科住院患者的手術(shù)切除組織標(biāo)本，其中EOC組織標(biāo)本75例(含65例卵巢漿液性囊腺癌，4例卵巢黏液性囊腺癌，3例卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌和3例卵巢透明細(xì)胞癌)，良性卵巢腫瘤組織標(biāo)本40例(含16例卵巢漿液性囊腺瘤及24例卵巢黏液性囊腺瘤)，相關(guān)石蠟切片由山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院病理科提供并完成病理鑒定。

1.1患者納入標(biāo)準(zhǔn)EOC組系術(shù)后病理確診為EOC的患者，全部患者均為初次手術(shù)，且術(shù)前未接受過放、化療和腫瘤免疫治療；良性卵巢腫瘤組，即對照(control)組系因卵巢漿液性或黏液性囊腺瘤行卵巢腫瘤切除術(shù)的患者，患者術(shù)前近6個月未服用過雌、孕激素類藥物；所有標(biāo)本的獲取均已征得患者同意及山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院倫理委員會的許可。

1.2排除標(biāo)準(zhǔn)同時合并有其它惡性腫瘤的患者。

2　細(xì)胞培養(yǎng)

人卵巢癌細(xì)胞SKOV3購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，采用含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

3　主要試劑

兔抗人CD44單克隆抗體、兔抗人NANOG單克隆抗體和兔抗人β-tubulin多克隆抗體均購自Abcam；免疫組化試劑盒、DAB和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG II 抗均購自北京中杉金橋生物科技有限公司；胎牛血清購自BI；Maccoy’s 5A培養(yǎng)基購自Macgene；順鉑購自Sigma。

4　主要方法

4.1免疫組織化學(xué)法檢測CD44及NANOG的蛋白表達(dá)各手術(shù)切除標(biāo)本分別經(jīng)甲醛固定和石蠟包埋后制成4 μm的連續(xù)切片備用。應(yīng)用免疫組化SP法對實驗標(biāo)本進(jìn)行分批染色，以PBS代替 I 抗作為陰性對照，具體操作步驟嚴(yán)格遵照免疫組化SP試劑盒說明書進(jìn)行。

4.2結(jié)果判定在光鏡下隨機(jī)觀察5個高倍鏡視野,按每高倍鏡視野中出現(xiàn)陽性染色細(xì)胞所占百分比進(jìn)行計分:陽性染色細(xì)胞數(shù)<5%計0分，5%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分；觀察陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度，染色呈淡黃色計為1分，棕黃色計為2分，棕褐色者計為3分。5個視野中陽性細(xì)胞百分比計分的平均值與染色強(qiáng)度計分平均值的乘積即為最終陽性強(qiáng)度評分:0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中度陽性(++)，>5分為強(qiáng)陽性(+++)。全部免疫組化結(jié)果由2名有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師采用雙盲法閱片評分。

4.3Western blot法檢測順鉑對SKOV3細(xì)胞中CD44及NANOG蛋白表達(dá)的影響SKOV3細(xì)胞分別以濃度為0、1、2和4 mg/L的順鉑處理24 h后進(jìn)行細(xì)胞總蛋白提取和定量。全部蛋白樣本按等質(zhì)量上樣，行10% SDS-PAGE分離目的蛋白后轉(zhuǎn)至PVDF膜，以5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST洗膜3次后分別加入抗CD44(1：2 000)、NANOG(1：2 000)和β-tubulin(1：500) I 抗，4 ℃搖床孵育過夜。次日TBST洗膜3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG II 抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次后顯影。本實驗重復(fù)3次，應(yīng)用Image J軟件分析目的蛋白與相應(yīng)內(nèi)參照蛋白條帶的灰度值比值。

5　統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件做統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，均數(shù)間差異應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行比較；率之間的比較采用2檢驗，應(yīng)用Spearman相關(guān)分析計算指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

1　CD44和NANOG在上皮性卵巢癌和良性卵巢腫瘤組織中的表達(dá)

CD44陽性染色位于胞膜，NANOG陽性染色主要位于胞核，部分位于胞漿。CD44在EOC中的陽性表達(dá)率為66.7%(50/75)，顯著高于良性卵巢腫瘤組織中的陽性表達(dá)率[17.5 %(7/40)](P<0.01)；NANOG在EOC中的陽性表達(dá)率為70.7 %(53/75)，顯著高于良性卵巢腫瘤組織的陽性表達(dá)率[25.0 %(10/40)](P<0.01)，見圖1、表1。

Figure 1.The results of immunohistochemical assay (SP,×400).A:positive expression of CD44 in EOC; B:negative expression of CD44 in benign ovarian tumor; C:positive expression of NANOG in EOC; D:negative expression of NANOG in benign ovarian tumor.
圖1CD44和NANOG在上皮性卵巢癌和良性卵巢腫瘤中的表達(dá)及定位

表1　CD44和NANOG在上皮性卵巢癌和良性卵巢腫瘤組織中的陽性表達(dá)率Table 1.The positive expression rates of CD44 and NANOG in EOC and benign ovarian tumor (control) tissues

經(jīng)Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，上皮性卵巢癌中CD44和NANOG的表達(dá)水平呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.346(P<0.01)，見表2；而在良性卵巢腫瘤組織中，CD44和NANOG的表達(dá)水平無顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=0.167，見表3。

2　CD44和NANOG的表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理之間的關(guān)系

上皮性卵巢癌中，CD44在卵巢癌FIGO分期Ⅲ+Ⅳ組的陽性表達(dá)率高于FIGO分期Ⅰ+Ⅱ組(P<0.05)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組的陽性表達(dá)率高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組(P<0.05)；而在不同年齡(≤50歲和>50歲)、EOC病理類型(漿液性和其它)、組織病理分級(G1+G2和G3)和腫瘤位置(單側(cè)和雙側(cè))組間的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。

NANOG在卵巢癌FIGO分期Ⅲ+Ⅳ組的陽性表達(dá)率高于FIGO分期Ⅰ+Ⅱ組(P<0.05),在組織病理分級G3組的陽性表達(dá)率高于G1+G2組(P<0.05)；而在不同年齡(≤50歲和>50歲)，EOC病理類型(漿液性和其它)，有、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤位置(單側(cè)和雙側(cè))組間的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見表4。

表2　上皮性卵巢癌中CD44和NANOG的表達(dá)水平Table 2.The expression of CD44 and NANOG in EOC

表3　良性卵巢腫瘤中CD44和NANOG的表達(dá)水平Table 3.The expression of CD44 and NANOG in benign ovarian tumor

表4　CD44和NANOG的表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理間的關(guān)系Table 4.The relationship between the expression of CD44,NANOG and clinical features of EOC

3　順鉑對SKOV3細(xì)胞中CD44及NANOG表達(dá)的影響

Western blot法檢測卵巢癌SKOV3細(xì)胞總蛋白發(fā)現(xiàn)，順鉑可上調(diào)SKOV3細(xì)胞中CD44和NANOG的蛋白表達(dá)水平，見圖2。順鉑作用24 h后，與對照組(0 mg/L)相比,藥物濃度1、2和4 mg/L組的CD44表達(dá)量均有上調(diào)，且差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)；藥物濃度2和4 mg/L組與對照組相比,NANOG表達(dá)量亦升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05),見表5。

Figure 2.The expression of CD44 and NANOG in SKOV3 cells induced by cisplatin were detected by Western blot.
圖2順鉑上調(diào)SKOV3細(xì)胞CD44和NANOG蛋白表達(dá)

表5順鉑誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞CD44和NANOG蛋白表達(dá)升高
Table 5.The expression of CD44 and NANOG in SKOV3 induced by cisplatin were detected by Western blot (Mean±SD.n=3)

Concentrationsofcisplatin(mg/L)RelativeexpressionofCD44RelativeexpressionofNANOG00．66±0．020．43±0．1410．81±0．04?0．56±0．1220．86±0．02?0．81±0．16?41．04±0．10?1．10±0．17?

*P<0.05vs0 mg/L group.

討　　論

腫瘤干細(xì)胞學(xué)說認(rèn)為，CSCs是一組具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群，其侵襲能力和對細(xì)胞毒性藥物的耐受力明顯高于其它腫瘤細(xì)胞[5]。1997年，Bonnet等[6]在白血病患者血液中分離出腫瘤干細(xì)胞。實驗證實，在急性髓性白血病患者體內(nèi)，僅有表面標(biāo)記物CD34+CD38-的腫瘤細(xì)胞具有在免疫缺陷小鼠體內(nèi)形成轉(zhuǎn)移性白血病的能力,其它腫瘤細(xì)胞無法形成轉(zhuǎn)移瘤，提示在全部白血病細(xì)胞中，只有CD34+CD38-細(xì)胞亞群同時具備自我更新和分化成為其它譜系腫瘤細(xì)胞的能力。隨后，腫瘤干細(xì)胞的存在在乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌和肝癌等實體腫瘤中得到驗證[5]。Zhang等[7]利用單克隆抗體標(biāo)記細(xì)胞表面的CD44和CD117分子分選卵巢癌干細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)CD44+CD117+細(xì)胞較其它亞群細(xì)胞高表達(dá)NANOG、OCT-4等多能性基因，且與CD44-CD117-細(xì)胞相比具有更強(qiáng)的致瘤能力。

CD44家族成員包括CD44標(biāo)準(zhǔn)型(CD44s)及多種變異型，其氨基末端的球狀蛋白結(jié)合域包含一個具有錨定功能的模體，介導(dǎo)CD44分子與透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)等細(xì)胞外基質(zhì)成分以高親和力結(jié)合；其羧基末端胞質(zhì)尾區(qū)的模體可與胞內(nèi)蛋白伴侶的磷酸化位點結(jié)合，從而觸發(fā)下游的分子生物學(xué)反應(yīng)[8]。近來研究表明，CD44與卵巢癌不良預(yù)后相關(guān)，并有可能直接參與卵巢癌化療耐藥。在轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性腫瘤中，CD44陽性表達(dá)率高于原發(fā)性腫瘤，且CD44的表達(dá)水平與患者無瘤生存時間和總生存率顯著相關(guān)，CD44陽性的卵巢癌患者的無瘤生存期顯著低于陰性患者[9]。諸多證據(jù)表明，CD44在卵巢癌腫瘤干細(xì)胞高表達(dá)，是介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞生存、生長和種植性轉(zhuǎn)移的重要信號分子[2]。Du等[10]發(fā)現(xiàn)抗CD44的單克隆抗體A3D8可抑制卵巢癌SKOV3成球細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。

NANOG是維持胚胎干細(xì)胞自我更新和多向分化潛能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，正常情況下僅表達(dá)于早期胚胎和生殖干細(xì)胞，在完全分化的成體組織無表達(dá)[11]。NANOG分子的氨基端富含絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸，可被磷酸化修飾，其羧基端具有轉(zhuǎn)錄激活作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，NANOG在精原細(xì)胞瘤、乳腺癌、前列腺癌和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等惡性腫瘤中異常表達(dá)[12]。國外研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織中，NANOG在mRNA和蛋白水平均過表達(dá)，與腫瘤低分化顯著相關(guān)，這一結(jié)論與本研究結(jié)果一致；敲除NANOG基因能夠抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲；反之，NANOG過表達(dá)可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，NANOG過表達(dá)與化療耐藥和不良預(yù)后相關(guān)，是影響卵巢癌患者整體生存率和無瘤生存期的獨立預(yù)后因素[13]。

在乳腺癌MCF7細(xì)胞中，CD44與HA結(jié)合可激活蛋白激酶C，促進(jìn)NANOG表達(dá)上調(diào)及其下游信號分子絲氨酸磷酸化，抑制抑癌基因PCD4表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞成瘤能力，介導(dǎo)化療耐藥[14]。

Wiechert等[15]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子OCT-4高表達(dá)與膀胱癌化療耐藥及復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，經(jīng)順鉑處理后，膀胱癌TCCSUP及J82細(xì)胞中CD44和OCT-4的表達(dá)量同時出現(xiàn)上調(diào)。OCT-4與NANOG同屬胚胎干細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，Chiou等[16]研究指出，NANOG/OCT-4/SLUG三陽性的肺癌患者預(yù)后最差，反之，預(yù)后最好。Lu等[17]應(yīng)用GFP在卵巢癌A2780細(xì)胞中標(biāo)記NANOG后，發(fā)現(xiàn)GFP+細(xì)胞較GFP-細(xì)胞具有更強(qiáng)的順鉑耐藥性；經(jīng)順鉑處理后，GFP-細(xì)胞的熒光強(qiáng)度和NANOG表達(dá)量均有所增加，表明順鉑可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)干性基因。

本研究發(fā)現(xiàn)，CD44在早期、無浸潤轉(zhuǎn)移的卵巢癌組織中低表達(dá)，在晚期、有浸潤轉(zhuǎn)移的卵巢癌組織中高表達(dá)，NANOG在早期及中、高分化的卵巢癌組織中低表達(dá)，在晚期、低分化的卵巢癌組織中高表達(dá)，且二者的表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示隨著卵巢癌FIGO分期級別和惡性程度的增加，CD44和NANOG表達(dá)增加，且具有協(xié)同性；順鉑可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞CD44和NANOG表達(dá)上調(diào)。由此推測，卵巢癌的進(jìn)展過程伴隨HA-CD44介導(dǎo)的干性基因表達(dá)激活，化療亦可誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)，腫瘤干細(xì)胞借此參與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，CD44和NANOG參與EOC的發(fā)生和發(fā)展且與EOC不良預(yù)后有關(guān)。CSCs的產(chǎn)生及NANOG等干性基因表達(dá)與化療直接相關(guān)，并貫穿EOC的惡性演進(jìn)過程；因CD44與EOC浸潤、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為有關(guān)，HA-CD44信號通路可能介導(dǎo)NANOG的表達(dá)激活，將CD44分子作為分選卵巢癌CSCs的表面標(biāo)志物具有其內(nèi)在合理性。CD44聯(lián)合NANOG有望成為劃分EOC惡性程度和預(yù)后判斷的新指標(biāo)，亦有可能成為臨床治療的新靶標(biāo)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Garson K,Vanderhyden BC.Epithelial ovarian cancer stem cells:underlying complexity of a simple paradigm[J].Reproduction,2015,149 (2):R59-R70.

[2]Sacks JD，Barbolina MV.Expression and function of CD44 in epithelial ovarian carcinoma[J].Biomolecules,2015,5 (4):3051-3066.

[3]Z?ller M.CD44:can a cancer-initiating cell profit from an abundantly expressed molecule?[J].Nat Rev Cancer,2011,11 (4):254-267.

[4]Cavaleri F,Scholer HR.Nanog:a new recruit to the embryonic stem cell orchestra[J].Cell,2003,113 (5):551-552.

[5]Visvader JE,Lindeman GJ.Cancer stem cells in solid tumours:accumulating evidence and unresolved questions[J].Nat Rev Cancer,2008,10 (8):755-768.

[6]Bonnet D,Dick JE.Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive he-matopoietic cell[J].Nat Med,1997,3 (7):730-737.

[7]Zhang S,Balch C,Chan MW,et al.Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors[J].Cancer Res,2008,68 (11):4311-4320.

[8]Revelante N，Gilmartin M.Regulation of and regulation by CD44:a paradigm complex regulatory network[J].Int Trends Immun,2013,6(4)：43-58.

[9]Gao Y,Foster R,Yang X,et al.Up-regulation of CD44 in the development of metastasis,recurrence and drug resistance of ovarian cancer[J].Oncotarget,2015,6 (11):9313-9326.

[10] Du YR,Chen Y,Gao Y,et al.Effects and mechanisms of anti-CD44 monoclonal antibody A3D8 on proliferation and apoptosis of sphere-forming cells with stemness from human ovarian cancer[J].Int J Gynecol Cancer,2013,23 (8):136-1375.

[11] Loh YH,Wu Q,Chew JL,et al.The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells[J].Nat Genet,2006,38 (4):431-440.

[12] 周嘉嘉，陳汝福，鄧小耿，等.沉默NANOG表達(dá)對人肝癌細(xì)胞HepG2中cyclin D1表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響[J].中國病理生理雜志,2014,30 (2):245-249.

[13] Siu MK,Wong ES,Kong DS,et al.Stem cell transcription factor NANOG controls cell migration and invasion via dysregulation of E-cadherin and FoxJ1 and contributes to adverse clinical outcome in ovarian cancers[J].Oncogene,32 (30):3500-3509.

[14] Bourguignon LY,Spevak CC,Wong G,et al.Hyaluronan-CD44 interaction with protein kinase Cε promotes oncogenic signaling by the stem cell marker Nanog and the production of microRNA-21,leading to down-re-gulation of the tumor suppressor protein PDCD4,anti-apoptosis,and chemotherapy resistance in breast tumor cells[J].J Biol Chem,2009,284 (39):26533-26546.

[15] Wiechert A,Saygin C,Thiagarajan PS,et al.Cisplatin induces stemness in ovarian cancer[J].Oncotarget,2016,7 (21):30511-30522.

[16] Chiou SH,Wang ML,Chou YT,et al.Coexpression of Oct4 and Nanog enhances malignancy in lung adenocarcinoma by inducing cancer stem cell-like properties and epithelial-mesenchymal transdifferentiation[J].Cancer Res,2010,70 (24):10433-10444.

[17] Lu CS,Shieh GS,Wang CT,et al.Chemotherapeutics-induced Oct4 expression contributes to drug resistance and tumor recurrence in bladder cancer[J].Oncotarget,2017,8 (19):30844-30858.