miR-195對肺癌A549細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用

王　依，詹　蓉，高建生，張冬英，劉　華

(廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院干保科，廣東 廣州 510080)

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率，不僅病理過程復(fù)雜，且目前傳統(tǒng)的放化療及手術(shù)治療效果并不理想[1]。因此探討其發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制及作用靶點對于控制病情以及個性化診療具有非常重要的意義。隨著對肺癌基因組學(xué)研究的不斷深入，微小RNA(microRNA，miRNA，miR)在其中的作用越來越受到研究者的重視。在肺癌的發(fā)生發(fā)展進程中，眾多miRNAs發(fā)揮著類似抑癌或原癌基因樣的作用，調(diào)控肺癌細(xì)胞的多種生物學(xué)行為[2-3]。miR-195屬于miRNA-15/16/195家族，定位于人染色體17p13.1，在多種腫瘤中可通過靶向不同的基因發(fā)揮抑癌作用[4-5]。Shuang等[6]在喉癌組織及細(xì)胞中檢測到miR-195低表達，此外miR-195還可靶向bcl-2基因抑制喉癌細(xì)胞Hep-2的增殖并促進其凋亡。在宮頸癌中miR-195可通過調(diào)控HDGF基因抑制腫瘤的生長[7]。Su等[8]通過對100例非小細(xì)胞肺癌患者和100健康志愿者的對比分析發(fā)現(xiàn)，miR-195在肺癌中低表達，卻與肺癌的淋巴轉(zhuǎn)移及臨床分級密切相關(guān)。此外，Gao等[9]在肺癌中研究HMGA2基因的功能時，發(fā)現(xiàn)miR-195可直接調(diào)控HMGA2基因的表達，進而影響H1299細(xì)胞的增殖及遷移?？紤]到miRNAs作用的復(fù)雜性及靶基因的多樣性，本研究通過轉(zhuǎn)染miR-195 mimics，檢測miR-195對肺腺癌A549細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，并預(yù)測其可能的靶基因。

材　料　和　方　法

1　材料與試劑

人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549為本實驗室自行凍存。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、RPMI-1640和Opti-MEM培養(yǎng)基購于Gibco；配套轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen； 抗cyclin D1、CDK2、Bcl-2、p-Rb/Rb及β-actin抗體購于Cell Signaling Technology；CCK-8細(xì)胞活力分析試劑盒購于廣州奕源生物公司；細(xì)胞周期檢測試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、BCA試劑盒和Western blot套裝試劑盒均購于南京凱基公司；miR-195 mimics及陰性對照miRNA(miR-negative control)、MYB基因過表達載體pcDNA3-MYB及其對照質(zhì)粒pcDNA3、野生型及突變型MYB基因3’UTR-螢光素酶表達載體(WT-3’UTR和MUT-3’UTR)的構(gòu)建和測序由Promega完成；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2　實驗方法

2.1細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染實驗用A549細(xì)胞用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2條件下，每天換液1次，3～5 d消化傳代。消化后的細(xì)胞接種于6孔板中，至細(xì)胞生長80%融合時，更換無血清培養(yǎng)基饑餓處理6 h。分別設(shè)置空白對照組(control組)、陰性對照(miR-negative control)組(NC組)和轉(zhuǎn)染miR-195 mimics組(miR-195組)。依據(jù)轉(zhuǎn)染說明書，將miR-195 mimics和miR-negative control轉(zhuǎn)染到相應(yīng)組別的細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。檢驗轉(zhuǎn)染效率后，進行后續(xù)的實驗分析。

2.2CCK-8法測定細(xì)胞活力按照說明書，使用CCK-8細(xì)胞活力分析試劑盒鑒定各組細(xì)胞的細(xì)胞活力。經(jīng)酶標(biāo)儀測定450 nm波長處各孔的吸光度(A)值。

2.3流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期收集各組細(xì)胞，4 ℃、70%無水乙醇避光固定細(xì)胞24 h，重懸細(xì)胞。依據(jù)細(xì)胞周期試劑盒說明書要求，加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測激發(fā)光Ex=488 nm處的熒光強度。

2.4Annexin V /PI 雙染色法測定細(xì)胞凋亡收集各組細(xì)胞，依據(jù)Annexin V /PI 雙染凋亡試劑盒說明書，加入Annexin V-FITC和PI染色液避光孵育30 min。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測激發(fā)光Ex=488 nm和發(fā)射光Em=530 nm處的熒光強度。

2.5Transwell實驗測定細(xì)胞遷移采用Transwell小室(24孔板，Transwell小室孔徑8 μm)進行檢查細(xì)胞遷移。收集處理后的細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基同步化12 h，調(diào)整細(xì)胞密度為2×108/L。Transwell小室上槽腔接種 2×104個細(xì)胞(每個小室100 μL)，小室下槽腔內(nèi)加入600 μL含10% FBS的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用棉簽擦除小室上槽腔細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色5 min，用PBS漂洗3次。正置顯微鏡下隨機拍照。

2.6Western blot測定蛋白的表達裂解細(xì)胞，萃取細(xì)胞蛋白，經(jīng) BCA試劑盒對所提蛋白定量后，使用Western blot套裝試劑盒進行SDS-PAGE。PVDF膜經(jīng)5%的脫脂牛奶封閉后，依據(jù)抗體說明書要求加入相應(yīng)比例的 I 抗室溫孵育2 h，再加入對應(yīng)的 II 抗室溫孵育1 h，暗室顯影。

2.7Real-time PCR依據(jù)Trizol說明書的要求提取細(xì)胞中的總RNA，純化并定量后取2 μg總RNA催化合成cDNA，而后依據(jù)說明書要求進行PCR擴增。擴增條件為95 ℃ 15 s、60 ℃ 10 s、72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。miR-195的表達以U6為內(nèi)參照，MYB的mRNA表達以β-actin為內(nèi)參照?；虻南鄬Ρ磉_量采用2-ΔΔCt法進行分析。miR-195 的正向引物序列為5’-ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACAGAAAT-3’，反向引物序列為5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’； U6的正向引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’； MYB的正向引物序列為5’-GAAGGTCGAACAGGAAGGTTATCT-3’，反向引物序列為5’-GTAACGCTACAGGGTATGGAACA-3’；β-actin的正向引物序列為5’-ACAGAGCCTCGCCTTTGCCGATC-3’，反向引物序列為5’-ATCCTTCTGACCCATGCCCACCA-3’。

2.8螢光素酶報告基因檢測本實驗采用雙螢光素酶報告基因分析檢測及驗證miR-195的靶基因。首先用靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫TargetScan、PicTar、miRDB和miRanda對miR-195的靶基因進行預(yù)測，挑選預(yù)測值較高的靶點MYB基因，并進行驗證。然后構(gòu)建野生型和突變型MYB基因3’UTR-螢光素酶表達質(zhì)粒(WT-3’UTR和MUT-3’UTR)，將質(zhì)粒和/或miR-195 mimics 轉(zhuǎn)入細(xì)胞中(轉(zhuǎn)染方法見2.1)，使用螢光素酶報告基因檢測儀進行Dual-Luciferase Reporter Assay，通過檢測螢光素酶的活性來驗證MYB是否是miR-195的作用靶點。實驗設(shè)置空載體(psiCHECK-2)組、野生型MYB基因(WT-3’UTR)和突變型MYB基因(MUT-3’UTR)組。實驗結(jié)果以螢火蟲螢光素酶與海腎螢光素酶活性的比值來進行統(tǒng)計學(xué)分析。

3　統(tǒng)計學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)均錄入SPSS 17.0軟件中進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料的結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。單因素方差分析用于多組計量資料之間的統(tǒng)計學(xué)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

1　miR-195 mimics轉(zhuǎn)染效率檢測

Real-time RCR結(jié)果顯示，相較于對照組，轉(zhuǎn)染miR-195 mimics之后，A549細(xì)胞miR-195的表達水平明顯升高(P<0.05)，可用于后續(xù)實驗分析，見圖1A。

2　過表達 miR-195對A549細(xì)胞活力、凋亡及遷移能力的影響

CCK-8實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-195 mimics后，A549細(xì)胞的細(xì)胞活力顯著低于對照組(P<0.05)，見圖1B。

流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示，與對照組比較，A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-195 mimics后，G0/G1期細(xì)胞所占的百分比增加(P<0.05)，S期細(xì)胞所占百分比減少(P<0.05)，說明過表達miR-195可抑制A549細(xì)胞周期的G1/S轉(zhuǎn)換，見圖1C。

與對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-195 mimics后，A549細(xì)胞的早期凋亡率增加(P<0.05)，表明過表達miR-195可明顯促進肺癌A549細(xì)胞的凋亡，見圖1D。

Transwell實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-195 mimics后A549細(xì)胞的遷移率減少(P<0.05)，表明過表達miR-195可明顯抑制肺癌A549細(xì)胞的遷移能力，見圖1E。

3　過表達 miR-195降低細(xì)胞周期與凋亡相關(guān)蛋白的水平

Western blot結(jié)果顯示，相較于對照組，轉(zhuǎn)染miR-195 mimics后A549細(xì)胞中cyclin D1、CDK2、p-Rb及 Bcl-2的蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖2。

4　miR-195靶基因的預(yù)測及驗證

首先通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測miR-195的可能靶基因，對常用且權(quán)威的靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫TargetScan、PicTar、miRDB和miRanda進行檢索后結(jié)合已報道的文獻，得到了預(yù)測值較高的靶點MYB。MYB與miR-195的結(jié)合位點如圖3A所示。

圖3B顯示A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)入miR-195 mimics之后，MYB的mRNA和蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。圖3C顯示，與對照組相比，在WT-3’UTR組轉(zhuǎn)入miR-195 mimics后螢光素酶的活性降低(P<0.05)；而MUT-3’UTR組轉(zhuǎn)入miR-195 mimics并不會抑制螢光素酶的活性，表明miR-195可直接作用于MYB基因的3’UTR區(qū)域來抑制其表達。

5　過表達MYB部分逆轉(zhuǎn)miR-195的作用

同時將miR-195 mimic和pcDNA3-MYB轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞之后，MYB的表達明顯高于對照組(P<0.05)，見圖4A。生物學(xué)行為檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3-MYB后，細(xì)胞活力明顯升高(P<0.05，圖4B)；早期凋亡率較對照組降低(P<0.05，圖4C)；遷移率較對照組升高(P<0.05，圖4D)。以上結(jié)果表明，MYB過表達可部分逆轉(zhuǎn)miR-195對A549細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用。

討　　論

miR-195對不同腫瘤所發(fā)揮的作用亦不盡相同，早期的研究表明，在肺癌中miR-195呈低表達狀態(tài)，可能發(fā)揮抑癌基因樣作用。本研究探討了miR-195對肺腺癌A549細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用。CCK-8細(xì)胞活力檢測和流式細(xì)胞術(shù)周期檢測的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-195 mimic后，A549細(xì)胞的活力降低，且細(xì)胞的周期進程出現(xiàn)明顯的G1/S阻滯；表明miR-195可抑制A549細(xì)胞生長。進一步的細(xì)胞凋亡分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-195 mimic可促進A549細(xì)胞凋亡。此外，Transwell的結(jié)果顯示，miR-195可抑制A549細(xì)胞的遷移能力，提示miR-195可能通過抑制肺癌A549細(xì)胞活力及遷移能力并促進細(xì)胞凋亡，抑制肺癌的進一步發(fā)展，進而發(fā)揮抑癌作用。

關(guān)于miR-195調(diào)控A549細(xì)胞生物學(xué)行為的相關(guān)機制目前并沒有系統(tǒng)的研究。多數(shù)miRNA在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖及周期時，均涉及到周期相關(guān)蛋白表達的變化；Luo等[10]在結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中發(fā)現(xiàn)過表達miR-195可抑制CDK8的表達；此外，在宮頸癌細(xì)胞HeLa和C33A中miR-195可調(diào)控cyclinD1a進而影響細(xì)胞的周期進程[11]。本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-195 mimic后，A549細(xì)胞中周期相關(guān)蛋白cyclin D1、CDK2和p-Rb的蛋白水平均顯著降低。Bcl-2則是一種公認(rèn)的抗凋亡因子[12]，我們的研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-195可抑制A549細(xì)胞中Bcl-2的表達，說明miR-195的促凋亡作用可能與調(diào)控Bcl-2的表達相關(guān)。由此推測，對周期及凋亡相關(guān)因子的影響可能是miR-195調(diào)控A549細(xì)胞生物學(xué)行為的路徑之一。

Figure 1.The effects of miR-195 on the biological behaviors in the A549 cells.A:detection of the transfection efficiency; B:the effect of miR-195 on the viability in the A549 cells; C:the effect of miR-195 on the cell cycle distribution of A549 cells; D:the effect of miR-195 on the apoptosis of A549 cells; E:the effect of miR-195 on migration ability in the A549 cells (×200).Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.
圖1miR-195對A549細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

Figure 2.The effect of miR-195 over-expression on the expression levels of the cell cycle-and apoptosis-related proteins in the A549 cells.Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.
圖2過表達miR-195對A549細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

Figure 3.Validation ofMYBas a target gene for miR-195.A:miR-195 seed sequence and its complementary binding site in MYB 3’UTR; B:the effect of miR-195 over-expression on the mRNA and protein expression of MYB in the A549 cells; C:the relative luciferase activity in transfected A549 cells.Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vspsiCHECK-2 group.
圖3MYB可能是miR-195靶基因的驗證實驗結(jié)果

Figure 4.MYBover-expression partially reversed the effects of miR-195.A:the over-expression efficiency of pcDNA3-MYB; B:the effect ofMYBover-expression on the cell viability; C:the effect of MYB over-expression on the apoptosis; D:the effect ofMYBover-expression on the cell migration ability (×200).Mean±SD.n=6.#P<0.05vsmiR-195 mimics+control group.
圖4MYB過表達部分逆轉(zhuǎn)miR-195的作用

眾所周知，miRNAs一般是通過調(diào)控靶基因來實現(xiàn)其功能的[13]，為進一步分析miR-195影響A549細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機制，本實驗對其靶基因進行了預(yù)測及驗證。生物信息學(xué)分析顯示MYB可能是miR-195的靶基因，且MYB可能與miR-195結(jié)合(結(jié)合位點如圖3A所示)。對MYB基因進行文獻檢索發(fā)現(xiàn)其是一種直接轉(zhuǎn)錄因子，在多種腫瘤中高表達，發(fā)揮原癌基因樣作用，并可通過激活Bcl-2和c-Myc等一系列復(fù)雜的信號通路網(wǎng)絡(luò)調(diào)控細(xì)胞的增殖、周期、遷移及凋亡等生物學(xué)行為[14-16]。本實驗在A549細(xì)胞中同時轉(zhuǎn)入miR-195 mimic和MYB過表達質(zhì)粒對MYB的功能進行了進一步的驗證，結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染可部分逆轉(zhuǎn)miR-195對細(xì)胞增殖、遷移的抑制作用和其凋亡促進作用，表明MYB是miR-195的靶基因。但是中間涉及的具體機制及信號通路還需進一步深入的研究。

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