黃芩素抑制胃癌MGC-803細(xì)胞增殖和遷移*

孫沛林，樸日龍，王　瑩，任香善，陳麗艷，林貞花，樸英實(shí)△

(1延邊大學(xué)腫瘤研究中心，2吉林省婦科腫瘤生物信息學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，吉林 延邊 133000)

胃癌是全世界最常見的消化道腫瘤之一，在中國、日本和韓國等這些亞洲國家具有較高的發(fā)病率[1]。胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程，其發(fā)病原因分為先天性因素和后天性因素，包括幽門螺桿菌感染、遺傳和分子水平的變化等[1-2]，這些因素促使正常胃黏膜上皮細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒约?xì)胞。目前手術(shù)切除是治療胃癌的主要方法[3]，但由于胃癌早期的癥狀不典型，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，從而失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。即使輔助化療和放療，胃癌患者的生活質(zhì)量有所提高，但在我國五年生存率仍低于40%[3]。因此，胃癌急需尋找更為低毒、高效、多靶點(diǎn)的治療方法。

黃芩素(baicalein，BAI)是黃芩根部提取的類黃酮，作為血小板型12-脂氧合酶(platelet-type 12-lipoxygenase，p12-LOX)選擇性抑制劑被廣泛應(yīng)用于疾病研究，具有抗過敏、抗炎、改善腦血循環(huán)和抗腫瘤等作用[4]。BAI具有高效、低毒的優(yōu)點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，BAI可抑制乳腺癌、肝癌及胃癌等腫瘤細(xì)胞的增殖[5-8]。黃芩素不會(huì)導(dǎo)致染色體的異常和突變，在化療時(shí)沒有嚴(yán)重的副作用，是一種安全的潛在藥物[5]，但尚未見BAI對人胃癌MGC-803細(xì)胞影響的研究報(bào)道。

本研究旨在明確BAI對MGC-803細(xì)胞增殖和遷移的影響，探討該作用的可能機(jī)制，為抗腫瘤藥物黃芩素的開發(fā)應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材　料　和　方　法

1　細(xì)胞株

人胃癌MGC-803細(xì)胞由延邊大學(xué)腫瘤研究所提供，購自美國模式培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。

2　主要試劑

BAI購自Cayman Chemical；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶-EDTA消化液均購自Gibco；MTT和DMSO購自Amrosco；ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；磷酸酶抑制劑購自Calbiochem；RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG (H+L)(1∶1 000)和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG (H+L)(1∶1 000)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶1 000)和兔抗人p-ezrin單克隆抗體(1∶2 000)購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；兔抗人血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)單克隆抗體(1∶2 000)購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；鼠抗人p12-LOX多克隆抗體(1 mg/L)和兔抗人vimentin單克隆抗體(1∶5 000)均購自Abcam；鼠抗人E-cadherin單克隆抗體(1∶1 000)和兔抗人Snail單克隆抗體(1∶1 000)均購自Cell Signaling。

3　主要方法

3.1藥品配制BAI用DMSO溶解配制并-20 ℃避光保存。MTT溶液用PBS緩沖液稀釋成5 g/L溶液，-20 ℃避光儲(chǔ)存。

3.2細(xì)胞培養(yǎng)MGC-803細(xì)胞接種于RMPI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素)中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對照組(control)和藥物組(即BAI組)。

3.3MTT比色法取對數(shù)生長期細(xì)胞常規(guī)消化并以每孔2×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜，次日添加BAI至終濃度分別為5、10、15、25和50 μmol/L，對照組(BAI 0 μmol/L)加入與BAI同等體積的DMSO。培養(yǎng)12、24和48 h時(shí)每孔加入20 μL的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清后每孔加入100 μL的DMSO，用M200全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Tecan)測定各孔吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

3.4平板集落形成實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期細(xì)胞常規(guī)消化，梯度稀釋并每孔接種100個(gè)細(xì)胞于6孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，不同濃度BAI連續(xù)處理1周。冷PBS緩沖液清洗3次，每孔加入2 mL無水甲醇固定5 min，伊紅染色液搖床染色10 min，自來水清洗進(jìn)行脫色，自然晾干，顯微鏡下觀察、拍照并用ImageJ軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)分析。

3.5劃痕實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期細(xì)胞常規(guī)消化，并每孔接種2×105個(gè)細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)至形成單層細(xì)胞后換無血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)4 h，沿培養(yǎng)板底部正中間劃“一”字型劃痕，用PBS緩沖液沖洗脫落細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為對照組和藥物組，加藥后培養(yǎng)0、24和48 h時(shí)用生物倒置顯微鏡(Olympus)觀察并拍照，用ImageJ軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)算橫向遷移距離(μm)=0 h邊緣距離-nh邊緣距離。

3.6Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期細(xì)胞常規(guī)消化，按每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種于Transwell小室，上、下室均加入含1% 胎牛血清的培養(yǎng)液孵育4 h，棄下室1% 胎牛血清的培養(yǎng)液，加入含10% 胎牛血清和BAI的新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，4%多聚甲醛4 ℃靜置20 min固定細(xì)胞，0.1%蘇木素染色8 min，自來水反藍(lán)，無水乙醇浸泡3 min，中性樹干膠封片，拍照并用IamgeJ軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析。

3.7Western blot實(shí)驗(yàn)細(xì)胞蛋白提取后進(jìn)行定量，配制SDS-PAGE凝膠，樣本上樣并電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，I 抗孵育過夜，II抗孵育2 h，ChemiDoc成像系統(tǒng)(Bio-Rad)進(jìn)行ECL曝光成像。

3.8酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期細(xì)胞常規(guī)消化，按每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，次日加入終濃度為5、15和25 μmol/L的BAI，對照組加入與BAI組同等濃度DMSO的等體積培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞儲(chǔ)存于4 ℃。按12-羥基二十碳四烯酸(12-hydroxyeicosatetraenoic acid，12-HETE)ELISA試劑盒說明書操作，用M200全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Tecan)在450 nm處測定各孔的吸光度(A)值。用Curve Expert 1.4軟件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算樣品的12-HETE濃度。

4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究中所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次以上。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1　BAI抑制胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖

用不同濃度的BAI處理胃癌MGC-803細(xì)胞后進(jìn)行MTT檢測,結(jié)果顯示，分別使用10 μmol/L、15 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L的BAI處理MGC-803細(xì)胞24 h和48 h均可明顯抑制細(xì)胞的存活率(P<0.01)，見表1。分別使用5 μmol/L、15 μmol/L和25 μmol/L的BAI處理MGC-803細(xì)胞48 h，可顯著下調(diào)p12-LOX和VEGF蛋白的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)，見圖1A。用5 μmol/L、15 μmol/L和25 μmol/L的BAI處理MGC-803細(xì)胞24 h的ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的BAI均可顯著下調(diào)細(xì)胞中12-HETE的濃度(P<0.05或P<0.01)，見圖1B。用5 μmol/L、15 μmol/L和25 μmol/L的BAI處理MGC-803細(xì)胞，也可顯著抑制平板集落形成(P<0.01)，見圖2。

表1BAI對MGC-803胃癌細(xì)胞存活率的影響
Table 1.The effect of BAI on the viability of the gastric cancer MGC-803 cells (%.Mean±SD.n=5)

BAI(μmol/L)12h24h48h099．98±2．76100．00±2．89100．01±0．32598．94±3．9898．55±3．72?100．84±1．881092．46±1．3682．61±4．19??83．24±4．96??1592．59±2．3577．21±1．82??76．55±3．20??2593．24±1．2768．73±0．68??64．71±2．58??5092．61±1．2560．52±2．08??57．65±0．39??

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

Figure 1.The effects of BAI on the protein expression ofp12-LOX and VEGF (A) and the concentration of 12-HETE (B) in the gastric cancer MGC-803 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.
圖1BAI對MGC-803胃癌細(xì)胞p12-LOX、VEGF蛋白表達(dá)和12-HETE濃度的影響

Figure 2.The effect of BAI on colony formation ability of the MGC-803 cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.
圖2BAI對MGC-803細(xì)胞集落形成能力的影響

2　BAI抑制胃癌MGC-803細(xì)胞的遷移

用5 μmol/L、15 μmol/L和25 μmol/L的BAI分別處理MGC-803細(xì)胞24 h和48 h，可顯著抑制細(xì)胞的橫向遷移(P<0.01)，見圖3A。25 μmol/L BAI還可顯著抑制細(xì)胞的縱向遷移能力(P<0.01)，見圖3B。用5 μmol/L、15 μmol/L和25 μmol/L的BAI處理MGC-803細(xì)胞48 h，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，p-ezrin、vimentin和Snail的蛋白水平顯著降低(P<0.01)，而E-cadherin的蛋白水平則顯著升高(P<0.01)，見圖4。

Figure 3.The effect of BAI on the migration ability of the MGC-803 cells.A:wound-healing assay (×100).B:Transwell assay (×200).Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.
圖3BAI對MGC-803細(xì)胞遷移能力的影響

討　　論

近年來胃癌的發(fā)病率和死亡率在我國乃至全世界都呈現(xiàn)增高的趨勢，其發(fā)生與細(xì)胞的異常分化、增殖及遷移等密切相關(guān)。胃癌的發(fā)生發(fā)展與花生四烯酸(arachidonic acid，AA)的代謝途徑有著密切關(guān)系。AA代謝包括環(huán)氧化酶途徑、細(xì)胞色素P450氧酶途徑和脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)3條主要途徑。12-LOX包括白細(xì)胞型、血小板型(p12-LOX)和表皮型3種主要類型，在正常組織中12-LOX不表達(dá)或者低表達(dá)，但在睪丸癌、前列腺癌和乳腺癌中高表達(dá)[9-11]。有研究發(fā)現(xiàn)，p12-LOX與黑色素瘤細(xì)胞有著緊密的聯(lián)系[12]。而最近的研究也表明，p12-LOX以及其催化產(chǎn)物12-HETE在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生成因子的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成等[13-14]。作為p12-LOX的選擇性抑制劑BAI具有廣泛的抗腫瘤作用而備受關(guān)注[13-16]。研究表明，10 μmol/L和25 μmol/L的BAI通過降低前列腺癌細(xì)胞的p12-LOX的表達(dá)抑制了細(xì)胞增殖[16]；BAI還可抑制小鼠上皮JB6 P+(Cl 41-5a)細(xì)胞p12-LOX的mRNA和蛋白表達(dá)水平，并抑制其細(xì)胞增殖[13]；p12-LOX高表達(dá)于胃癌MKN-28細(xì)胞，BAI處理MKN-28細(xì)胞可顯著降低p12-LOX的mRNA表達(dá)，并顯著抑制了細(xì)胞增殖[15]。

Figure 4.The effects of BAI on the protein levels of p-ezrin and EMT-related proteins in the MGC-803 cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.
圖4BAI對MGC-803細(xì)胞p-Ezrin和EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

血管形成是腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，其中VEGF是重要的血管內(nèi)皮生長因子，在腫瘤組織中高表達(dá)[17]。研究表明，BAI可抑制人前列腺癌PC-3細(xì)胞中VEGF的表達(dá)[17]。張偉等[18]研究發(fā)現(xiàn)，BAI呈劑量依賴性抑制人胃癌SGC-7901中VEGF的表達(dá)。本研究結(jié)果也顯示，BAI顯著下調(diào)胃癌MGC-803細(xì)胞的p12-LOX、12-HETE和VEGF蛋白的表達(dá)水平，顯著抑制了細(xì)胞增殖和集落形成。以上結(jié)果均提示，BAI可能通過下調(diào)p12-LOX的表達(dá)，使其催化產(chǎn)物12-HETE合成減少，抑制了VEGF的表達(dá)，從而抑制了胃癌細(xì)胞的增殖。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在胚胎發(fā)育、纖維化和腫瘤等的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用[19-21]。在EMT過程中，上皮標(biāo)志物E-cadherin合成減少[22]，具有上皮細(xì)胞表型的細(xì)胞角蛋白細(xì)絲被vimentin代替，使細(xì)胞的形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮?。鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，Snail過表達(dá)可使癌細(xì)胞失去黏附，從而促進(jìn)腫瘤的浸潤與遷移[23]。Liu等[24]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞中E-cadherin的下調(diào)增加了細(xì)胞的存活和轉(zhuǎn)移。Fuyuhire等[25]的研究表明，vimentin的高表達(dá)與胃癌晚期臨床分期有著直接關(guān)系。本研究結(jié)果也顯示，BAI顯著抑制MGC-803細(xì)胞的橫向和縱向遷移能力，同時(shí)BAI處理可上調(diào)上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白的表達(dá)，而下調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物vimentin和Snail蛋白的表達(dá)。結(jié)果提示，BAI通過調(diào)控EMT相關(guān)蛋白表達(dá)有效地抑制MGC-803細(xì)胞的遷移能力。

Ezrin蛋白是細(xì)胞骨架與細(xì)胞膜之間的連接蛋白[26]。在正常組織中，ezrin蛋白廣泛的分布在上皮細(xì)胞[27]。Ezrin活化時(shí)連接細(xì)胞膜與肌動(dòng)蛋白絲，具有形成細(xì)胞形態(tài)、黏附、運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞增殖等多種功能[28]。Ezrin過表達(dá)及磷酸化ezrin能將E-cadherin阻隔于細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞之間連接松散，利于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[26]。Jin等[29]研究表明，ezrin過表達(dá)于胃癌組織并與不良預(yù)后密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，BAI處理MGC-803細(xì)胞可顯著下調(diào)p-ezrin蛋白表達(dá)水平，提示BAI通過下調(diào)p-ezrin蛋白的表達(dá)抑制MGC-803細(xì)胞的遷移。

綜上所述，在本研究中我們證明了p12-LOX的選擇性抑制劑BAI可有效抑制胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖和遷移，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)p12-LOX、VEGF、p-ezrin以及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)變化有關(guān)。研究結(jié)果提示，中藥有效成分BAI可能是治療胃癌的有效抗腫瘤藥物。

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