miR-451通過靶向Psmb8抑制糖尿病腎病小鼠腎小球系膜細胞炎癥反應(yīng)*

姜文豪，孫　艷，彭　睿，彭惠民，張　政

(重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，重慶 400016)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是最嚴重的糖尿病并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因，約1/3的糖尿病患者會發(fā)展成為糖尿病腎病[1]。DN的發(fā)生涉及細胞外基質(zhì)堆積、腎小球肥大、腎臟基底膜增厚以及腎小球硬化等多種病理改變[2]，其分子發(fā)病機制較為復(fù)雜。新近研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)的高糖環(huán)境能夠誘發(fā)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，造成過量的免疫細胞產(chǎn)生及炎癥因子分泌，對DN的發(fā)生發(fā)展起到一定的促進作用[3-5]，但其具體機制仍不明確。

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類長度為21～23個核苷酸的單鏈小分子非編碼RNA片段，主要通過抑制蛋白質(zhì)翻譯及mRNA剪切的方式負調(diào)控靶基因。研究表明，miRNA在包括細胞分化、細胞凋亡、脂類代謝、發(fā)育以及激素分泌等多種生理過程中發(fā)揮作用，參與糖尿病腎病。本課題組前期芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組小鼠相比較，miR-451在糖尿病腎病小鼠腎臟組織內(nèi)表達異常[6]；且miR-451可通過Ywhaz/p38 MAPK信號途徑抑制DN系膜增生[7]，提示miR-451可能是一個重要的DN調(diào)節(jié)因子。然而，miR-451在DN炎癥中的具體作用如何目前未見相關(guān)報道。

本研究在前期肺癌細胞實驗發(fā)現(xiàn)miR-451可直接靶向一個炎癥相關(guān)基因——β型蛋白酶體亞基8(proteasome subunit β type 8，Psmb8)的基礎(chǔ)上[8]，應(yīng)用商品化miR-451 mimics和inhibitor分別轉(zhuǎn)染至高、低糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞(mesangial cells，MCs)，觀察細胞炎癥標志物的表達改變，同時檢測Psmb8在系膜細胞中的表達及其對炎癥相關(guān)標志物表達的影響，探索miR-451通過炎癥相關(guān)靶基因調(diào)控DN炎癥的機制。

材　料　和　方　法

1　主要材料與試劑

永生化腎小球系膜細胞株SV40-MES13(中國科學(xué)院細胞庫)；LipofectamineTM2000和Trizol(Invitrogen)；miR-451 mimics和miR-451 inhibitor及其陰性對照(negative control，NC)mimics NC 和inhibitor NC(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；高、低糖DMEM液體培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco)；BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；PVDF膜(Millipore)；兔抗白細胞介素(interleukin，IL)-18、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、Psmb8和GAPDH多克隆抗體(Abcam)；Psmb8 小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)和PCR引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ和PrimeScript? RT reagent Kit(大連寶生物工程有限公司)。

2　主要方法

2.1細胞培養(yǎng)為模擬正常及糖尿病狀態(tài)，分別用葡萄糖濃度為5.5 mmol/L和25 mmol/L、含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2濃度培養(yǎng)小鼠腎小球系膜細胞，分別為低葡萄糖(low-glucose MCs，L-MC)組和高葡萄糖(high-glucose MCs，H-MC)組，同時低葡萄糖組中加入19.5 mmol/L的甘露醇以維持等滲環(huán)境。當(dāng)細胞融合度達到80%時，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，800 r/min離心5 min，收集細胞進行傳代或凍存。

2.2設(shè)計合成 Psmb8 siRNA根據(jù)Ensembl數(shù)據(jù)庫中公布的小鼠Psmb8基因序列，應(yīng)用Oligo軟件設(shè)計3條siRNA，具體序列如下：No.1:5’-UUUGUUCAUCCUUAAGGAGCU-3’; No.2:5’-UUUCCUAAGACUGAAGUAGUC-3’; No.3:5’-AUUGUACUUAGAAGGUAUCUG-3’。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，其干擾效率通過qPCR檢測。

2.3細胞轉(zhuǎn)染及分組當(dāng)MCs達到對數(shù)生長期時，運用LipofectamineTM2000將miR-451 mimics及mi-mics NC分別轉(zhuǎn)染到高糖培養(yǎng)的MCs中(即H-MC miR-451組和H-MC miR-NC組),將miR-451 inhibitor及inhibitor NC分別轉(zhuǎn)染到低糖培養(yǎng)的MCs中(即L-MC anti-miR-451組和L-MC anti-miR-NC組)，將Psmb8 siRNA轉(zhuǎn)染到高糖培養(yǎng)的MCs中(即H-MC siPsmb8組)，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)6 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞。

2.4miR-451表達水平的檢測應(yīng)用qPCR法。待細胞融合度達到80%時，Trizol法裂解細胞提取總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄的體系為 5× gDNA Era-ser Buffer 2.0 μL、gDNA Eraser 1.0 μL和total RNA 1.0 μg，補加RNase-free dH2O至總體積為10 μL。將混合后的反應(yīng)液室溫靜止10 min后于冰上與1.0 μL PrimeScript RT Enzyme MixⅠ、1.0 μL miR-451特異的莖環(huán)引物、4.0 μL 5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)和4.0 μL RNase-free dH2O混合，在37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃ 15 min的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序下進行逆轉(zhuǎn)錄得cDNA。miR-451逆轉(zhuǎn)錄引物序列為5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA-CTG-3’。然后以cDNA為模板進行qPCR反應(yīng)，引物序列為5’-CCGAAACCGTTACCATTAC-3’(forward)和5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’(reverse)，其反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) (2×) 10 μL、 PCR forward primer (10 μmol/L) 0.5 μL、 PCR reverse primer (10 μmol/L) 0.5 μL、cDNA 2 μL和滅菌蒸餾水7 μL。將反應(yīng)液混合均勻后于CFX96TMReal-Time PCR儀完成qPCR反應(yīng)，其反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s； 95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，進行40個循環(huán)；95 ℃ 10 s、65 ℃ 5 s、95 ℃，每0.5 ℃進行熔解曲線分析。最后以U6為內(nèi)參照利用公式2-ΔΔCt計算miR-451的相對表達量。

2.5IL-18和TNF-α的mRNA表達檢測應(yīng)用qPCR檢測，操作步驟同前。TNF-α的上游引物序列為5’-CCCTCACACTCAGATCATCTTCT-3’，下游引物序列為5’-GCTACGACGTGGGCTACAG-3’； IL-18的上游引物序列為5’-GACTCTTGCGTCAACTTCAAGG-3’，下游引物序列為5’-CAGGCTGTCTTTTGTCAACGA-3’；內(nèi)參照β-actin的上游引物序列為5’-ATATCGCTGCGCTG GTCGTC-3’，下游引物序列為5’-AGGATGGCGTGAGGGAGAGC-3’。

2.6Western blot法檢測IL-18、TNF-α和Psmb8蛋白的相對表達水平將處于對數(shù)生長期的各組細胞收集于EP管中，加入適量蛋白裂解液裂解細胞，BCA法測定蛋白濃度，每組取50 g蛋白進行SDS-PAGE，電泳后應(yīng)用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上，分別加入兔抗IL-18、TNF-α、Psmb8和GAPDH多克隆抗體，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次后分別加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG和羊抗小鼠IgG，室溫孵育1 h，覆蓋ECL發(fā)光劑后于化學(xué)發(fā)光儀上攝取圖像。以GAPDH為內(nèi)參照進行校正，通過CM-2000B型生物醫(yī)學(xué)成像系統(tǒng)進行灰度分析。

3　統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組比較采用t檢驗，兩組以上進行比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

1　miR-451和Psmb8在高糖培養(yǎng)的系膜細胞中呈顯著低表達

qPCR檢測結(jié)果表明，H-MC組miR-451的表達水平明顯低于L-MC組(P<0.01)，提示miR-451可能與DN的發(fā)生相關(guān)，見圖1A。Western blot檢測結(jié)果顯示，H-MC組中Psmb8蛋白表達量與L-MC組相比較顯著升高(P<0.01)，提示Psmb8可能在DN中發(fā)揮作用，見圖1B。

Figure 1.The expression of miR-451 and Psmb8 protein in mouse mesangial cells under high-and low-glucose conditions.A:the expression of miR-451 was down-regulated in H-MC group compared with L-MC group； B:the protein expression of Psmb8 was increased in H-MC group compared with L-MC group.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsL-MC group.
圖1腎小球系膜細胞中miR-451及Psmb8的表達水平

2　高、低表達miR-451對炎癥標志物IL-18和TNF-α表達水平的影響

qPCR結(jié)果表明，IL-18和TNF-α的mRNA表達水平在H-MC miR-451組較H-MC組顯著降低(P<0.01)；L-MC anti-miR-451組較L-MC組IL-18和TNF-α的mRNA表達水平顯著升高(P<0.01)，見圖2A、B。Western blot檢測IL-18和TNF-α的蛋白表達水平結(jié)果與qPCR結(jié)果相一致，見圖2C。以上結(jié)果均提示miR-451對DN炎癥的發(fā)生具有抑制作用。

3　高、低表達miR-451對Psmb8蛋白表達水平的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，H-MC miR-451組Psmb8蛋白表達水平較H-MC和H-MC miR-NC組降低 (P<0.01)。同時，L-MC anti-miR-451組Psmb8蛋白表達水平較L-MC和L-MC anti-miR-NC組增高(P<0.01)，見圖3。結(jié)合前期螢光素酶檢測結(jié)果[8]，我們認為miR-451在DN可通過種子序列與Psmb8基因的3’UTR結(jié)合，從而靶向抑制Psmb8的表達。

4　沉默Psmb8對IL-18和TNF-α蛋白表達水平的影響

qPCR檢測結(jié)果顯示合成的3條Psmb8 siRNA中，與另外2條siRNA相比較，第2條siRNA對Psmb8 mRNA表達的干擾效率最高(P<0.01)，因此選擇該條siRNA用于后續(xù)實驗，見圖4A。Western blot檢測結(jié)果表明H-MC組IL-18和TNF-α蛋白相對表達水平較L-MC組明顯升高(P<0.01)，與高糖環(huán)境能夠誘導(dǎo)炎癥發(fā)生的結(jié)果相一致；H-MC siPsmb8組中IL-18和TNF-α蛋白相對表達水平較H-MC組顯著降低(P<0.01)，提示Psmb8可能參與DN炎癥的發(fā)生，見圖4B。

Figure 2.The effect of miR-451 on inflammatory markers IL-18 and TNF-α in mouse mesangial cells.A and B:the mRNA expression of IL-18 and TNF-α detected by qPCR； C:the protein expression of IL-18 and TNF-α detected by Western blot.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsL-MC anti-miR-451 group;△△P<0.01vsH-MC miR-451 group.
圖2腎小球系膜細胞中高低表達miR-451對炎癥標記物IL-18和TNF-α的影響

討　　論

當(dāng)機體中存在血管系統(tǒng)的活體組織對損傷因子產(chǎn)生防御性反應(yīng)時誘發(fā)炎癥，該過程大多數(shù)情況下是機體清除有害物質(zhì)的自我保護過程，但有時會對機體造成一定的損傷[9]。已有充分的證據(jù)表明miRNA對炎癥及其相關(guān)反應(yīng)的發(fā)生具有一定的影響。miRNA與潰瘍性結(jié)腸炎[10]、幽門螺桿菌感染[11]和病毒性肝炎[12]等炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展有著極為密切的聯(lián)系。有研究顯示miR-21可作為DN診斷的標志物[13]。但miRNA在糖尿病腎病炎癥中的作用，目前未見明確報道。

本實驗以課題組前期芯片篩查DN相關(guān)miRNA結(jié)果為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)在糖尿病腎病小鼠腎臟組織表達異常的miR-451。qPCR結(jié)果顯示miR-451在高糖培養(yǎng)的系膜細胞中較低糖組顯著下降，提示它可能在DN中發(fā)揮作用。實驗表明高糖培養(yǎng)的系膜細胞較低糖培養(yǎng)的系膜細胞炎癥標志物IL-18和TNF-α顯著升高，明確高糖環(huán)境能夠誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生。在高糖培養(yǎng)的系膜細胞中高表達miR-451，IL-18和TNF-α表達均下降，而在低糖培養(yǎng)的系膜細胞中沉默miR-451后，IL-18和TNF-α表達水平顯著增高，提示miR-451對DN系膜細胞炎癥發(fā)生具有調(diào)控作用。然而，miR-451在DN炎癥中的作用究竟如何，需要我們進一步研究。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Psmb8的3’UTR存在與miR-451 5’端第2～8個堿基(即“種子序列”)完全互補的堿基位點，且該序列在包括小鼠、大象、黑猩猩和牛等多種物種中高度保守，同時通過雙螢光素報告基因?qū)嶒炞C明了Psmb8是miR-451的直接靶基因[8]。Psmb8是位于人類6號染色體短臂、含有6個外顯子區(qū)域、長度為4 219 bp的編碼基因，其編碼蛋白能夠與Psmb9和Psmb10共同構(gòu)成由4個七聚體層疊形成的空心圓柱樣免疫蛋白酶體[14]。免疫蛋白酶體能夠降解甲基化的炎癥核心調(diào)控因子核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的抑制蛋白IκB，使處于抑制狀態(tài)NF-κB活化，啟動細胞核內(nèi)相應(yīng)炎癥相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)[15]。本課題組前期實驗[3,5]已經(jīng)證明高糖環(huán)境下，MCs中經(jīng)免疫蛋白酶體活化的NF-κB能夠誘導(dǎo)包括IL-18和TNF-α等在內(nèi)的炎癥相關(guān)因子基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生，表明Psmb8能夠通過構(gòu)成的免疫蛋白酶體而活化NF-κB，促進DN炎癥的發(fā)生與發(fā)展。在對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究中發(fā)現(xiàn)，對Psmb8的特異性抑制能夠減少炎癥因子的分泌，從而延緩炎癥的發(fā)生[16]；Koerner等[17]研究發(fā)現(xiàn)Psmb8參與的炎癥反應(yīng)與結(jié)腸直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。以上結(jié)果提示Psmb8與DN炎癥的發(fā)生密切相關(guān)，且miR-451可靶向調(diào)控Psmb8的表達，因此Psmb8受到我們的關(guān)注。本實驗發(fā)現(xiàn)在高糖環(huán)境下，MCs中Psmb8表達明顯升高，且沉默Psmb8的表達可顯著抑制炎癥相關(guān)因子IL-18和TNF-α的表達，提示Psmb8可能參與DN炎癥過程。同時，Western blot檢測結(jié)果顯示，在高糖培養(yǎng)的系膜細胞中高表達miR-451后，Psmb8表達水平下降；反之，在低糖培養(yǎng)的系膜細胞中沉默miR-451后，Psmb8表達水平則增高。以上結(jié)果提示miR-451對DN系膜細胞炎癥發(fā)生具有調(diào)控作用，且該作用可能通過靶向Psmb8得以實現(xiàn)，從而參與DN的發(fā)生、發(fā)展。

Figure 3.The effect of miR-451 on the expression of Psmb8 in the mouse mesangial cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsL-MC anti-miR-451 group;△△P<0.01vsH-MC miR-451 group.
圖3腎小球系膜細胞中高、低表達miR-451對Psmb8蛋白表達的影響

Figure 4.The effect of Psmb8 on the protein expression of IL-18 and TNF-α in mouse mesangial cells.A:the efficiency of siPsmb8 in H-MC siRNA-2 group was the highest when compared with that in H-MC siRNA-1 and H-MC siRNA-3 groups； B:the protein expression levels of IL-18 and TNF-α were increased in H-MC group compared with L-MC group,while those were decreased whenPsmb8 was silenced in H-MC siPsmb8 group compared with H-MC group.Mean±SD.n=3.▲▲P<0.01vsH-MC siRNA-2 group;**P<0.01vsL-MC group;△△P<0.01vsH-MC group.
圖4腎小球系膜細胞中低表達Psmb8對IL-18和TNF-α蛋白表達的影響

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