M3R激動劑通過激活PI3K/AKT信號途徑促進肺癌細胞A549的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化*

邢　靜，林耿鵬，羅海丹，曾智敏，楊惠玲，郭禹標(biāo)△

(中山大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，2中山醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，廣東 廣州 510080)

肺癌是當(dāng)今全球范圍內(nèi)最常見的腫瘤之一[1]。在中國，肺癌是發(fā)病率最高的腫瘤，也是腫瘤死亡的最首要原因[2]。肺癌起病隱匿，超過半數(shù)的病人在就診時已屬晚期，腫瘤已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移喪失手術(shù)機會[3]。遠處轉(zhuǎn)移是肺癌進展的重要特征之一，了解肺癌遠處轉(zhuǎn)移的機制對于治療肺癌有重要意義。國內(nèi)外及本課題組前期實驗均證實毒蕈堿膽堿受體3(muscarinic receptor 3，M3R)的激活能促進肺癌的進展[4-6]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在腫瘤的遷移和侵襲過程中起重要作用，但M3R的激活是否能誘導(dǎo)肺癌細胞EMT目前尚未見報道，因此本文應(yīng)用M3R激動劑卡巴膽堿(carbachol)探討激動M3R對肺癌細胞EMT的影響及其可能的信號通路。

材　料　和　方　法

1　細胞、材料和儀器

肺癌細胞 A549由本實驗室前期保存。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶和青霉素/鏈霉素均購自Gibco；carbachol、M3R特異性抑制劑4-DAMP和抗β-actin抗體購自Sigma；抗E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體購自ABclonal；抗p-AKT、AKT和波形蛋白(vimentin)抗體及HRP標(biāo)記的抗鼠抗體和HRP標(biāo)記的抗兔抗體均購自CST；Matrigel膠購自BD；RNA提取試劑盒購自康為世紀(jì)公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa；qPCR試劑購自廣州往圣生物科技公司；引物購自廣州英韋杰津公司。化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自Bio-Rad; 全自動倒置顯微鏡購自Zeiss；PCR儀購自Bio-Rad。

2　方法

2.1A549細胞的培養(yǎng)和傳代A549細胞用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基混合液培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。采用0.25%胰酶溶液進行消化傳代，取生長狀況良好的對數(shù)生長期細胞用于實驗。

2.2細胞形態(tài)的觀察400 μmol/L carbachol處理細胞72 h,于全自動顯微鏡下觀察未處理和處理后的細胞形態(tài)學(xué)變化。

2.3細胞劃痕實驗將肺癌A549細胞接種于6孔板，對照組不進行任何處理，carbachol組加入400 μmol/L carbachol，用200 μL的槍頭在細胞板上劃痕，37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下拍照，劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

2.4Transwell侵襲實驗細胞分組處理同劃痕實驗。將肺癌A549細胞重懸于無血清培養(yǎng)基中，使用孔徑8.0 μm的24孔Transwell小室，取6×105細胞200 μL加入上室，下室加入500 μL完全培養(yǎng)液，分組處理后置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,多聚甲醛固定，0.05%結(jié)晶紫染色，光學(xué)顯微鏡下隨機選取5個視野，拍照并記錄穿膜細胞數(shù)。

2.5qPCR檢測A549細胞vimentin 和E-cadherin的mRNA表達實驗分為3組：對照組不做任何處理；carbachol組給予400 μmol/L carbachol處理細胞72 h; carbachol+4-DAMP組同時給予400 μmol/L carbachol和50 μmol/L 4-DAMP處理細胞72 h棄去培養(yǎng)基，按照RNA提取試劑盒說明書步驟提取A549細胞的RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書把提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用qPCR檢測vimentin和E-cadherin的mRNA表達情況，以GAPDH為內(nèi)參照。引物序列見表1[7]。

表1　引物序列Table 1.Primer sequences for qPCR

2.6Western blot檢測A549細胞p-ATK、vimentin和E-cadherin的蛋白水平細胞處理同qPCR實驗。取A549細胞棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS清洗2遍后，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的全細胞裂解液于冰上裂解10 min，使用細胞刮刮取蛋白，于4 ℃、12 000 r/min離心提取上清液。用BCA法測定蛋白濃度并配平。取蛋白進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5% BSA封閉后，加入 I 抗(β-actin稀釋比例為1∶10 000；p-AKT、AKT、vimentin和E-cadherin稀釋比例為1∶1 000)4 ℃孵育過夜，然后 II 抗室溫孵育1 h，ECL法化學(xué)發(fā)光成像，ImageJ 3.0分析條帶。

3　統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0軟件處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組計量資料間采用獨立樣本t檢驗，多組計量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

1　卡巴膽堿對肺癌A549細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化形態(tài)的影響

未處理的A549細胞為不規(guī)則多邊形、細胞結(jié)合緊密，卡巴膽堿處理后A549細胞形態(tài)逐漸向梭形轉(zhuǎn)化，細胞間結(jié)合松散。提示卡巴膽堿激活M3R可能會引起肺癌A549細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，見圖1。

Figure 1.The effects of carbachol on the morphological changes of lung cancer A549 cells (×400).
圖1卡巴膽堿對肺癌A549細胞形態(tài)的影響

2　卡巴膽堿能促進肺癌A549細胞遷移和侵襲

400 μmol/L卡巴膽堿處理24 h后發(fā)現(xiàn)，卡巴膽堿組劃痕愈合率及穿膜細胞數(shù)量明顯多于空白對照組(P<0.05)，見圖2、3。

Figure 2.Carbachol promoted the migration ability of lung cancer A549 cells (×200).Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.
圖2卡巴膽堿促進A549細胞遷移

Figure 3.Carbachol promoted the invasion ability of lung cancer A549 cells (×100).Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.
圖3卡巴膽堿促進A549肺癌細胞侵襲能力

3　卡巴膽堿升高A549細胞vimentin表達水平并降低E-cadherin表達水平

qPCR及western blot結(jié)果顯示，與空白對照組相比，經(jīng)400 μmol/L卡巴膽堿處理72 h后，A549細胞的vimentin mRNA和蛋白表達量明顯增加(P<0.05)，而E-cadherin的mRNA和蛋白表達量明顯降低(P<0.05)；卡巴膽堿+ 4-DAMP組vimentin的mRNA和蛋白表達較卡巴膽堿組明顯減少(P<0.05)，相反，E-cadherin的mRNA和蛋白表達量較卡巴膽堿組明顯增加(P<0.05)。說明卡巴膽堿能促進vimentin的mRNA和蛋白表達并抑制E-cadherin的mRNA和蛋白表達，4-DAMP可以逆轉(zhuǎn)卡巴膽堿的作用，見圖4、5。

4　卡巴膽堿能夠引起AKT磷酸化水平增加

Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)400 μmol/L卡巴膽堿處理72 h后，A549細胞中磷酸化的AKT蛋白含量較空白對照組明顯增加(P<0.05)，卡巴膽堿+ 4-DAMP組的磷酸化AKT蛋白表達較卡巴膽堿組明顯減少(P<0.05)，卡巴膽堿+ 4-DAMP相對空白對照組的磷酸化AKT無明顯變化,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明卡巴膽堿能促進磷酸化AKT蛋白表達，4-DAMP可以抑制卡巴膽堿的作用，見圖6。

Figure 4.The mRNA expression of vimentin and E-cadherin in human A549 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vscarbachol group.
圖4qPCR檢測A549肺癌細胞vimentin和E-cadherinmRNA的變化

Figure 5.The protein expression of vimentin and E-cadherin in lung cancer A549 cells determined by Western blot.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vscarbachol group.
圖5肺癌細胞A549vimentin和E-cadherin蛋白水平的變化

Figure 6.The protein level of p-AKT/AKT in the lung cancer A549 cells was determined by Western blot.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vscarbachol group.
圖6肺癌細胞A549AKT磷酸化水平的變化

討　　論

近些年來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤能夠自主合成并分泌乙酰膽堿，與膽堿能受體結(jié)合后構(gòu)成“非神經(jīng)源性膽堿能系統(tǒng)”。非神經(jīng)源性膽堿能系統(tǒng)在刺激血管生成、上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變和腫瘤促進中發(fā)揮重要作用[8]。 M3R是膽堿能受體家族中毒蕈堿膽堿受體的一員，已被證實在多種腫瘤中有高表達，并且與肺癌[5]、胃癌[6]和結(jié)腸癌[9]等多種腫瘤發(fā)生和進展密切相關(guān)。

轉(zhuǎn)移是造成腫瘤疾病相關(guān)死亡的主要因素，現(xiàn)在認為EMT是上皮來源的惡性腫瘤細胞在腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵事件[10]。EMT是指上皮細胞向具有間質(zhì)細胞表型特征轉(zhuǎn)化的生物學(xué)進程。在EMT過程中，上皮細胞原有結(jié)構(gòu)改變，極性喪失，細胞間緊密連接的黏附力減弱，基底膜的破壞和細胞骨架的重建等變化使細胞的遷移和侵襲能力增強[11]。EMT最主要的分子特征表現(xiàn)為上皮細胞標(biāo)記物表達降低，間質(zhì)細胞標(biāo)志物vimentin表達升高[12]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)用M3R激動劑卡巴膽堿刺激A549細胞后，細胞形態(tài)向梭形轉(zhuǎn)化，細胞遷移和侵襲能力增強，上皮細胞標(biāo)記物E-cadherin表達降低而vimentin明顯增高，表明這些A549細胞發(fā)生EMT，并出現(xiàn)EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)移。

PI3K/AKT是細胞內(nèi)重要的信號通路之一，參與調(diào)控多種重要的生物學(xué)，且與多種腫瘤的發(fā)生進展密切相關(guān)[13]。PI3K能引起AKT磷酸化的激活，使磷酸化AKT的蛋白表達增加，進而調(diào)控下游的各種分子的活性[14]。在腫瘤進展過程中，PI3K/AKT通路的激活在肺癌[4]、乳腺癌[15]和胃癌[16]等多種腫瘤的EMT過程中發(fā)揮重要作用。磷酸化AKT可通過直接上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子表達或間接促進金屬蛋白酶表達等多種途徑降低E-cadherin表達，引起EMT進程，使腫瘤細胞的侵襲能力增強[17]。本研究結(jié)果表明，M3R激動劑卡巴膽堿能夠激活A(yù)549細胞的PI3K/AKT通路，使AKT磷酸化蛋白增加，促進A549細胞的EMT。

綜上所述，激動M3R可通過激活PI3K/AKT信號通路促進A549細胞的EMT。但是否還存在另外的信號通路與PI3K/AKT信號通路協(xié)同或交叉，或獨立地促進A549的EMT進程，還需進一步實驗探索。

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