2型糖尿病大鼠心功能變化及RAGE表達(dá)增強(qiáng)和鈣調(diào)控異常*

練飛鴻，饒　芳，鄺素娟，陳肖燕，楊　慧，吳飛龍，張夢(mèng)珍，麥麗萍，林秋雄，單志新，楊　敏，鄧春玉1,△

(1華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2廣東省心血管病研究所，廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究部，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東 廣州 510080)

糖尿病的發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)呈逐年上升的狀態(tài)。我國糖尿病的發(fā)病人數(shù)高達(dá)9 240萬人，另有約1億4 820萬的成年人處于糖尿病前期狀態(tài)[1]。糖尿病患者的長期高血糖狀態(tài)使得身體各組織和器官都受到嚴(yán)重影響，糖尿病是冠心病、房顫和心力衰竭等心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素[2]，使患者死亡率明顯增高。

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病患者的一種獨(dú)特的心肌病，表現(xiàn)為與高血壓、冠心病、瓣膜病和先天性心臟病無關(guān)的心室功能不全。其突出的病理變?yōu)樾募〖?xì)胞肥大、間質(zhì)纖維化及收縮和舒張功能不全。目前關(guān)于糖尿病是如何導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大，進(jìn)而進(jìn)展為糖尿病心肌病的機(jī)制研究，包括晚期糖基化終末期產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)增加，血管周圍和肌纖維間的纖維化、炎癥反應(yīng)增強(qiáng)、自噬和細(xì)胞凋亡的增加、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的激活、脂質(zhì)的堆積、鈣調(diào)控紊亂、線粒體功能異常、胰島素抵抗和氧化應(yīng)激的增強(qiáng)等等[3-4]。在一系列研究中都能反復(fù)觀察到糖尿病可以影響嚙齒類動(dòng)物模型心臟的電復(fù)蘇，具體表現(xiàn)為心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位延長和QT間期延長等電生理改變[5-6]。這普遍被認(rèn)為是心肌細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)控異常和興奮收縮偶聯(lián)異常所致。因此，進(jìn)一步明確心肌細(xì)胞對(duì)高血糖狀態(tài)的復(fù)雜的電生理適應(yīng)機(jī)制，對(duì)了解糖尿病是如何導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大的有著重要意義。

本研究將以自發(fā)性2型糖尿病大鼠作為2型糖尿病模型，探討糖尿病引起的鈣調(diào)控紊亂對(duì)心肌細(xì)胞肥大的影響。

材　料　和　方　法

1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)環(huán)境

SPF級(jí)，7周齡雄性Zucker糖尿病肥胖(Zucker diabetic fatty，ZDF；fa/fa)大鼠和Zucker lean (ZL；fa/+)大鼠各15只購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(高)2012-0001，飼養(yǎng)于中山大學(xué)北校區(qū)動(dòng)物中心，恒溫(22±2) ℃，恒濕(55±5)%，人工光照明暗各12 h/d，噪聲<50 dB，24 h自由取食和飲水。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查(No.GDREC201208A)。

2　試劑與儀器

抗β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain，β-MHC)、心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)和GAPDH抗體(Cell Signaling Technology)；抗CaV1.2抗體(Alomone Labs)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Invitrogen)；封閉牛奶和loading buffer(Bio-Rad)；PVDF膜(Millipore)；麥胚凝集素(wheat germ agglutinin，WGA)瓊脂糖(Vector Laboratories); Advatage血糖儀和血糖試紙(Roche)。Vevo 2100彩色多普勒小動(dòng)物超聲診斷儀(Visual Sonic)。

3　主要方法

3.12型糖尿病動(dòng)物模型的建立按不同的基因型分為2組，ZDF組大鼠共15只予以Purina 5008飼料(蛋白質(zhì)23.75%、總脂肪7.55%、粗纖維4.00%和消化能14.6 kJ/kg)喂養(yǎng)作為模型組；ZL大鼠予以普通飼料喂養(yǎng)作為對(duì)照組。大鼠飼養(yǎng)1周后，使用羅氏血糖檢測試紙和血糖儀，通過尾靜脈采血法定期對(duì)2組大鼠進(jìn)行血糖的測量，利用電子天平測量大鼠的體重值。之后分別在9、10、12、14、16、18和22周齡對(duì)2組大鼠的血糖和體重進(jìn)行測量。

3.2大鼠心功能的測定在ZDF大鼠18周齡時(shí)進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測。大鼠取左側(cè)臥位，使用異氟烷麻醉同時(shí)持續(xù)低流量給氧，使其保持輕度鎮(zhèn)靜狀態(tài)(異氟烷濃度為3.0%，氧流量為1 L/min)。選用21 MHz高頻探頭，換取胸骨旁短軸左心室乳頭肌水平切面圖像，記錄3個(gè)完整心動(dòng)周期的二維圖像。每只大鼠各取3個(gè)心動(dòng)周期的平均數(shù)值為其所得的檢測值。檢測指標(biāo)包括左室前壁舒張末期厚度(left ventricular end-diastolic anterior wall thickness，LVAWd)、左室前壁收縮末期厚度(left ventricular end-systolic anterior wall thickness，LVAWs)、左室后壁舒張末期厚度(left ventricular end-diastolic posterior wall thickness，LVPWd)、左室后壁收縮末期厚度(left ventricular end-systolic posterior wall thickness，LVPWs)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic internal dimension，LVIDs)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic internal dimension，LVIDd)、左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)、左室舒張期容積(left ventricular diastolic volume，LVd)和左室收縮期容積(left ventricular systolic volume，LVs)。

3.3心臟組織WGA染色和細(xì)胞表面積計(jì)算采用頸椎脫臼法處死大鼠，后取心室組織用PBS沖洗，4%甲醛固定24 h，脫水石蠟包埋切片。常規(guī)脫蠟水合，室溫下用PBS孵育水化后滴加胰酶工作液50 μL，37 ℃濕盒孵育15 min，PBS漂洗終止消化，滴加WGA-AF488工作液(1∶100稀釋)，避光孵育2 h，PBS漂洗和封固劑封片，光學(xué)顯微鏡下拍照。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件以400倍標(biāo)尺為標(biāo)準(zhǔn)，選取合適的視野，測量出視野內(nèi)組織的面積及總細(xì)胞核的總數(shù)，得出單個(gè)細(xì)胞面積(mm2)=組織面積(mm2)/細(xì)胞核總數(shù)。

3.4Western blot 檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)量的變化用研磨棒對(duì)心肌組織研磨、離心、去沉淀后，使用含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液提取心肌細(xì)胞的總蛋白，利用BCA法測定蛋白濃度。將各樣品配至終濃度為1 g/L，加入4×SDS上樣緩沖液，沸水水浴10 min，使蛋白質(zhì)變性。SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉常溫緩慢搖蕩1 h封閉。將NC膜放入雜交袋中，加入足量稀釋的 I 抗，置于4 ℃搖床孵育過夜；TBST洗膜，常溫下3次，每次10 min。根據(jù) I 抗來源選擇合適 II 抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠和抗兔的 II 抗)，以1∶1 000比例稀釋于5% 脫脂奶粉中，常溫輕搖1 h；TBST洗膜，常溫下3次，每次10 min。用ECL試劑盒顯影蛋白條帶，ImageJ圖像分析軟件定量分析目的蛋白及內(nèi)參照β-actin的灰度值，算出比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)方式表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行2組間比較，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1　2型糖尿病大鼠模型建立

將7周齡ZL和ZDF大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，ZDF大鼠改為Purina 5008飼料喂養(yǎng)。在10周齡后，ZDF組大鼠血糖和體重均顯著高于ZL組(P<0.01)。

2　超聲心動(dòng)圖檢測ZDF大鼠心功能的變化

M型超聲心動(dòng)圖檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2組大鼠的心臟結(jié)構(gòu)和心功能均存在顯著差異，見圖1。與ZL大鼠相比，ZDF大鼠的LVAWd、LVAWs、LVPWd和LVPWs顯著增加(P<0.05或P<0.01)，而LVIDs和LVIDd與對(duì)照組相比明顯縮小(P<0.05)，提示左心室肥厚。在心功能方面，ZDF大鼠的LVEF和LVFS顯著升高(P<0.05)，提示ZDF組大鼠出現(xiàn)心功能代償性增強(qiáng)現(xiàn)象，見表1。

Figure 1.The images of M-mode echocardiography for the 18-week-old ZDF and ZL rats.
圖118周齡ZDF大鼠與ZL大鼠的M型超聲心動(dòng)圖譜

表118周齡ZDF大鼠心臟功能的變化
Table 1.Echocardiographic parameters obtained from the 18-week-old ZDF and ZL rats (Mean±SD.n=15)

IndexZLZDFLVAWd(mm)1．54±0．172．11±0．26?LVAWs(mm)2．22±0．203．14±0．28?LVIDd(mm)8．09±0．887．13±0．49?LVIDs(mm)5．65±0．774．44±0．50?LVd(μL)334．27±52．43268．10±41．66?LVs(μL)157．25±33．4091．20±24．87?LVEF(%)55．73±5．4766．34±5．09?LVFS(%)32．26±3．5138．76±2．37?LVPWd(mm)1．74±0．322．15±0．32??LVPWs(mm)2．42±0．313．02±0．29?

*P<0.05,**P<0.01vsZL group.

3　ZDF大鼠左心室心肌細(xì)胞表面積明顯增加

WGA染色結(jié)果顯示，ZDF大鼠與ZL大鼠相比，心肌細(xì)胞表面積明顯增加(P<0.05)，提示出現(xiàn)心肌細(xì)胞肥厚，見圖2。

4　ZDF大鼠心肌細(xì)胞肥大相關(guān)蛋白β-MHC和ANP表達(dá)的變化

利用Western blot檢測心肌細(xì)胞肥大相關(guān)標(biāo)志蛋白β-MHC和ANP。結(jié)果顯示，與對(duì)照組ZL大鼠相比，ZDF大鼠心臟組織中的β-MHC和ANP的蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，見圖3。

5　ZDF大鼠RAGE以及鈣調(diào)控相關(guān)蛋白CaV1.2和Orai1表達(dá)的變化

ZDF組大鼠的RAGE表達(dá)與對(duì)照組相比明顯升高(P<0.05)，見圖4。在有關(guān)維持鈣穩(wěn)態(tài)的鈣離子通道表達(dá)上，與對(duì)照組大鼠相比，ZDF 組的CaV1.2表達(dá)下降，Orai1表達(dá)升高(P<0.05)，見圖5。

Figure 2.Immunofluorescence staining (WGA staining) showed the size of cardiomyocytes in the left ventricle of 18-week-old ZL and ZDF rats (×400).Mean±SD.n=6.*P<0.05vsZL group.
圖2WGA染色顯示ZDF大鼠左心室肌細(xì)胞表面積增大

Figure 3.The protein expression of β-MHC and ANP in the ZDF rats.Mean±SD.n=6.*P<0.05vsZL group.
圖3ZDF大鼠β-MHC和ANP蛋白的表達(dá)量增加

Figure 4.The protein expression of RAGE in the ZDF rats.Mean±SD.n=6.*P<0.05vsZL group.
圖4ZDF大鼠RAGE蛋白的表達(dá)增加

討　　論

1　2型糖尿病模型的建立及心功能的變化

良好的糖尿病動(dòng)物模型能夠更好地模擬疾病在人體的發(fā)生發(fā)展過程。ZDF大鼠是由遺傳性肥胖基因突變導(dǎo)致胰島素抵抗、進(jìn)一步引起葡萄糖耐量受損的2型糖尿病模型，其特征為肥胖、高血糖、高脂血癥、高胰島素血癥和胰島素抵抗等[7-8]，與人類2型糖尿病發(fā)病情況非常相似。此外，在ZDF大鼠中與疾病相關(guān)的預(yù)測蛋白酶活性與人類心血管疾病的預(yù)測活動(dòng)有較高的相似性[9]。所以ZDF大鼠是目前用于研究2型糖尿病及相關(guān)心血管疾病并發(fā)癥的理想模型。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到ZDF大鼠在經(jīng)過Purina 5008飼料飼養(yǎng)后，在10周齡出現(xiàn)了隨機(jī)血糖顯著升高，提示ZDF組大鼠出現(xiàn)了2型糖尿病。此外，在18周齡時(shí)超聲心動(dòng)圖顯示ZDF組大鼠的左室前壁和后壁均出現(xiàn)明顯肥厚，心室腔縮小，其FS與EF值代償性增高。WGA染色顯示模型組大鼠的心室肌細(xì)胞普遍肥大，且心肌組織中的ANP和β-MHC蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。上述結(jié)果顯示，在長期持續(xù)的高血糖狀態(tài)刺激下，ZDF鼠出現(xiàn)心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)和舒張功能障礙，這種情況與臨床上的射血分?jǐn)?shù)保留的糖尿病病人的心功能改變相似。

Figure 5.The protein expression of CaV1.2 and Orai1 in the ZDF rats.Mean±SD.n=6.*P<0.05vsZL group.
圖5ZDF大鼠CaV1.2和Orai1蛋白表達(dá)的變化

2　AGEs參與了2型糖尿病導(dǎo)致細(xì)胞肥大的過程

晚期糖基化終末產(chǎn)物是過量的糖和蛋白質(zhì)結(jié)合的產(chǎn)物，糖尿病狀態(tài)下過量的糖和蛋白質(zhì)在體內(nèi)合成AGEs，AGEs可與人體各種組織蛋白相結(jié)合并破壞這些組織蛋白，使組織膠原降解的能力受損，從而增加纖維化，最終導(dǎo)致心肌僵硬度增加和心臟舒張功能受損[10]。AGEs也通過與RAGE結(jié)合發(fā)揮其活性。糖尿病患者心臟組織中，AGEs和RAGE增加，可激活核因子κB信號(hào)通路，使β-MHC表達(dá)增加[11]，進(jìn)而引起心肌細(xì)胞肥厚。我們的實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)，ZDF組大鼠的RAGE表達(dá)較對(duì)照組相比顯著增加，同時(shí)其肥大相關(guān)標(biāo)志物β-MHC和ANP亦顯著增加，且ZDF大鼠的心室明顯肥厚，并出現(xiàn)舒張功能不全和心功能代償性增強(qiáng)。因此，糖尿病狀態(tài)下AGEs/RAGE軸增強(qiáng)可能參與了心肌細(xì)胞肥大，進(jìn)而導(dǎo)致DCM。

3　糖尿病導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+調(diào)控紊亂可能是心肌肥厚的重要因素

心肌細(xì)胞的鈣調(diào)控過程是細(xì)胞的興奮收縮偶聯(lián)過程中細(xì)胞內(nèi)鈣離子的波動(dòng)。當(dāng)心肌細(xì)胞興奮時(shí)，心肌L-型鈣通道介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，激活肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+的釋放，引起心肌細(xì)胞收縮；細(xì)胞舒張時(shí)，是由細(xì)胞膜鈣泵和鈉鈣轉(zhuǎn)運(yùn)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上鈣泵將胞質(zhì)內(nèi)鈣離子排出，這是經(jīng)典的鈣調(diào)控過程。有研究發(fā)現(xiàn)，高血糖可使心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位延長，并隨著時(shí)間的推移逐漸出現(xiàn)心功能不全。而高血糖對(duì)心肌細(xì)胞鈣調(diào)控的干擾可能是導(dǎo)致心肌細(xì)胞動(dòng)作電位延長的重要原因。另有研究顯示持續(xù)高血糖可通過減少鈣離子從L型鈣通道的流入、影響肌質(zhì)網(wǎng)鈣離子的釋放、減慢鈣再攝取的速度、使鈣外流增加，從而改變心肌細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)[12]。我們對(duì)2組大鼠心室組織的L型鈣通道蛋白表達(dá)檢測也發(fā)現(xiàn)，ZDF組大鼠的CaV1.2的蛋白表達(dá)是顯著下降的。這與Meo等[13]在利用鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿小鼠模型上檢測到心肌細(xì)胞L型鈣電流減少的結(jié)果相一致。除了傳統(tǒng)的L型鈣通道以外，目前普遍認(rèn)為Oria1介導(dǎo)的鈣庫操縱性鈣通道也參與了心肌細(xì)胞的鈣調(diào)控。在糖尿病模型中，不管是心肌細(xì)胞還是平滑肌細(xì)胞的Orai1表達(dá)都是升高的[14-15]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，ZDF組大鼠心肌細(xì)胞的Orai1表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組是明顯升高的。Orai1的表達(dá)增高可介導(dǎo)SOCE通道的鈣電流內(nèi)流增加從而參與心肌細(xì)胞的鈣調(diào)控，而這可能是由于高血糖通過激活鈣調(diào)磷酸酶/NFATc3信號(hào)通路的結(jié)果[15]。在L型鈣通道鈣內(nèi)流減少的情況下，細(xì)胞內(nèi)鈣依然存在著鈣超載的表現(xiàn)，除了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵作用的減弱以外，經(jīng)Oria1介導(dǎo)的SOCE通道的鈣離子內(nèi)流增加可能起著重要的作用。這或許是細(xì)胞的一個(gè)代償性機(jī)制，但其引起的鈣超載或許進(jìn)一步導(dǎo)致了細(xì)胞肥大相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而促進(jìn)心肌的肥厚的發(fā)生。

高血糖導(dǎo)致心功能改變和心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制很復(fù)雜，鈣調(diào)控紊亂和AGEs/RAGE軸的增強(qiáng)無疑起著重要作用，與其它影響因素之間相互又存在著關(guān)聯(lián)作用，進(jìn)一步導(dǎo)致了糖尿病心肌病的形成。而進(jìn)一步的研究有助于闡明這些機(jī)制形成和發(fā)展，理清其上下游的關(guān)系是保護(hù)糖尿病心臟的一個(gè)不可或缺的環(huán)節(jié)。

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