PRRX2通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞活力和遷移*

王　倩，陳冬玲，張瓅方，2，卞　華△

(南陽理工學(xué)院 1張仲景國醫(yī)國藥學(xué)院，2河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點實驗室，河南 南陽 473004)

隨著人類社會的發(fā)展以及生活水平的提高，胃癌的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢，目前世界范圍內(nèi)胃癌發(fā)病率居所有腫瘤第4位，死亡率居所有惡性腫瘤的第3位[1-3]。近年來，盡管醫(yī)療技術(shù)不斷進(jìn)步，但胃癌致死率仍然居高不下[4-6]，嚴(yán)重威脅著人類的健康。目前，針對胃癌的治療，除了傳統(tǒng)手術(shù)治療、放射治療和化療外，新型的腫瘤分子靶向治療也越來越展現(xiàn)出令人欣喜的發(fā)展前景。因此，尋找合適的胃癌治療分子靶標(biāo)是目前研究的熱點。

胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中常常伴隨著抑癌基因的失活或癌基因的激活，以及各種信號通路的功能紊亂。盡管配對相關(guān)同源框2(paired-related homeobox 2，PRRX2)基因很早就被研究人員所發(fā)現(xiàn)[7]，然而其與人類疾病的相關(guān)研究并不充分。目前，關(guān)于PRRX2與腫瘤的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，PRRX2可能與前列腺癌[8]、乳腺癌[9]、食管鱗癌[10]和白血病[11]等腫瘤相關(guān)。有研究顯示，PRRX2可能與轉(zhuǎn)移性胃癌相關(guān)[12]，但是其在胃癌的發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究中，我們將PRRX2小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)和過表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到胃癌細(xì)胞MGC-803和SGC-7901中，敲低和過表達(dá)PRRX2基因，研究其對于胃癌細(xì)胞活力和遷移能力的影響，并分析PRRX2對Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控作用，初步探討相關(guān)分子機(jī)制，為尋找胃癌治療相關(guān)的分子靶點提供理論依據(jù)。

材　料　和　方　法

1　細(xì)胞和試劑

胃癌細(xì)胞系MGC-803購自ATCC；SGC-7901細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；抗PRRX2、β-catenin、c-Myc、cyclin D1和GAPDH I抗以及HRP標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗均購自ProteinTech；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamine 3000(Invitrogen)；胰蛋白酶(索萊寶生物科技有限公司)；MTT細(xì)胞活力檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；Transwell小室(Corning)；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco)；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒Dual-Luciferase? Reporter Assay System(Promega)；Protein A/G瓊脂糖珠(Santa Cruz)；空載體pFlag-NC和pHA-NC均購Sigma；pFlag-PRRX2和pHA-β-catenin質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建，且通過測序驗證。

2　方法

2.1PRRX2 siRNA的合成在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索人PRRX2基因序列(GenBank:BC014645.1)，按照siRNA設(shè)計原則，設(shè)計3條siRNA序列，并交由上海吉瑪公司合成PRRX2小干擾RNA(siR-PRRX2)，以及陰性對照siR-NC，見表1。

表1　PRRX2 siRNA引物序列Table 1.The primer sequences of PRRX2 siRNA

F:forward； R:reverse.

2.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的恒溫條件下培養(yǎng)MGC-803細(xì)胞和SGC-7901細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長至80%～90%匯合度時，用胰蛋白酶消化后傳代至60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，待細(xì)胞生長至60%匯合度時，按照Lipofectamine 3000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2.3MTT實驗檢測細(xì)胞活力收集對數(shù)期細(xì)胞接種到96孔板，使待測細(xì)胞密度至每孔5 000個細(xì)胞左右時轉(zhuǎn)染相應(yīng)的質(zhì)粒和空載體，每組設(shè)3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，設(shè)置培養(yǎng)時間0、24和48 h；培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10 μL MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h；終止培養(yǎng)，小心除去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，在搖床上低速振蕩10 min，于570 nm波長下檢測吸光度(A)值。

2.4Transwell實驗檢測遷移能力細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用胰蛋白酶消化并用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按每孔1×106個細(xì)胞接種到Transwell小室中(每孔200 μL)，上層小室為不含血清的細(xì)胞懸液，下層為500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)36 h后棄去上層小室和下層孔內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS清洗小室3次，然后用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫溶液染色10 min，用PBS清洗小室3次，通過顯微鏡觀察拍照。

2.5TOPflash/FOPflash雙螢光素酶報告基因?qū)嶒瀸GC-7901細(xì)胞按每孔5 000個細(xì)胞的密度接種到96孔板中，實驗分組為pFlag-PRRX2+TOP+pRL-TK(海腎螢光素酶報告基因載體)組、pFlag-PRRX2+FOP+pRL-TK組、pFlag-NC+TOP+pRL-TK組和pFlag-NC+FOP+pRL-TK組，按照上述分組轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒到SGC-7901細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞按Dual-Luciferase? Reporter Assay System試劑盒說明書操作，記錄并分析數(shù)據(jù)。

2.6蛋白免疫共沉淀實驗將SGC-7901細(xì)胞接種到100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，實驗分組為 pFlag-PRRX2+pHA-β-catenin組和pFlag-NC+pHA-β-catenin組，按上述分組轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒到SGC-7901細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞并加入細(xì)胞裂解液，放置冰上裂解10 min，4 ℃、12 000×g離心10 min后取上清液，分別加入相應(yīng)抗體，4 ℃孵育1 h，每管加入15～20 μL Protein A/G瓊脂糖珠，4 ℃孵育過夜，再以4 ℃、3 000 r/min離心5 min，棄去上清液，再用細(xì)胞裂解液輕柔洗滌沉淀中的Protein A/G瓊脂糖珠3次，最后加入蛋白上樣緩沖液，沸水煮蛋白5 min，通過Wes-tern blot檢測目的蛋白，確定結(jié)合蛋白。

2.7Western blot收集各組細(xì)胞，利用RIPA裂解液裂解并用超聲波破碎。通過BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度。將40 μg各組蛋白通過SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)印到PVDF膜(Millipore)上。然后使用5%脫脂奶粉在室溫下封閉膜1 h。封閉后，分別將膜與抗PRRX2、β-catenin、c-Myc和cyclin D1(均1∶1 000倍稀釋)Ⅰ抗及內(nèi)參照GAPDH(1∶5 000倍稀釋)抗體4 ℃孵育過夜。用TBST緩沖液洗滌膜后，將膜與相應(yīng)的相應(yīng)Ⅱ抗在室溫作用1 h。最后，將膜用TBST洗滌3次，并使用BeyoECL Plus試劑盒通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影。

3　統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。PRRX2在胃癌和正常胃組織中的表達(dá)水平差異分析采用t檢驗；PRRX2敲低或過表達(dá)組與對照組之間的比較采用兩獨立樣本t檢驗。PRRX2與Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵因子(WNT2、WNT3、AXIN1、CTNNB1、DVL1、DVL2、DVL3、GSK3β和CCND1)的相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)分析法；用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗分析PRRX2表達(dá)水平與患者術(shù)后總生存率的關(guān)系，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

1　PRRX2在胃癌組織和正常胃上皮組織中的表達(dá)水平及其在胃癌組織中的表達(dá)與胃癌患者總生存率的相關(guān)性

通過Oncomine、GEPIA和UCSC Cancer Browser數(shù)據(jù)庫分析胃癌和正常胃上皮組織中PRRX2的mRNA表達(dá)水平和DNA拷貝數(shù)的差異，結(jié)果顯示，與正常胃上皮組織相比，胃癌組織中PRRX2的mRNA表達(dá)水平及DNA拷貝數(shù)均增加(P<0.05)。另外，通過Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫分析顯示，PRRX2的mRNA表達(dá)水平與胃癌患者的總生存率呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The mRNA level (A～C) and DNA copy number (D) were analyzed by bioinformatics in Oncomine,UCSC Cancer Browser and GEPIA databases.The correlation of PRRX2 expression with gastric cancer patients’ overall survival probability was analyzed in Kaplan-Meier plotter database (E).*P<0.05vsgrastric adenocarcinoma.
圖1生物信息學(xué)分析PRRX2在胃癌和正常組織中的表達(dá)水平及其在胃癌組織中的表達(dá)與胃癌患者總生存率的相關(guān)性

2　過表達(dá)和敲低PRRX2對胃癌細(xì)胞活力的影響

MTT結(jié)果顯示過表達(dá)PRRX2能夠增加SGC-7901細(xì)胞的活力(P<0.05)；在MGC-803細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染靶向PRRX2的3個siRNA和陰性對照siR-NC，結(jié)果顯示敲低PRRX2能夠抑制MGC-803細(xì)胞的活力(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The effests of over-expression ofPRRX2 in the SGC-7901 cells (A) and knockdown ofPRRX2 in the MGC-803 cells (B) on cell activity.Mean±SD.n=3.*P<0.05vspFlag-NC；#P<0.05vssiR-NC.
圖2PRRX2對胃癌細(xì)胞活力的影響

3　過表達(dá)和敲低PRRX2對胃癌細(xì)胞遷移能力的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示過表達(dá)PRRX2能夠增加SGC-7901細(xì)胞的遷移能力(P<0.05)；敲低PRRX2能夠抑制MGC-803細(xì)胞的遷移能力(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The effects of over-expression ofPRRX2 in the SGC-7901 cells (A) and knockdown ofPRRX2 in the MGC-803 cells (B) on the cell migration ability (×200).Mean±SD.n=3.*P<0.05vspFlag-NC；#P<0.05vssiR-NC.
圖3PRRX2對胃癌細(xì)胞遷移能力的影響

4　生物信息學(xué)分析PRRX2與Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵因子的相關(guān)性

通過GEPIA網(wǎng)站關(guān)聯(lián)性分析顯示，PRRX2與Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵因子，如WNT2、WNT3、AXIN1、CTNNB1(β-catenin)、DVL1、DVL2、DVL3、GSK3β和CCND1(cyclin D1)顯著相關(guān)(P<0.05)，提示 PRRX2與Wnt/β-catenin信號通路可能存在密切關(guān)系，見圖4。

5　過表達(dá)和敲低PRRX2對Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測顯示，過表達(dá)PRRX2能夠顯著增加Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白β-catenin、c-Myc和cyclin D1的蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，激活Wnt/β-catenin信號通路；敲低PRRX2能夠顯著降低Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白β-catenin、c-Myc、cyclin D1的蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，抑制Wnt/β-catenin信號通路，見圖5。

Figure 4.The correlations of PRRX2 with WNT2,WNT3,AXIN1,CTNNB1 (β-catenin),DVL1,DVL2,DVL3,GSK3β and CCND1 (cyclin D1) analyzed in GEPIA database.
圖4生物信息學(xué)分析PRRX2與Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵因子的相關(guān)性

6　過表達(dá)PRRX2對Wnt/β-catenin信號通路活性的影響

通過TOPflash/FOPflash雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測PRRX2對Wnt/β-catenin信號通路活性的影響。結(jié)果顯示，過表達(dá)PRRX2能夠顯著增加TOPflash報告基因活性(P<0.05)，提示過表達(dá)PRRX2能夠顯著激活Wnt/β-catenin信號通路，見圖6。

7　胃癌細(xì)胞中PRRX2與β-catenin蛋白存在相互作用

在胃癌細(xì)胞SGC-7901中共轉(zhuǎn)染pflag-PRRX2和pHA-β-catenin質(zhì)粒，通過蛋白免疫共沉淀實驗檢測PRRX2與β-catenin蛋白之間的相互作用情況，結(jié)果顯示胃癌細(xì)胞中PRRX2和β-catenin存在相互作用，見圖7。

討　　論

胃癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，由于診斷技術(shù)以及健康意識等原因，胃癌患者在出現(xiàn)癥狀并確診時，大部分已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，即使能夠通過手術(shù)治療，但是術(shù)后五年生存率仍然很低[13]。PRRX2在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚，我們通過多種生物信息學(xué)技術(shù)分析了PRRX2與胃癌的相關(guān)性，結(jié)果顯示PRRX2在胃癌組織中的mRNA表達(dá)水平明顯增高，DNA拷貝數(shù)增加，更加重要的是，PRRX2的表達(dá)水平與胃癌患者的總生存率呈負(fù)相關(guān)，提示PRRX2可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著癌基因的作用。

研究顯示，PRRX2在乳腺癌組織中的表達(dá)水平明顯升高，作為乳腺上皮細(xì)胞中的新型TGF-β誘導(dǎo)因子，其表達(dá)上調(diào)能夠增強(qiáng)乳腺細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的發(fā)生[9]。另外，PRRX2的致癌作用涉及急性骨髓性白血病的發(fā)生，其中易位是由核蛋白基因NUP98和PRRX2的融合介導(dǎo)的[11]。通過分析轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性胃癌組織的轉(zhuǎn)錄組差異，PRRX2被確定為轉(zhuǎn)移性胃癌的特異性轉(zhuǎn)錄因子[12]，但是其作用機(jī)制不明。同樣地，食管鱗癌的相關(guān)測序分析也提示PRRX2可能參與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展[10]。另外，研究人員通過分析前列腺癌組織和配對的正常組織發(fā)現(xiàn)，PRRX2表達(dá)差異顯著，可作為鑒別前列腺癌的生物標(biāo)志物[8]。

Figure 5.The effects of over-expression ofPRRX2 in the SGC-7901 cells (A) and knockdown of PRRX2 in the MGC-803 cells (B) on protein expression of Wnt/β-catenin signal pathway.Mean±SD.n=3.*P<0.05vspFlag-NC;#P<0.05vssiR-NC.
圖5PRRX2對Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Figure 6.Over-expression ofPRRX2 enhanced the activity of TOPflash/FOPflash dual-luciferase reporter gene in the SGC-7901 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vspFlag-NC.
圖6PRRX2對Wnt/β-catenin信號通路活性的影響

Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，其過度激活能夠促進(jìn)其靶基因，如c-myc和cyclin D1等的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移，而抑制其活性則可降低細(xì)胞的增殖和遷移能力[14-15]。在胃癌研究中發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路抑制因子SFRP2因高甲基化導(dǎo)致的表達(dá)水平降低可引起Wnt/β-catenin信號通路持續(xù)異常激活，促進(jìn)c-Myc、cyclin D1及survivin過度表達(dá)，引起細(xì)胞過度增殖及凋亡減弱，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生[16]。在另一項研究中也發(fā)現(xiàn)胃癌和癌前病變組織中存在Wnt/β-catenin信號通路靶基因c-myc等的表達(dá)水平差異[17]。在本研究中，我們通過在胃癌細(xì)胞中敲低和過表達(dá)PRRX2基因，發(fā)現(xiàn)PRRX2過表達(dá)或敲低能夠增加或減弱胃癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，同時能夠激活或抑制Wnt/β-catenin信號通路，因此，我們推測在胃癌細(xì)胞中PRRX2表達(dá)上調(diào)可通過激活Wnt/β-catenin信號通路，促進(jìn)靶基因c-myc和cyclin D1等經(jīng)典癌基因的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。

Figure 7.PRRX2 interacted with β-catenin in SGC-7901 cells.
圖7胃癌細(xì)胞中PRRX2與β-catenin蛋白存在相互作用

為了進(jìn)一步探討PRRX2對于Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控機(jī)制，我們通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)PRRX2與β-catenin蛋白可能存在相互作用。接下來，我們通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀實驗初步驗證了以上的預(yù)測。而更進(jìn)一步地探討PRRX2和β-catenin蛋白的具體結(jié)合位點以及調(diào)控機(jī)制將是我們接下來研究的重點。

綜上所述，本研究首先通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)胃癌組織和正常胃上皮組織中PRRX2的表達(dá)水平存在差異，而且其表達(dá)水平與胃癌患者的總生存率呈負(fù)相關(guān)。繼而，我們通過細(xì)胞生物學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，PRRX2能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長和遷移能力，而這種作用可能與Wnt/β-catenin信號通路的激活密切相關(guān)。這些結(jié)果提示PRRX2可能作為癌基因參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，并可能成為一種新的胃癌診斷和判斷預(yù)后的標(biāo)志物以及治療靶點。

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