精胺上調(diào)大鼠心肌缺血再灌注時beclin-1的表達*

董　杰，劉振華，韓麗萍

(溫州醫(yī)科大學(xué)低氧醫(yī)學(xué)研究所，浙江 溫州 325035)

心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)損傷是導(dǎo)致諸如中風(fēng)和心肌梗死等疾病發(fā)病和致死的主要原因。盡管溶栓藥物或經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術(shù)(percutaneous coronary intervention，PCI)等臨床治療成功使得阻塞的血管再通，但仍有很多問題待解決[1]。數(shù)據(jù)顯示，血管再通后，無復(fù)流(no-reflow，NR)現(xiàn)象發(fā)生率可達50%[2]。缺血再灌注后的無復(fù)流現(xiàn)象既是心肌損傷、梗死延展的標(biāo)志，也是心室重構(gòu)和心功能障礙的預(yù)測指標(biāo)[3]。精胺(spermine，SP)屬脂肪胺類小分子化合物，廣泛分布在幾乎所有原核及真核生物的組織細胞內(nèi)，在細胞增長、增殖和分化方面發(fā)揮重要作用。Madeo等[4]的報道提出，精胺可在培養(yǎng)的酵母細胞、多種哺乳動物細胞、線蟲以及果蠅體內(nèi)誘導(dǎo)自噬發(fā)生，并延長細胞壽命。自噬(分為基礎(chǔ)自噬和誘導(dǎo)自噬)是真核細胞中進化上高度保守的、用于降解和回收利用細胞內(nèi)生物大分子和受損細胞器的過程，而誘導(dǎo)自噬是各種應(yīng)激狀態(tài)下的自我保護機制。我們之前的在體研究發(fā)現(xiàn)結(jié)扎大鼠冠狀動脈左室前降支30 min后，再灌注數(shù)小時可使多胺代謝失衡，精胺和精脒減少[5]，因此我們推測外源性補充精胺可能通過在缺血/再灌注中誘導(dǎo)自噬而發(fā)揮心肌保護作用，進而防止或減輕無復(fù)流現(xiàn)象。故本實驗給予再灌注大鼠外源性精胺，觀察其是否具有保護心肌、減輕無復(fù)流的作用，并通過測定beclin-1表達來探討該作用機制是否與誘導(dǎo)自噬相關(guān)。

材　料　和　方　法

1　動物

SD大鼠由溫州醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，合格證編號為SCXK(京)2016-0011，體重(240±20)g,雌雄不拘，按體重從大到小排序，按隨機數(shù)字表法分為3組：假手術(shù)對照組(control 組)、缺血-再灌注組(IR組)和精胺干預(yù)組(IR+SP組)，每組10只。

2　主要試劑

精胺(Sigma)； thilflavin S(Bioluminor)； Evans blue (Abcam)； TTC染液(南京建成生物公司)；大鼠肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB)、心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)和髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)試劑盒均購自R&D；Western blotting細胞裂解液(Beyotime)；抗GAPDH抗體和抗beclin-1抗體(Santa Cruz)。

3　主要方法

3.1大鼠心肌缺血再灌注模型的制備1% 戊巴比妥鈉35～40 mg/kg腹腔注射以麻醉大鼠，切開氣管，連接呼吸機輔助呼吸。開胸暴露心臟，剪開心包，于冠狀動脈左室前降支離左心耳下緣約0.15 cm處繞左室支穿線結(jié)扎，缺血30 min后剪開結(jié)扎線，再灌注60 min，造成心肌缺血-再灌注損傷。術(shù)中連續(xù)監(jiān)視ECG Ⅱ?qū)?lián)的變化，以ST段明顯抬高為結(jié)扎成功(心肌缺血)的指標(biāo)，剪開結(jié)扎線后ST 段下降1/2 以上表明復(fù)灌成功。缺血再灌注組不做其它處理；精胺干預(yù)組于再灌注前15 min時尾靜脈注射 0.5 mmol/L 精胺 (2 mL/kg)；假手術(shù)組實施開胸手術(shù)并穿線，但不結(jié)扎。

3.2各組大鼠心律失常發(fā)生率的測量采用標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)連續(xù)監(jiān)測各組大鼠心電圖變化，重點觀察室性心動過速(ventricular tachycardia，VT)、室性纖維顫動(ventricular fibrillation，VF)、室性異位節(jié)律(ventricular ectopic beats，VEBs)及房室傳導(dǎo)阻滯(atrial ventricular block，AVB)的發(fā)生率和心律失常持續(xù)時間。

3.3光鏡下觀察心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)再灌注結(jié)束后，取左心室組織切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的組織塊，置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，制成光鏡切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化。

3.4血漿cTnI和CK-MB的檢測再灌注結(jié)束后，以肝素處理過的注射器心臟穿刺法采血2 mL，4 ℃低速離心，取上層血漿用酶聯(lián)免疫試劑盒分別測定cTnI與CK-MB的含量。

3.5心肌無復(fù)流面積的測定恢復(fù)灌注后經(jīng)導(dǎo)管注入左心室6% thioflavin S溶液(1 mg/kg)。Thioflavin S 可發(fā)出熒光，用以標(biāo)記再灌注心肌。再次結(jié)扎原冠脈，并經(jīng)導(dǎo)管注入左心室Evans 藍溶液(1 mg/kg)。迅速取出心臟，分離左心室，快速深低溫冷凍。取出冷凍心臟，沿房室溝平行切為8～10層。未被藍色染色的心臟為結(jié)扎冠脈供血范圍的心?。辉谧贤鉄粝聼o熒光的心肌為無復(fù)流心肌，后者與前者的比例為無復(fù)流所占的比例。

3.6心肌組織MPO活性的檢測再灌注結(jié)束后，取缺血區(qū)心肌組織，稱重后置于勻漿器內(nèi)，剪碎，制備勻漿。3 000 r/min離心15 min后，取上清液，用酶聯(lián)免疫試劑盒測定各組MPO的活性。

3.7Western blot檢測心肌組織beclin-1蛋白的表達再灌注結(jié)束后，取各組大鼠左心室缺血區(qū)組織，提取總蛋白，并用Bradford法對提取的蛋白進行定量。每個樣本取等量蛋白(60 μg)進行10% SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。該膜在含8%脫脂奶粉的封閉液中封閉37 ℃ 1 h后,加入稀釋的抗beclin-1抗體4 ℃孵育過夜。反復(fù)洗膜后，將膜與堿性磷酸酶標(biāo)記的Ig抗體室溫輕搖1 h，洗膜后顯跡，同時用GAPDH作為內(nèi)參照。

4　統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，多樣本均數(shù)之間的兩兩比較用SNK-q檢驗，兩組間比較用配對t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

1　外源性精胺減少大鼠IR后心律失常的發(fā)生

大鼠心肌缺血后ST段明顯抬高，再灌注過程中，VT和VEBs等心律失?，F(xiàn)象均有發(fā)生；精胺組大鼠心肌再灌注性心律失常發(fā)生率顯著降低，且持續(xù)時間縮短(P<0.05)；假手術(shù)對照組未見再灌注心律失常發(fā)生，見表1。

表1　外源性精胺對大鼠再灌注性心律失常的影響Table 1.The effect of spermine on the arrhythmia during reperfusion in rats (Mean±SD.n=10)

*P<0.05vsIR group.

2　各組心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化

光鏡下可見對照組心肌肌絲排列整齊，閏盤清晰，無炎癥細胞浸潤；IR 組可見部分心肌細胞呈凝固性或帶狀壞死；IR+SP組炎癥細胞浸潤減少，未見其它病理改變，見圖1。

Figure 1.The morphological changes of myocardial tissues assessed by HE staining (×40).A:control group; B:IR group; C:IR+SP group
圖1HE染色檢測光鏡下各組心肌的形態(tài)學(xué)改變

3　外源性精胺降低血漿心肌損傷標(biāo)志物的含量

酶聯(lián)免疫試劑盒檢測結(jié)果顯示，IR組血漿中2種標(biāo)志物的含量均顯著高于對照組(P<0.05)；與IR組相比，IR+SP組血漿中CK-MB和cTnI的含量則顯著降低(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The plasma levels of cTnI and CK-MB assessed by ELISA.Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group;▲P<0.05vsIR group.
圖2各組大鼠血漿中cTnI和CK-MB的含量

4　外源性精胺減少無復(fù)流面積

如圖3所示，IR組心肌出現(xiàn)了明顯的無復(fù)流區(qū)，而IR+SP組無復(fù)流范圍則顯著減少，無復(fù)流區(qū)占缺血區(qū)的面積比(NR/ischemia)顯著降低(P<0.05)。

Figure 3.No-reflow (NR) size measurement.Mean±SD.n=10.*P<0.05vsIR group.
圖3IR組與IR+SP組無復(fù)流面積的比較

5　外源性精胺降低心肌組織勻漿中MPO的活性

酶聯(lián)免疫試劑盒檢測結(jié)果顯示，IR組心肌組織中MPO的活性較假手術(shù)對照組明顯升高；與IR組相比，IR+SP組MPO的活性減少(P<0.05)，見圖4。

6　外源性精胺上調(diào)心肌beclin-1的表達

Western blot結(jié)果顯示，自噬標(biāo)志蛋白之一beclin-1的表達在心肌缺血再灌注后有所升高(P<0.05)，而SP可以使beclin-1的表達進一步上調(diào)(P<0.05)，見圖 5。

討　　論

心肌梗死是威脅人類健康的難治性疾病之一，其治療宗旨是盡早再通阻塞的血管以恢復(fù)缺血組織的供血，即再灌注。但數(shù)據(jù)顯示，即便是血管成功再通后，仍有患者出現(xiàn)梗死面積擴大、心功能惡化以及梗死心室重塑加重的現(xiàn)象，無復(fù)流現(xiàn)象無疑是導(dǎo)致該結(jié)果的重要原因之一。關(guān)于無復(fù)流現(xiàn)象，早在上個世紀(jì)九十年代就已受到了國內(nèi)外的關(guān)注，但成果并不理想。

Figure 4.The activity of MPO assessed by ELISA.Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group;▲P<0.05vsIR group.
圖4各組大鼠心肌組織勻漿MPO活性的比較

Figure 5.The results of Western blot for determining the protein levels of beclin-1 in different groups.Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;▲P<0.05vsIR group.
圖5各組大鼠心肌組織中beclin-1蛋白的表達水平

多形核中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophils，PMNs)激活后釋放活性氧和溶酶體蛋白酶如彈性蛋白酶等，損傷內(nèi)皮細胞膜，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞層器質(zhì)性的損害，是導(dǎo)致IR損失以及無復(fù)流現(xiàn)象的重要原因之一[6]。MPO是PMNs的特異性標(biāo)志物，通過測定MPO 的活性即可靈敏、定量地反映PMNs的含量及其在組織中的浸潤。本實驗結(jié)果顯示，再灌注大鼠心肌組織MPO活性顯著增高，而SP組的MPO活性比IR組減少了33%，無復(fù)流面積也明顯減少，提示外源性精胺可能通過抑制減少PMNs的心肌浸潤，抑制炎癥反應(yīng)而保護心肌，但具體機制尚待進一步研究。

另外，有研究表明在肥胖癥患者的脂肪組織中，自噬可以通過減少炎癥相關(guān)基因的表達而限制炎癥反應(yīng)[7]，并與內(nèi)皮細胞的穩(wěn)態(tài)和血管重構(gòu)等密切相關(guān)[8]。最新研究發(fā)現(xiàn)，niclosamide通過自噬途徑減少炎癥細胞因子，從而改善腎臟缺血/再灌注損傷的結(jié)果[9]。為了驗證本實驗中外源性精胺抑制炎癥反應(yīng)的作用是否是通過自噬實現(xiàn)的，我們檢測了自噬的“守門人”beclin-1蛋白的表達。本實驗結(jié)果顯示，IR組的beclin-1表達略微上調(diào)，這可能是損傷誘導(dǎo)的自噬，是一種保護性應(yīng)激反應(yīng)。而外源性精胺顯著上調(diào)該蛋白的表達，提示精胺可能通過誘導(dǎo)自噬發(fā)生而抑制了心肌的炎癥反應(yīng)，減少PMNs心肌浸潤，從而減輕了心肌缺血再灌注后心肌無復(fù)流現(xiàn)象的發(fā)生。雖然欲確定精胺與自噬的關(guān)系還需深入研究，但本實驗的研究結(jié)果成果為進一步研究奠定了理論基礎(chǔ)，為防治無復(fù)流現(xiàn)象提供了新的靶點。

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