干擾HDAC1通過調(diào)控STAT3信號通路影響皮膚鱗癌細胞凋亡*

賈淑青，方銳華，莫金雪

(1廣州市第一人民醫(yī)院南沙醫(yī)院皮膚科，廣東 廣州 511457； 2廣州市第一人民醫(yī)院皮膚科，廣東 廣州 510180)

皮膚是人體最大的器官，能夠保護機體免于物理損傷，皮膚經(jīng)過長時間的紫外線和輻射等損傷后，皮膚組織細胞中的DNA等發(fā)生斷裂，導(dǎo)致皮膚發(fā)生癌變[1]。皮膚鱗狀細胞癌(簡稱鱗癌)是一種常見的皮膚惡性腫瘤，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，具有發(fā)展快、易轉(zhuǎn)移等特點。組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)1參與核小體結(jié)構(gòu)的變化過程和相關(guān)基因的表達，與轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄有關(guān)，參與細胞凋亡過程。HDAC1在前列腺癌、腎細胞癌和卵巢癌等腫瘤組織中表達升高，能夠促進腫瘤細胞的生長[2-6]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transdu-cer and activator of transcription 3，STAT3)信號通路在細胞生長和凋亡過程中發(fā)揮調(diào)控作用，STAT3磷酸化后，STAT3信號通路激活，細胞凋亡受到抑制[7-9]。有研究表明，抑制STAT3信號通路能夠促進腫瘤細胞的凋亡[10-13]。本研究以皮膚鱗癌細胞為研究對象，通過RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)探討HDAC1對細胞凋亡的影響，以期為靶向HDAC1治療皮膚鱗癌提供理論基礎(chǔ)。

材　料　和　方　法

1　材料

HDAC1小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)和小干擾RNA陰性對照(siRNA negative control，siRNA NC)為廣州醫(yī)科大學實驗室保存。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑為Invitrogen產(chǎn)品；RT-PCR試劑盒為Thermo產(chǎn)品；BCA蛋白濃度檢測試劑盒為碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品； 抗STAT3、p-STAT3和cleaved caspase-3單克隆抗體均為SAB產(chǎn)品；抗HDAC1多克隆抗體為Santa Cruz產(chǎn)品。HDAC1和GAPDH引物由TaKaRa合成。

2　方法

2.1細胞培養(yǎng)皮膚鱗癌細胞A431購自廣州吉妮歐生物科技。用含有10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將保存于液氮罐中的細胞放于37 ℃條件下不停地搖動，使細胞在1 min內(nèi)融化，加入細胞培養(yǎng)液，1 000 r/min離心5 min，將上層液吸除后，加入5 mL的細胞培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞密度超過80%時，用0.25%的胰蛋白酶對細胞進行消化傳代。

2.2細胞分組及轉(zhuǎn)染A431細胞培養(yǎng)至對數(shù)期后，分別轉(zhuǎn)染HDAC1 siRNA和siRNA NC，記為HDAC1 siRNA組和siRNA NC組，同時設(shè)置空白對照(control)組，control組細胞不進行細胞轉(zhuǎn)染。分別取HDAC1 siRNA和siRNA NC各12.5 μL，分別與250 μL不含血清的DMEM培養(yǎng)基混合，室溫環(huán)境下孵育5 min；取Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑與250 μL不含血清的DMEM培養(yǎng)基混合，在室溫靜置5 min；將稀釋后的siRNA和稀釋后的Lipofectamine 2000混合后，室溫環(huán)境下靜置20 min，后加入到細胞密度約為60%的A431細胞中，孵育6 h，更換細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實驗研究。

2.3RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后細胞中HDAC1的mRNA表達分別取培養(yǎng)48 h后的各組細胞，加入1 mL Trizol，混勻后裂解5 min。加200 μL氯仿，劇烈振蕩反應(yīng)15 s后，靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。吸取500 μL上清液于EP管中，加入500 μL的異丙醇溶液，混合后，靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。用75%的乙醇洗滌RNA 2次后，室溫條件下晾干。用DEPC水溶解后，保存于-80 ℃。HDAC1 的上游引物序列為5’-AACTGGGGACCTACGG-3’，下游引物序列為5’-ACTTGGCGTGTCCTT-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，下游引物序列為5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’。 PCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 5 min； 95 ℃ 20 s、60 ℃ 60 s、72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照，分析HDAC1的表達水平，實驗重復(fù)3次，取均值。

2.4Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細胞中HDAC1的蛋白表達分別取培養(yǎng)48 h后的各組細胞，加入細胞裂解液，待細胞完全裂解后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取蛋白上清液，按照BCA蛋白定量檢測試劑盒檢測蛋白樣品的濃度。將蛋白樣品與等體積的上樣緩沖液混合煮沸后進行凝膠電泳，使用10%的分離膠和5%的濃縮膠，90 V恒壓電泳至溴酚藍進入到分離膠的底部；100 V電壓將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%牛血清白蛋白在37 ℃封閉90 min。加入 I 抗 (1∶1 000倍稀釋)，4 ℃雜交過夜；再加入II抗(1∶2 000倍稀釋)，室溫孵育90 min。顯色后，用Quantity One對蛋白進行定量分析，內(nèi)參照基因為GAPDH，實驗重復(fù)3次，取均值。

2.5MTT法檢測細胞活力取各組細胞以每孔3 000個細胞的密度接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48 h后，加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，37 ℃孵育4 h。棄上清液，在細胞中加入二甲基亞砜150 μL，待細胞結(jié)晶物融化后，用酶標儀檢測每孔波長490 nm處的吸光度(A)，實驗重復(fù)3次，取均值。

2.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡取各組細胞培養(yǎng)48 h后，收集106個細胞，用200 μL結(jié)合緩沖液懸浮細胞，加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL 碘化丙啶(propidium iodide，PI)，于室溫環(huán)境下，避光反應(yīng)15 min，再加300 μL緩沖液，用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，實驗重復(fù)3次，取均值。

2.7Western blot檢測細胞中STAT3、p-STAT3和cleaved caspase-3的蛋白水平取各組細胞培養(yǎng)48 h后，按照2.4的方法提取細胞蛋白，并用Western blot檢測STAT3、p-STAT3和cleaved caspase-3的蛋白水平，內(nèi)參照為GAPDH，實驗重復(fù)3次，取均值。

2.8抑制STAT3信號通路對細胞凋亡的影響HDAC1 siRNA組細胞用STAT3信號通路抑制劑AG490(40 μmol/L)處理后48 h(記為HDAC1 siRNA+AG490組)，MTT法檢測細胞活力(步驟參照2.5)，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡(步驟參照2.6)，Western blot檢測STAT3、p-STAT3和cleaved caspase-3水平(步驟參照2.7)。

3　統(tǒng)計學處理

所得的實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較應(yīng)用方差分析并用Bonferroni校正的t檢驗進行兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)　　果

1　轉(zhuǎn)染后細胞中HDAC1的表達

RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與control組比較，siRNA NC組中HDAC1的mRNA和蛋白表達水平均無顯著差異；HDAC1 siRNA組細胞中 HDAC1 的mRNA和蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)，說明HDAC1 siRNA能夠有效抑制皮膚鱗癌細胞中HDAC1的mRNA和蛋白表達，見圖1。

2　HDAC1對細胞活力的影響

MTT實驗結(jié)果顯示，與control組比較,HDAC1 siRNA組的細胞活力明顯降低(P<0.05)，說明干擾HDAC1表達能抑制皮膚鱗癌細胞的活力，見圖2。

3　HDAC1對細胞凋亡的影響

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與control組比較，HDAC1 siRNA組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，說明干擾HDAC1表達能促進皮膚鱗癌細胞凋亡，見圖3。

Figure 1.The expression level of HDAC1 in transfected cells.A:the mRNA level of HDAC1; B:Western blot was used to determine the protein expression of HDAC1.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.
圖1轉(zhuǎn)染后細胞中HDAC1表達水平的變化

Figure 2.The effect of HDAC1 on the cell viability.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.
圖2HDAC1對細胞活力的影響

4　HDAC1對細胞STAT3、p-STAT3和cleaved caspase-3水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，與control組比較HDAC1 siRNA組細胞中的STAT3水平無顯著差異，p-STAT3水平明顯降低(P<0.05)，cleaved caspase-3水平明顯升高(P<0.05)，說明干擾HDAC1表達能夠促進皮膚鱗癌細胞中cleaved caspase-3的蛋白水平，抑制p-STAT3的蛋白水平，見圖4。

Figure 3.The effect of HDAC1 on the apoptosis.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.
圖3HDAC1對細胞凋亡的影響

Figure 4.The effect of HDAC1 on the protein levels of STAT3,p-STAT3 and cleaved caspase-3 in the cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.
圖4HDAC1對細胞中STAT3、p-STAT3和cleavedcaspase-3蛋白水平的影響

5　STAT3信號通路抑制劑對細胞活力的影響

如圖5所示，與HDAC1 siRNA組比較，HDAC1 siRNA+AG490組的細胞活力明顯降低(P<0.05)，說明STAT3信號通路抑制劑AG490能夠協(xié)同HDAC1 siRNA抑制皮膚鱗癌細胞的活力，見圖5。

Figure 5.The effect of STAT3 signaling pathway inhibitor AG490 on the cell viability.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHDAC1 siRNA group.
圖5STAT3信號通路抑制劑對細胞活力影響

6　STAT3信號通路抑制劑對細胞凋亡的影響

如圖6所示，與HDAC1 siRNA組比較，HDAC1 siRNA+AG490組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，STAT3蛋白水平無顯著差異，p-STAT3蛋白水平明顯降低(P<0.05)，cleaved caspase-3蛋白水平明顯升高(P<0.05)，說明STAT3信號通路抑制劑AG490能夠協(xié)同HDAC1 siRNA促進皮膚鱗癌細胞凋亡。

討　　論

HDAC1是第一個被發(fā)現(xiàn)的組蛋白去乙?；福渚幋a的蛋白含有482個氨基酸，在非組蛋白和組蛋白的去乙酰過程化中發(fā)揮重要作用，能夠調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，HDAC1在腫瘤組織中過度表達[15]。朱鑫等[16]通過免疫組化和RT-PCR的方法檢測了51例腎透明細胞癌標本和24例癌旁組織中HDAC1的陽性表達率依次為62%和37%，HDAC1的mRNA水平依次為0.35和0.10。鐘麗穎等[17]研究表明，小干擾RNA靶向抑制HDAC1表達后，卵巢癌細胞的凋亡率增加，細胞生長減慢。研究表明，干擾HDAC1 siRNA表達后的大腸癌細胞SW480的細胞凋亡率高達31%[18]。之后的研究報道稱，干擾HDAC1 siRNA表達能夠抑制舌鱗癌、宮頸癌和胃癌等多種癌細胞的生長，促進癌細胞的凋亡[19-20]。本研究結(jié)果顯示，干擾HDAC1 siRNA表達后的皮膚鱗癌細胞活力下降，細胞凋亡率增加，與之前的研究報道相符合，均說明干擾HDAC1表達能夠促進癌細胞凋亡。

Caspase蛋白家族成員的活性位點上均含有一個半胱氨酸蛋白酶，能夠特異性地切割某些蛋白質(zhì)，參與細胞凋亡過程。Caspase-3級聯(lián)反應(yīng)激活后細胞凋亡發(fā)生[21]。Caspase-3是caspase蛋白家族成員之一，是凋亡的執(zhí)行因子，caspase-3活化后生成cleaved caspase-3，標志著細胞凋亡進入不可逆的階段。Caspase-3參與多種腫瘤相關(guān)基因和藥物調(diào)控胃癌、肺癌和口腔癌等癌細胞生長的過程[22]。Ho 等[23]研究表明，小檗堿能夠通過調(diào)控caspase-3的表達影響舌鱗狀細胞癌細胞的凋亡。本研究結(jié)果顯示，干擾HDAC1表達后的皮膚鱗癌細胞中cleaved caspase-3水平升高，這提示，干擾HDAC1表達可能通過提高cleaved caspase-3的水平促進皮膚鱗癌細胞凋亡。

STAT3信號通路參與細胞的生長和凋亡過程，與腫瘤、心血管等疾病的發(fā)生有關(guān)[24]。有研究表明，腫瘤組織中p-STAT3水平異常升高，細胞中STAT3信號通路異常激活[25]。AG490是STAT3信號通路是上游酪氨酸激酶JAK的抑制劑，能夠抑制細胞內(nèi)STAT3信號通路的激活[26]。用AG490作用于腫瘤細胞后，腫瘤細胞的生長受到抑制作用，細胞凋亡增加[27]。本研究結(jié)果顯示，干擾HDAC1表達后皮膚鱗癌細胞中p-STAT3水平下降，而用AG490作用后細胞凋亡率升高更多，細胞活力下降更多。這提示，降低HDAC1表達可能通過調(diào)控STAT3信號通路影響皮膚鱗癌細胞凋亡。

Figure 6.The effect of STAT3 signaling pathway inhibitor on apoptosis.A:the results of flow cytometry for analyzing the cell apoptosis; B:the results of Western blot for determining the protein levels of p-STAT3,STAT3 and cleaved caspase-3.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHDAC1 siRNA group.
圖6STAT3信號通路抑制劑對細胞凋亡影響

HDAC1除了能夠通過調(diào)控STAT3信號通路影響腫瘤細胞生長以外，還可以與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase-1，DNMT-1)結(jié)合形成復(fù)合物，調(diào)控影響E2F反應(yīng)性啟動子的轉(zhuǎn)錄[28]。在T淋巴細胞惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)HDAC1能夠與STAT3結(jié)合形成HDAC1-DNMT1-STAT3復(fù)合物，隨后有關(guān)學者又在骨肉瘤細胞中同樣發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物的形成，并且該復(fù)合體還可以通過調(diào)控SHP-1酪氨酸磷酸酶(SHP-1 tyrosine phosphatase)與STAT結(jié)合區(qū)域SIE/GAS 的表觀遺傳性抑制細胞增殖[29-30]。HDAC1對腫瘤的作用機制十分復(fù)雜，對于HDAC1影響皮膚鱗癌細胞生長和凋亡的作用機制還需要后續(xù)進一步研究。

綜上所述，降低HDAC1表達能夠抑制皮膚鱗癌細胞活力，促進皮膚鱗癌細胞凋亡，其作用機制可能與STAT3信號通路有關(guān)。本研究為后續(xù)進一步探討HDAC1在皮膚鱗癌中的作用奠定了基礎(chǔ)，為靶向HDAC1治療皮膚鱗癌提供了理論依據(jù)。本研究只在體外初步探討了HDAC1在皮膚鱗癌中的作用，后續(xù)實驗中會對HDAC1在癌癥中的具體作用機制進行深入研究，并會對HDAC1調(diào)控STAT3信號通路影響癌細胞凋亡的機制做深入探討。

[參考文獻]

[1]Giralt J,Trigo J,Nuyts S,et al.Panitumumab plus radiotherapy versus chemoradiotherapy in patients with unresected,locally advanced squamous-cell carcinoma of the head and neck (CONCERT-2):a randomised,controlled,open-label phase 2 trial[J].Lancet Oncol,2015,16(2):221-232.

[2]Burdelski C,Ruge OM,Melling N,et al.HDAC1 overexpression independently predicts biochemical recurrence and is associated with rapid tumor cell proliferation and genomic instability in prostate cancer[J].Exp Mol Pathol,2015,98(3):419-426.

[3]Kim MJ,Kim DE,Jeong IG,et al.HDAC inhibitors synergize antiproliferative effect of sorafenib in renal cell carcinoma cells[J].Anticancer Res,2012,32(8):3161-3168.

[4]Wu MY,Fu J,Xiao X,et al.MiR-34a regulates therapy resistance by targeting HDAC1 and HDAC7 in breast can-cer[J].Cancer Lett,2014,354(2):311-319.

[5]Meyers-Needham M,Ponnusamy S,Gencer S,et al.Concerted functions of HDAC1 and microRNA-574-5p repress alternatively spliced ceramide synthase 1 expression in human cancer cells[J].EMBO Mol Med,2012,4(2):78-92.

[6]Chuang JY,Chang WC,Hung JJ.Hydrogen peroxide induces Sp1 methylation and thereby suppresses cyclin B1 via recruitment of Suv39H1 and HDAC1 in cancer cells[J].Free Radical Biol Med,2011,51(12):2309-2318.

[7]李邐，王純，盧宏達.馬錢子堿通過抑制IL-6/STAT3信號通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細胞凋亡[J].中國病理生理雜志,2016,32(6):998-1003.

[8]Lee HJ,Zhuang G,Cao Y,et al.Drug resistance via feedback activation of Stat3 in oncogene-addicted cancer cells[J].Cancer Cell,2014,26(2):207-221.

[9]Siveen KS,Sikka S,Surana R,et al.Targeting the STAT3 signaling pathway in cancer:role of synthetic and natural inhibitors[J].Biochim Biophys Acta,2014,1845(2):136-154.

[10] Sen M,Thomas SM,Kim S,et al.First-in-human trial of a STAT3 decoy oligonucleotide in head and neck tumors:implications for cancer therapy[J].Cancer Discovery,2012,2(8):694-705.

[11] 崔照瓊，張以芳.JAK-STAT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路阻斷劑 AG490 對肝癌 SMMC-7721 細胞移植瘤生長的影響[J].腫瘤,2016,36(12):1291-1297.

[12] Yue P,Lopez-Tapia F,Paladino D,et al.Hydroxamic acid and benzoic acid-based STAT3 inhibitors suppress human glioma and breast cancer phenotypesinvitroandinvivo[J].Cancer Res,2016,76(3):652-663.

[13] Chung SS,Vadgama JV.Curcumin and epigallocatechin gallate inhibit the cancer stem cell phenotype via down-regulation of STAT3-NFκB signaling[J].Anticancer Res,2015,35(1):39-46.

[14] Boucheron N,Tschismarov R,Goeschl L,et al.CD4+T cell lineage integrity is controlled by the histone deacetylases HDAC1 and HDAC2[J].Nat Immunol,2014,15(5):439-448.

[15] Zhao R,Chen K,Cao J,et al.A correlation analysis between HDAC1 over-expression and clinical features of laryngeal squamous cell carcinoma[J].Acta Otolaryngol,2016,136(2):172-176.

[16] 朱鑫，王亞軒，常學良，等.HDAC1 及 E2F1 在腎透明細胞癌中的表達及意義[J].河北醫(yī)藥,2015,37(19):2885-2888.

[17] 鐘麗穎.siRNA 沉默 HDAC1 抑制人卵巢癌 SKOV3/DDP 細胞 EGFR 基因表達及誘導(dǎo)細胞凋亡[D].長春：吉林大學,2013.

[18] Thangaraju M,Carswell KN,Prasad PD,et al.Colon cancer cells maintain low levels of pyruvate to avoid cell death caused by inhibition of HDAC1/HDAC3[J].Biochem J,2009,417(1):379-389.

[19] Halkidou K,Gaughan L,Cook S,et al.Upregulation and nuclear recruitment of HDAC1 in hormone refractory prostate cancer[J].Prostate,2004,59(2):177-189.

[20] De Amicis F,Giordano F,Vivacqua A,et al.Resveratrol,through NF-Y/p53/Sin3/HDAC1 complex phosphorylation,inhibits estrogen receptor α gene expression via p38MAPK/CK2 signaling in human breast cancer cells[J].FASEB J,2011,25(10):3695-3707.

[21] 董雅潔，高維娟，錢濤，等.Bcl-2抑制劑對黃芪注射液降低缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元caspase-3表達的影響[J].中國病理生理雜志,2016,32(6):1051-1056.

[22] Hajiahmadi S,Panjehpour M,Aghaei M,et al.Activation of A2b adenosine receptor regulates ovarian cancer cell growth:involvement of Bax/Bcl-2 and caspase-3[J].Biochem Cell Biol,2015,93(4):321-329.

[23] Ho YT,Lu CC,Yang JS,et al.Berberine induced apoptosis via promoting the expression of caspase-8,-9 and-3,apoptosis-inducing factor and endonuclease G in SCC-4 human tongue squamous carcinoma cancer cells[J].Anticancer Res,2009,29(10):4063-4070.

[24] 陳健芳，陳景福，陳巍，等.血管緊張素(1-7)通過抑制JAK/STAT信號通路對抗高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷[J].中國病理生理雜志,2017,33(3):481-488.

[25] De Simone V,Franze E,Ronchetti G,et al.Th17-type cytokines,IL-6 and TNF-α synergistically activate STAT3 and NF-κB to promote colorectal cancer cell growth[J].Oncogene,2015,34(27):3493-3503.

[26] 馬向濤，王杉，杜如昱，等.JAK 激酶抑制劑 AG490 聯(lián)合 5-氟尿嘧啶抑制結(jié)腸癌細胞STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究[J].中華實驗外科雜志,2003,20(10):874-876.

[27] Gritsko T,Williams A,Turkson J,et al.Persistent activation of Stat3 signaling induces survivin gene expression and confers resistance to apoptosis in human breast cancer cells[J].Clin Cancer Res,2006,12(1):11-19.

[28] Robertson KD,Ait-Si-Ali S,Yokochi T,et al.DNMT1 forms a complex with Rb,E2F1 and HDAC1 and represses transcription from E2F-responsive promoters[J].Nat Ge-net,2000,25(3):338-342.

[29] Zhang Q,Wang HY,Marzec M,et al.STAT3-and DNA methyltransferase 1 -mediated epigenetic silencing of SHP-1 tyrosine phosphatase tumor suppressor gene in malignant T lymphocytes[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(19):6948-6953.

[30] Zhang T,Li S,Li J,et al.Natural product pectolinarigenin inhibits osteosarcoma growth and metastasis via SHP-1-mediated STAT3 signaling inhibition[J].Cell Death Dis,2016,7(10):e2421.