血管緊張素II 1型受體自身抗體通過上調(diào)自噬誘導(dǎo)INS-1胰島β細(xì)胞凋亡*

李　丹，王　瑾，何金玲，馮艷金，曹竹杰，焦向英

(山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，山西 太原 030001)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一組以慢性血糖水平增高為特征的代謝性疾病，目前已成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一[1]。糖尿病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，受多種因素影響，其中胰島β細(xì)胞凋亡增加是糖尿病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素[2-4]。

有研究表明，糖尿病大鼠胰腺組織局部腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin aldosterone system，RAAS)的激活，特別是血管緊張素II 1型受體(angiotensin II 1 type receptor，AT1R)的激活，會(huì)誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡[5]。大量糖尿病臨床資料的篩查發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者血清中可檢測(cè)到血管緊張素 II 1型受體自身抗體(angiotensin II type 1 receptor autoantibody，AT1-AA)的存在[6]，該抗體首次在1999年被Wallukat 等[7]人發(fā)現(xiàn)存在于子癇前期孕婦血清中，之后的研究表明，AT1-AA可以激活A(yù)T1R進(jìn)而發(fā)揮類血管緊張素Ⅱ(angiotesin Ⅱ，Ang Ⅱ)的作用[8]。然而，存在于糖尿病病人血清中的AT1-AA是否會(huì)誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞的凋亡，尚不清楚。

作為程序性死亡的2種方式，自噬和凋亡的相互作用受到人們的廣泛關(guān)注。一方面，自噬可以清除降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器和不需要的生物大分子來維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[9]，另一方面，自噬的過度激活可促進(jìn)凋亡的發(fā)生，而造成額外損傷[10]。但是，AT1-AA對(duì)胰島β細(xì)胞的自噬有何影響，是否參與了其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響尚不清楚。因此，本研究旨在探究AT1-AA能否引起胰島β細(xì)胞的凋亡，自噬是否參與其中以及其所發(fā)揮的作用，為糖尿病的防治提供新的切入點(diǎn)。

材　料　和　方　法

1　主要試劑與儀器

INS-1細(xì)胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所-協(xié)和細(xì)胞庫)；RPMI-1640培養(yǎng)基(HyClone)；Mab TrapTMKit(GE Healthcare)；抗LC3抗體和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA；Sigma)；抗beclin 1抗體(Abcam)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗(中杉金橋)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；CCK-8檢測(cè)試劑盒(博士德生物)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物有限公司)；Hoechst 33258 (碧云天)。酶標(biāo)儀 (Molecular Devices)。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1INS-1細(xì)胞培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)用含12%胎牛血清、1×105U/L青霉素和0.1 g/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞長至視野范圍內(nèi)70%～80%進(jìn)行傳代。

2.2AT1-AA的分離純化用生物合成的血管緊張素1型受體胞外第2環(huán)的抗原肽段AT1R-ECII(序列為：165～191，IHRNVFFIENTNITVCAFHYESQNSTL)主動(dòng)免疫大鼠8周后，利用IgGs親和純化試劑盒(Mab TrapTMKit)對(duì)AT1-AA陽性的免疫組及陰性的溶劑對(duì)照組大鼠血清分別進(jìn)行提純，行SDS-PAGE檢測(cè)抗體純度。

2.3細(xì)胞免疫熒光6孔板內(nèi)放置細(xì)胞爬片后將細(xì)胞懸液輕輕滴在爬片上，培養(yǎng)24 h后取出6孔板，吸出培養(yǎng)基，PBS清洗3次，每次5 min；4%多聚甲醛室溫固定15 min；除去固定劑，PBS清洗3次；0.05% Triton X-100室溫通透1 min，PBS清洗3次后滴加正常山羊血清，室溫封閉1 h；吸出封閉液，滴加1 mL稀釋好的AT1-AA及抗AT1R抗體，4 ℃過夜；次日PBS清洗3次，吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的Alexa Fluor 594 標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG和FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，濕盒中孵育1 h；PBS清洗3次后在爬片中央滴加1滴DAPI，蓋上蓋玻片。避光孵育5 min后熒光顯微鏡下采集圖像。

2.4細(xì)胞存活率的檢測(cè)收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，每孔100 μL接種于96孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后分別加入濃度梯度為10-8、10-7、10-6和10-5mol/L的 AT1-AA或陰性(negative)IgG(每孔10 μL)孵育24 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h，在450 nm處測(cè)定吸光度(A)值，然后計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白對(duì)照組)/(A對(duì)照組-A空白對(duì)照組)×100%。

2.5Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LC3、beclin 1、caspase-3以及 cleaved caspase-3的蛋白水平Western blot實(shí)驗(yàn)分兩部分處理細(xì)胞：①將INS-1細(xì)胞與10-6mol/L AT1-AA分別孵育0 h、6 h、12 h、24 h和36 h后收集細(xì)胞；②先用替米沙坦(20 μmol/L)或3-MA(10 mmol/L)處理細(xì)胞1 h，再用10-6mol/L AT1-AA處理細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞。收集的細(xì)胞加入80 μL RIPA裂解液裂解之后，用超聲細(xì)胞破碎機(jī)進(jìn)一步破碎，4 ℃、12 000 r/min離心15 min后提取上清。BCA法測(cè)蛋白濃度。選擇30 μg蛋白上樣量進(jìn)行SDS-PAGE，15 V、15 min將蛋白轉(zhuǎn)致PVDF膜后用5%脫脂奶粉封閉2 h，孵育 I 抗4 ℃過夜，次日TBST洗膜3次后孵育 II 抗，2 h后用SuperECL Plus(北京普利萊)超敏發(fā)光液曝光。曝光所得條帶用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析。

2.6流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞的分組處理同Western blot。用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞后，5 mL PBS洗滌細(xì)胞2次(1 000 r/min 離心 5 min)，再加入2 mL PBS，用手輕輕彈起細(xì)胞使之成為細(xì)胞懸液，用濾過膜將懸液過濾至流式管中，800 r/min離心5 min后加入200 μL Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC后，加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)混勻。室溫、避光反應(yīng)15 min后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞量/總細(xì)胞量×100%。

2.7Hoechst 33258染色將細(xì)胞懸液每孔1 mL 接種于6孔板內(nèi)，細(xì)胞貼壁后用5 mmol/L的3-MA預(yù)處理1 h后加入10-6mol/L AT1-AA繼續(xù)孵育24 h。PBS清洗2次后每孔加入1 mL Hoechst 33258染色劑，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中反應(yīng)30 min，吸出孔板內(nèi)的染色劑，用PBS洗滌2次后沿孔板側(cè)壁每孔加入1 mL PBS，置于熒光倒置顯微鏡(Olympus，IX51)下觀察并保存圖像。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)或Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1　陽性血清提純的AT1-AA可以特異性地結(jié)合于AT1R

細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，AT1-AA在細(xì)胞膜表面呈現(xiàn)紅色熒光，與AT1R(綠色熒光)的細(xì)胞定位結(jié)果一致，而陰性IgG對(duì)照組未觀察到細(xì)胞膜上有紅色熒光。說明陽性血清提純的AT1-AA為膜抗體，可特異性地結(jié)合于AT1R，見圖1。

Figure 1.AT1-AA binds to the AT1R specifically (×400).
圖1AT1-AA特異性結(jié)合于AT1R

2　AT1-AA可降低INS-1細(xì)胞的存活率

CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率結(jié)果顯示，與陰性IgG對(duì)照組相比，AT1-AA孵育后的細(xì)胞存活率隨濃度的升高而逐漸降低，當(dāng)AT1-AA濃度為10-6和10-5mol/L時(shí)存活率顯著降低(P<0.05)，我們選用10-6mol/L作為后期實(shí)驗(yàn)的處理濃度，見圖2。

Figure 2.The changes of the viability in the INS-1 cells induced by AT1-AA.Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsnegative-IgG group.
圖2AT1-AA對(duì)INS-1細(xì)胞存活率的影響

3　AT1-AA可誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞凋亡，且可被AT1R拮抗劑所阻滯

AT1-AA處理細(xì)胞不同時(shí)間后用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡水平，結(jié)果顯示與陰性IgG對(duì)照組相比，AT1-AA處理12 h后，細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，24 h達(dá)到峰值(P<0.01)，36 h仍高于對(duì)照組(P<0.01)。用20 μmol/L替米沙坦預(yù)處理細(xì)胞之后再給予AT1-AA共孵育24 h，Western blot結(jié)果顯示AT1-AA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)(caspase-3的活化)可被其阻滯，見圖3。

4　AT1-AA可引起INS-1細(xì)胞自噬水平升高，該效應(yīng)可被AT1R拮抗劑所阻斷

用10-6mol/L的AT1-AA分別孵育INS-1細(xì)胞6 h、12 h、24 h和36 h后，用Western blot法檢測(cè)LC3和beclin 1的蛋白水平。結(jié)果顯示，AT1-AA孵育6 h后，相對(duì)于陰性IgG組，LC3蛋白活化水平開始升高(P<0.05)，12 h繼續(xù)升高(P<0.01)，24 h持續(xù)升高到36 h(P<0.01)。Beclin 1 的蛋白水平也隨AT1-AA處理時(shí)間的延長而逐漸升高(P<0.01)。

Figure 3.The apoptosis of INS-1 cells induced by AT1-AA.A:the apoptosis rate of INS-1 cells induced by AT1-AA was analyzed by flow cytometry； B:the antagonistic effect of telmisartan was detected by Western blot.Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsnegative-IgG group；#P<0.05vsAT1-AA group.
圖3AT1-AA誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞凋亡，該效應(yīng)可以被替米沙坦所阻斷

LC3和beclin 1均為自噬的指示性蛋白，以上結(jié)果表明，AT1-AA可引起INS-1細(xì)胞自噬水平升高。用20 μmol/L替米沙坦預(yù)處理細(xì)胞之后再給予AT1-AA共孵育24 h，Western blot結(jié)果顯示AT1-AA誘導(dǎo)細(xì)胞自噬升高的效應(yīng)被其阻滯，見圖4。

5　加入自噬抑制劑3-MA預(yù)處理可以明顯改善AT1-AA誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡

用10 mmol/L 3-MA預(yù)處理細(xì)胞1 h后，再給予10-6mol/L AT1-AA孵育細(xì)胞24 h,分別用流式細(xì)胞術(shù)、Western blot以及Hoechst 33258染色檢測(cè)細(xì)胞的凋亡水平。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，與AT1-AA組相比，3-MA預(yù)處理之后，細(xì)胞凋亡比率明顯下降(P<0.01)。Western blot檢測(cè)到3-MA預(yù)處理后，cleaved caspase-3/caspase-3 比值下調(diào)(P<0.01)。除此之外，Hoechst 33258染色也表明，3-MA+AT1-AA組致密濃染的凋亡細(xì)胞明顯減少(P<0.01)，見圖5。

6　加入自噬抑制劑3-MA預(yù)處理可以明顯升高AT1-AA誘導(dǎo)的細(xì)胞存活率

用10 mmol/L 3-MA預(yù)處理細(xì)胞1 h后，再給予不同濃度AT1-AA孵育細(xì)胞24 h后檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，與單獨(dú)AT1-AA處理組相比，3-MA預(yù)處理后，細(xì)胞存活率明顯升高(P<0.05)，見圖6。

討　　論

糖尿病是由遺傳因素、免疫功能紊亂、微生物感染及其毒素、自由基、精神因素等各種致病因子作用于機(jī)體導(dǎo)致的一組代謝紊亂綜合征[11]，其發(fā)病機(jī)制主要是胰島β細(xì)胞功能障礙和(或)數(shù)目的減少[12]。

RAAS是體內(nèi)重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)。有研究報(bào)道，在人體的胰腺組織中，存在著局部RAAS系統(tǒng)[13]。而且，無論離體和在體動(dòng)物模型中，還是在人體試驗(yàn)中，胰腺組織RAAS系統(tǒng)的活性增強(qiáng)會(huì)通過多種途徑導(dǎo)致糖代謝的改變從而參與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展[14]。其中，Ang II作為RAAS系統(tǒng)主要成員之一，可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及對(duì)胰島素信號(hào)通路的調(diào)控從而誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡[15]。

AT1-AA是1999年Wallukat等[7]首先在先兆子癇病人血液中發(fā)現(xiàn)的、針對(duì)血管緊張素1型受體的自身抗體，屬于IgG類免疫球蛋白，可特異性識(shí)別AT1 受體的細(xì)胞外第2環(huán)功能表位肽段(AT1R-ECII)，發(fā)揮類似Ang II效應(yīng)。近年來，人們?cè)诙喾N疾病中均發(fā)現(xiàn)了AT1-AA的存在，如子癇前期，難治性高血壓，腎移植排斥反應(yīng)和甲亢[16]等。而其在糖尿病患者血清中的顯著增加引起了我們的注意。并且已有研究證實(shí)，AT1-AA可以使代謝綜合征發(fā)生的易感性增加[17]。那么，為明確其在糖尿病發(fā)生發(fā)展中的作用，研究AT1-AA對(duì)胰島β細(xì)胞的作用具有非常重要的意義。

Figure 4.The autophay of INS-1 cells induced by AT1-AA.A:the effect of AT1-AA on the expression of autophagy-related proteins in the INS-1 cells； B:the antagonistic effect of telmisartan.Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsnegative-IgG group；#P<0.05vsAT1-AA group.
圖4AT1-AA可以誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞自噬水平的升高，該效應(yīng)可以被替米沙坦所阻斷

本研究首先從免疫鼠的血清中提純了AT1-AA陽性的IgG，并利用免疫熒光的方法證實(shí)了AT1-AA可以與INS-1細(xì)胞表面的AT1R特異性的結(jié)合。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，陽性血清提取出的含AT1-AA的陽性IgG可明顯降低INS-1胰島細(xì)胞的存活率。而用不同濃度從陰性血清中提純的陰性IgG孵育INS-1細(xì)胞后，細(xì)胞的存活率沒有顯著改變，說明降低INS-1胰島細(xì)胞存活率的效應(yīng)正是針對(duì)AT1R的自身抗體AT1-AA所發(fā)揮的。作為一種程序性細(xì)胞死亡，細(xì)胞凋亡是誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的一種重要方式。本實(shí)驗(yàn)用10-6mol/L AT1-AA處理細(xì)胞之后，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示處于右上象限和右下象限的凋亡細(xì)胞所占百分比隨處理時(shí)間的延長而增加，這表明，AT1-AA可誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡。然而，凋亡發(fā)生的具體機(jī)制目前尚不明確。

Figure 5.The effect of AT1-AA on the apoptosis of INS-1 cells after inhibition of autophagy by 3-MA.A:cleaved caspase-3 level; B:flow cytometry results; C:Hoechst 33258 staining (×100).Mean±SEM.n=6.**P<0.01vsnegative-IgG group;##P<0.01vsAT1-AA group.
圖53-MA抑制自噬后，AT1-AA誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡程度減輕

Figure 6.The decrease of cell viability induced by AT1-AA is improved by 3-MA.Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsAT1-AA group.
圖63-MA可改善AT1-AA誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞存活率的降低

1977年，有學(xué)者首次在即將死亡的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了自噬現(xiàn)象并提出自噬可維持細(xì)胞存活。之后，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，自噬不僅可以通過對(duì)胞內(nèi)蛋白與細(xì)胞器質(zhì)與量的調(diào)控來維持細(xì)胞能量的穩(wěn)態(tài)，而且可以作為一種獨(dú)立的程序性死亡機(jī)制調(diào)控細(xì)胞死亡，因此提出了自噬性細(xì)胞死亡的概念[18-19]。糖尿病發(fā)生過程中，機(jī)體可發(fā)生氧化應(yīng)激損傷、營養(yǎng)因子匱乏等病理生理改變，此時(shí)適度的自噬可以減少胰島β細(xì)胞凋亡、保證其正常增殖。然而有研究顯示，當(dāng)環(huán)境極度惡劣時(shí)，超出自噬的調(diào)控能力，自噬或可與凋亡同時(shí)出現(xiàn)，促進(jìn)異常細(xì)胞以合理的方式死亡[20]。因此，探究自噬在糖尿病中的作用，尤其是對(duì)胰島β細(xì)胞生存的影響尤為重要。

LC3和beclin 1是公認(rèn)的自噬標(biāo)志蛋白。胞漿型LC3(即LC3-I)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變成的(自噬體)膜型LC3(即LC3-II)是自噬標(biāo)志物，LC3-II/LC3-I比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低。Beclin1基因是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性基因。本課題檢測(cè)結(jié)果顯示，AT1-AA處理不同時(shí)間后細(xì)胞LC3-Ⅱ和beclin 1的蛋白水平逐漸升高，且自噬與凋亡水平的升高幾乎同步，以上結(jié)果提示，在糖尿病患者血清中長期存在的AT1-AA可能誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞發(fā)生過度自噬而促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。為了進(jìn)一步探究自噬與凋亡之間的相關(guān)性，我們使用了自噬抑制劑3-MA，結(jié)果觀察到3-MA預(yù)處理后，INS-1細(xì)胞的凋亡水平顯著降低，細(xì)胞存活率明顯升高，表明自噬的過度激活參與了AT1-AA誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞的凋亡。同時(shí)本研究觀察到，在使用AT1拮抗劑替米沙坦后，細(xì)胞的自噬及凋亡水平均明顯的降低，提示我們AT1-AA效應(yīng)的發(fā)揮是通過AT1R實(shí)現(xiàn)的。

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