• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    牽張應(yīng)力刺激介導(dǎo)間充質(zhì)干細胞的信使RNA和長鏈非編碼RNA表達譜變化

    2018-04-02 13:01:48鄒慶寶靳松黃愛軍
    關(guān)鍵詞:張應(yīng)力茜素成骨

    鄒慶寶 靳松 黃愛軍

    間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)是人體內(nèi)重要的多能干細胞,廣泛存在與骨髓、脂肪和肌腱止點等結(jié)締組織中,除了具有支持造血干細胞的作用外,還具有對免疫系統(tǒng)多種細胞的抑制能力[1]。除此之外,MSC還具有強大的多向分化能力,可以在不同條件下分化為骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞[2]。新近研究顯示,人體內(nèi)的成骨細胞主要由MSC分化而來[3]。由于具有體外易于擴增、免疫原性低的特點,近年來MSC已在組織修復(fù)重建、生物醫(yī)學(xué)工程中廣泛使用,具有良好的臨床應(yīng)用前景[4]。

    機械應(yīng)力,特別是牽張應(yīng)力,是影響人體內(nèi)骨骼形成與發(fā)育的關(guān)鍵原因之一,是維持骨組織應(yīng)力平衡的重要因素[5]。近年來,許多研究已經(jīng)證實牽張應(yīng)力可以通過改變MSC基因表達譜以影響其成骨分化能力,從而參與調(diào)控機體內(nèi)的骨修復(fù)與重建平衡,但目前機制尚未完全闡明[6]。

    長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lnc- RNA)是一種長度大于200 nt、不具備編碼蛋白質(zhì)能力的RNA片段。既往認為,非編碼RNA只是細胞轉(zhuǎn)錄過程中出現(xiàn)的無用物質(zhì),然而新近的研究卻顯示lnc-RNA可以通過多種方式,參與細胞中各種功能的調(diào)控[7]。已有研究發(fā)現(xiàn),lnc-RNA可以參與MSC成骨分化的調(diào)控,但lnc-RNA是否參與了牽張應(yīng)力介導(dǎo)的MSC成骨分化,目前尚沒有研究[8]。在本研究中,對牽張應(yīng)力刺激下的MSC成骨分化能力及其lnc-RNA表達譜進行檢測,現(xiàn)報道如下。

    材料與方法

    一、主要材料與儀器

    1.主要材料:DMEM培養(yǎng)基、0.25﹪胰蛋白酶-EDTA(美國Gibco公司);胎牛血清(美國Gibco公司);CBA蛋白定量試劑盒(康為公司);堿性磷酸酶檢測試劑盒(南京建成公司);PBS緩沖液、RIPA蛋白提取液、Percoll分離液、氯仿、異丙醇、無水乙醇、DEPC水、多聚甲醛溶液(碧云天公司);地塞米松、β-磷酸甘油、抗壞血酸、氯化十六烷基吡啶(CPC)、茜素紅染色試劑盒(美國Sigma公司); Trizol提取液(美國Life公司);cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TAKARA公司);Affymetrix mRNA+長鏈非編碼RNA表達譜芯片(美國Life公司);FlexCell 6孔細胞培養(yǎng)板(美國FlexCell公司);離心 管(15 ml、50 ml)、25 cm2培養(yǎng) 瓶、96 孔板(美 國Corning公司);移液器(德國Eppendorf公司)。

    2.儀器:生物安全柜、CO2恒溫培養(yǎng)箱、低溫高速離心機、Nano分光光度計、酶標儀、PCR儀(美國Thermo Fisher公司);FlexCell細胞牽張應(yīng)力系統(tǒng)(美國FlexCell公司);倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);Hybridization Oven、Fluidics Station、GeneChip Scanner 3000 (美國Affymetrix公司)。

    二、方法

    1.正常MSC體外分離、培養(yǎng):本研究獲得中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院倫理委員會審批通過,所有骨髓捐獻志愿者均知曉本研究操作所具有的全部風(fēng)險,并簽署知情同意書。

    本研究共募集6名骨髓捐獻正常志愿者,其中男3人、女3人、年齡(25.6±3.4)歲,排除禁忌癥后按照標準方法行骨髓穿刺術(shù)。穿刺成功后抽取骨髓5 ml,加入50 ml離心管中,并加入10 ml PBS緩沖液充分混勻。隨后將稀釋的骨髓樣本用注射器緩慢加入等量Percoll分離液,保持兩者液面穩(wěn)定。以500×g離心10 min,離心后可見兩液相界面有白色膜狀層。用移液器吸取中間白膜層,加入10 ml PBS緩沖液充分混勻,以500×g離心10 min,離心后可見細胞團塊沉淀于離心管底部。用含10﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞,進行細胞計數(shù)后以2×106個/cm2的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中,放置于37 ℃、5﹪CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后棄去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基,用PBS緩沖液輕輕搖晃,洗去未貼壁細胞,加入新的含10﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。此后每3天換液1次,當細胞達到80﹪~ 90﹪融合時,0.25﹪胰蛋白酶-EDTA消化傳代,第3代細胞用于進行下一步實驗。MSC分為應(yīng)力組與非應(yīng)力組,應(yīng)力組為接受應(yīng)力刺激的MSC,無應(yīng)力組為未接收應(yīng)力刺激的對照MSC。

    2.成骨分化誘導(dǎo)與牽張應(yīng)力刺激:第3代MSC培養(yǎng)達90﹪融合時,按上述方法進行消化、計數(shù),以1×105個/孔的密度接種于FlexCell 6孔板中,待細胞完全貼壁后換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含10﹪胎牛血清、50 mg/L抗壞血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油、10 nmol/L地塞米松的DMEM),放置于37℃、5﹪CO2環(huán)境下的FlexCell細胞牽張應(yīng)力系統(tǒng)進行培養(yǎng),牽張應(yīng)力設(shè)置條件為5﹪形變、頻率0.1 Hz、作用時間為每天4 h。此后每3天全量更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基至相應(yīng)實驗時間。

    3.茜素紅染色與定量:MSC在牽張應(yīng)力刺激下進行成骨誘導(dǎo)至相應(yīng)時間點,棄去上清液,用PBS緩沖液輕輕清洗3次,隨后用4﹪多聚甲醛溶液在室溫下孵育固定5 min。棄去多聚甲醛溶液,用PBS緩沖液清洗3次,每孔加入茜素紅染色液2 ml,于室溫下染色10 min。染色完成后加入PBS緩沖液3 ml,于搖床上緩慢清洗5 min(3次),洗去非特異性染色與雜質(zhì),于倒置相差顯微鏡下拍照記錄。拍照完成后,每孔加入1 ml的氯化十六烷基吡啶萃取液,于搖床上室溫孵育1 h,充分萃取染色。用移液器吸取200 μl萃取液加入96孔板中,于酶標儀下測定吸光度。

    4.堿性磷酸酶活性測定:MSC誘導(dǎo)至10 d后,棄去上清液,用PBS緩沖液輕輕清洗3次每孔加入RIPA蛋白裂解液100 μl,冰上放置30 min。隨后吸取蛋白裂解液,于4℃下以3 000×g離心10 min。按照試劑盒方法配置堿性磷酸酶反應(yīng)液,于96孔板中每孔加入反應(yīng)液100 μl,同時加入蛋白上清30 μl,37 ℃孵育 15 min。隨后每孔加入顯色液 150 μl,充分混勻后通過酶標儀測吸光度。部分離心后的蛋白上清通過BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度,對堿性磷酸酶進行標準化定量。

    5.RNA提?。籂繌垜?yīng)力刺激下MSC成骨誘導(dǎo)至第7天,用PBS緩沖液輕輕清洗3次。每孔加入Trizol提取液1 ml,充分混勻后于冰上裂解5 min。將裂解液轉(zhuǎn)移至無酶EP管中,每管加入三氯甲烷200 μl,劇烈震蕩混勻后靜置 5 min,隨后 3 000×g離心10 min。離心后吸取上層水相液體并轉(zhuǎn)移入新的無酶EP管中,每管加入等量異丙醇,室溫靜置10 min后于3 000×g離心10 min。離心后可見RNA團塊沉淀于EP管底部,棄去上清液,加入75﹪乙醇1 ml充分混勻進行洗滌,以1 500×g離心10 min。棄去75﹪乙醇,加入20 μl無酶滅菌水。于Nanodrop紫外分光光度計下檢測RNA濃度與純度。

    6.cDNA逆轉(zhuǎn)錄:按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法,取無酶 EP 管,每管加入逆轉(zhuǎn)錄試劑 2 μl、RNA 8 μl,于PCR儀中以37 ℃孵育15 min。逆轉(zhuǎn)錄后cDNA加入40 μl DEPC水進行稀釋備用。

    7.表達譜芯片檢測:逆轉(zhuǎn)錄完成的cDNA經(jīng)過標記、芯片雜交、清洗、染色、掃描,收集數(shù)據(jù)后采用AGCC等軟件進行分析,實驗方法按照既往文獻報道方案進行[8]。實驗完成后使用Agilent Feature Extraction(v10.7)軟件對雜交圖片進行分析并提取數(shù)據(jù),然后使用 Agilent GeneSpring 軟件對數(shù)據(jù)進行歸一化和差異分析。

    8.生物信息學(xué)分析:對差異表達的mRNA進行 KEGG(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)信息學(xué)分析匯總,篩查差異表達的相關(guān)信號通路。根據(jù)序列相似性和表達相關(guān)性進行比對分析,鑒定lnc-RNA與mRNA共表達子集。通過NCBI-Blast程序比對共表達子集的lnc-RNA和mRNA的序列相關(guān)性。

    三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

    采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計,茜素紅定量、堿性磷酸酶活性結(jié)果以表示,成骨 0天、14天應(yīng)力組與無應(yīng)力組的茜素紅定量、堿性磷酸酶定量結(jié)果采用兩樣本t檢驗進行比較,以P< 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、牽張應(yīng)力促進MSC成骨分化

    將MSC接種于膠原I孵育的6孔板中,置于FlexCell細胞牽張應(yīng)力系統(tǒng),在5﹪形變、0.1 Hz、4 h/d條件下進行成骨誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)應(yīng)力刺激下的MSC在成骨誘導(dǎo)第10天堿性磷酸酶活性達(265.3±31.2) U/L,而無應(yīng)力組MSC成骨誘導(dǎo)第10天堿性磷酸酶活性僅為(121.2±21.2) U/L,應(yīng)力組高于無應(yīng)力組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。此外,成骨誘導(dǎo)第14天應(yīng)力組MSC茜素紅染色較無應(yīng)力組MSC加深,應(yīng)力組MSC茜素紅定量OD值達1.46±0.19,無應(yīng)力組MSC茜素紅定量為0.62±0.08,應(yīng)力組高于無應(yīng)力組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。這提示牽張應(yīng)力可以促進MSC成骨分化(圖 1)。

    圖1 應(yīng)力刺激下MSC成骨分化能力觀察(茜素紅染色,×40)

    二、牽張應(yīng)力刺激下MSC成骨分化mRNA和lnc-RNA表達譜

    在成骨誘導(dǎo)第7天,分別提取無應(yīng)力組與應(yīng)力刺激組MSC的RNA進行全基因組mRNA+lnc-RNA表達譜芯片實驗。通過實驗,發(fā)現(xiàn)差異表達的mRNA共有598個,其中上調(diào)的mRNA有313個、下調(diào)的mRNA有285個(圖2A),差異表達的前5 位的mRNA詳見表1。此外,發(fā)現(xiàn)差異表達的lnc-RNA有329個,其中上調(diào)lnc-RNA有151個,下調(diào)的lnc-RNA有178個(圖2B),差異表達的前5位的lnc-RNA詳見表2。對差異表達的lnc-RNA進行分類,其中基因間lnc-RNA有92個、內(nèi)含子lnc-RNA有64個、正義鏈lnc-RNA有84個、反義鏈lnc-RNA有61個,雙向lnc-RNA有28個。這些結(jié)果提示應(yīng)力刺激下MSC的mRNA和lnc-RNA表達譜發(fā)生顯著改變,從而影響其成骨分化能力。

    表1 差異表達的前5位的mRNA

    表2 差異表達的前5位的lnc-RNA

    三、差異mRNA和Lnc-RNA的生物信息學(xué)分析

    為了探討差異mRNA相關(guān)的信號通路及其對應(yīng)功能,進行KEGG生物信息學(xué)分析。通過分析,發(fā)現(xiàn)有5個信號通路的表達變化具有統(tǒng)計學(xué)意義,分別為WNT/β信號通路、Cytokine-Cytokine receptor信號 通路、Cell Cycle信號 通 路、Focal Adhesion信號通路和Lipoic acid metabolism 信號通路。WNT信號通路是差異表達最顯著的信號通路,共有11個差異表達基因,其中WNT5a上調(diào)最為明顯(6.74倍)(表 3)。

    圖2 應(yīng)力刺激下MSC的mRNA和lnc-RNA表達譜

    為了探討WNT5a表達上調(diào)的機制,以WNT5a的表達和序列為基礎(chǔ),與差異表達的329個lnc-RNA進行共表達相關(guān)性分析和序列比對分析。通過分析,發(fā)現(xiàn)有3個差異表達的lnc-RNA與WNT5a具有共表達相關(guān)性,分別為 ENSG00000237298.2、ENSG00000241956.5 和ENSG00000187229.3(表4);通過序列對比分析,結(jié)果提示ENSG00000237298.2序列中與WNT5a的編碼序列有部分結(jié)合位點,提示W(wǎng)NT5a可能是受到ENSG00000237298.2表達調(diào)控的靶基因,將ENSG00000237298.2命 名 為lnc-RNA-SSR(long non-coding RNA Strain Stimulation Related)。 這 些結(jié)果提示在應(yīng)力刺激下,lnc-RNA-SSR的表達增加,從而上調(diào)WNT5a表達、促進MSC成骨分化。

    表3 KEGG分析差異表達信號通路

    表4 與WNT5a共表達的lnc-RNA分析

    討 論

    1974年,國外學(xué)者Friedenstein等[9]首次證實在骨髓微環(huán)境中存在成纖維細胞樣、長梭型細胞,并將其命名為間充質(zhì)干細胞(MSC),這些細胞作為骨髓微環(huán)境壁龕細胞,具有支持造血干細胞的重要功能。隨后的研究發(fā)現(xiàn),MSC廣泛存在于人體多種組織中,除了在骨髓中含量豐富之外,還存在于脂肪、臍帶等多種結(jié)締組織和外周血循環(huán)中[1]。新近研究顯示,MSC不僅具有強大的免疫調(diào)節(jié)能力和較低的免疫原性,還具有多項分化的功能,可以分化為成骨細胞、成脂細胞和成軟骨細胞。近年來,一系列的實驗均證實,MSC是人體內(nèi)成骨細胞的主要來源[3]。MSC強大的成骨分化功能使其可以廣泛應(yīng)用于骨折修復(fù)、損傷重建等組織再生工程中,具有廣泛的應(yīng)用前景[4]。

    機械應(yīng)力是一種廣泛存在于人體中的物理刺激信號,而牽張應(yīng)力是其中最重要的一類機械應(yīng)力刺激。牽張應(yīng)力存在于所有細胞微環(huán)境中,主要由肌肉產(chǎn)生并直接作用于骨骼,直接對骨骼相關(guān)細胞的增殖、凋亡和分化等功能產(chǎn)生重要影響,從而影響局部骨組織骨量[10]。當人體處于低牽張應(yīng)力情況下(失重、長期臥床),則會導(dǎo)致骨量降低;而當人體處于高牽張應(yīng)力、骨組織載荷增加情況下(運動員),則會增加機體骨量[11]。這主要是由于牽張應(yīng)力影響MSC成骨分化所決定的。MSC的成骨分化能力受到環(huán)境刺激、炎癥因子等多種因素的影響。大量實驗結(jié)果表明,適當增加牽張應(yīng)力刺激可以促進MSC成骨分化,牽張應(yīng)力預(yù)刺激下MSC移植后組織修復(fù)能力增強,大大提高了其在組織工程修復(fù)中的作用[12]。進一步深入探討牽張應(yīng)力刺激調(diào)控MSC成骨分化功能的機制,對于推動MSC臨床應(yīng)用意義重大。

    在本研究中,通過茜素紅和堿性磷酸酶實驗,進一步證實5﹪形變、0.1 Hz、4 h/d條件下牽張應(yīng)力刺激可以促進MSC的成骨分化能力,這與既往文獻報道的結(jié)果一致[12]。此外,筆者也對不同牽張應(yīng)力刺激條件進行摸索,發(fā)現(xiàn)過強的牽張應(yīng)力刺激會大量誘導(dǎo)MSC凋亡,從而影響其成骨分化。這與臨床觀察中,適當?shù)膽?yīng)力或受力可以促進骨折愈合,但是過大過強的應(yīng)力刺激則會導(dǎo)致骨折延遲愈合的現(xiàn)象一致。此外,筆者進一步對成骨誘導(dǎo)分化后、牽張應(yīng)力刺激下的MSC進行全基因組表達譜芯片分析。經(jīng)過分析,共發(fā)現(xiàn)對比無應(yīng)力組,牽張應(yīng)力刺激下MSC共有598個基因差異表達,其中上調(diào)的有313個、下調(diào)285個。筆者進一步對差異表達的基因進行生物信息學(xué)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達的基因匯聚后共有5個信號通路存在異常表達,分別為WNT信號通路、Cytokine-Cytokine receptor信號通路、Cell Cycle信號通路、Focal Adhesion信號通路和Lipoic acid metabolism 信號通路,提示這些信號通路是牽張應(yīng)力介導(dǎo)MSC成骨分化能力增強的關(guān)鍵。

    WNT信號通路是介導(dǎo)MSC成骨分化的重要通路之一。已有研究證實,WNT信號通路激活可以促進MSC成骨分化[13]。WNT5a是WNT家族的一員,作為外分泌分子,WNT5a主要發(fā)揮激活WNT通路的作用,廣泛調(diào)控機體內(nèi)的多種細胞,參與組織發(fā)育、腫瘤生長等多種生理和病理過程[14]。既往已有研究提示W(wǎng)NT5a可以促進MSC成骨分化[12]。在本研究中,發(fā)現(xiàn)WNT5a上調(diào)達6.74倍,為差異表達倍數(shù)最明顯的第二位基因。筆者推測,牽張應(yīng)力刺激導(dǎo)致MSC自分泌WNT5a增加,從而激活WNT信號通路,導(dǎo)致MSC成骨分化能力增強。

    長鏈非編碼RNA是近年來研究的熱點,是一種長度大于200 nt、不具備編碼蛋白質(zhì)能力的RNA片段。lnc-RNA包括基因間、內(nèi)含子等多種類型,存在于細胞核內(nèi)或細胞質(zhì)中,可以在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控多種細胞的功能[7]。已有研究發(fā)現(xiàn)lnc-RNA對MSC成骨分化的功能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[8],但在牽張應(yīng)力下MSC的lnc-RNA表達是否發(fā)生改變、是否參與了對MSC成骨分化功能的調(diào)控,目前尚未見研究。在本研究中,對成骨誘導(dǎo)分化后、牽張應(yīng)力刺激下的MSC進行l(wèi)nc-RNA表達譜芯片分析,發(fā)現(xiàn)牽張應(yīng)力刺激后MSC的lnc-RNA表達譜發(fā)生差異改變,差異表達lnc-RNA達329個,提示lnc-RNA參與了牽張應(yīng)力介導(dǎo)MSC成骨分化的過程。

    lnc-RNA可以通過多種方式參與基因表達調(diào)控,但是發(fā)揮調(diào)控功能需具備2個前提:一是lnc-RNA與靶基因具有表達相關(guān)性,即具有共表達關(guān)系;二是lnc-RNA需存在與靶基因可能結(jié)合的位點[15]?;谏鲜鰞蓚€條件,筆者對以目標基因WNT5a作為核心進行共表達分析和序列比對分析,以進一步明確具體調(diào)控牽張應(yīng)力刺激下MSC成骨分化的關(guān)鍵lnc-RNA。本研究發(fā)現(xiàn)lnc-RNASSR在牽張應(yīng)力刺激下上調(diào)達4.11倍,且其表達與WNT5a的表達具有相關(guān)性,這說明2個分子之間存在明顯的表達聯(lián)系。進一步通過生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)lnc-RNA-SSR與WNT5a編碼序列有部分預(yù)測結(jié)合位點,這個結(jié)果提示lnc-RNASSR可能與WNT5a的mRNA序列結(jié)合。已有許多研究發(fā)現(xiàn),lnc-RNA可與基因的轉(zhuǎn)錄本進行結(jié)合,對其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后修飾與調(diào)控作用,從而影響其表達水平[15]。筆者推測,lnc-RNA-SSR可能通過直接結(jié)合WNT5a編碼序列,以調(diào)控其表達水平改變,這需要在未來的研究中通過實驗進一步證明。此外,本研究雖還發(fā)現(xiàn)ENSG00000241956.5、ENSG00000187229.3與WNT5a有共表達關(guān)系,但由于生物信息學(xué)預(yù)測提示二者之間不存在結(jié)合位點,提示 ENSG00000241956.5、ENSG00000187229.3僅僅是成骨過程中伴隨出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本,不對WNT5a進行調(diào)控。

    綜上所述,在本研究中進一步證實牽張應(yīng)力刺激下MSC的lnc-RNA表達譜發(fā)現(xiàn)明顯變化、成骨分化能力顯著增強。這可能是由于lnc-RNA-SSR表達上調(diào),通過特異性調(diào)控WNT5a自分泌增加,從而介導(dǎo)WNT信號通路激活,最終導(dǎo)致MSC成骨分化增強。本研究探索了lnc-RNA表達譜在牽張應(yīng)力介導(dǎo)MSC成骨分化中的作用,對于促進MSC特異性分化及在組織再生工程中的應(yīng)用,具有重要意義。然而,本研究尚有不足,具體lnc-RNA-SSR調(diào)控WNT5a表達及WNT信號通路激活的機制尚未完全闡明,仍需要再未來的研究中進一步探索。

    猜你喜歡
    張應(yīng)力茜素成骨
    茜素紅“開關(guān)式”熒光探針測定水中微量銅
    經(jīng)典Wnt信號通路與牙周膜干細胞成骨分化
    醌茜素抑制PI3K通路的磷酸化對宮頸癌CaSki細胞凋亡和自噬的影響
    什么是不銹鋼的應(yīng)力腐蝕開裂?
    內(nèi)聚力-張力學(xué)說中關(guān)于負壓的幾點疑問
    異常血流動力對TLR4/NF—κB信號傳導(dǎo)通路及其下游炎癥因子的影響
    糖尿病大鼠Nfic與成骨相關(guān)基因表達的研究
    芬頓法氧化降解水中茜素紅的研究*
    廣州化工(2016年8期)2016-09-02 00:48:12
    液晶/聚氨酯復(fù)合基底影響rBMSCs成骨分化的研究
    30例Ⅰ型成骨不全患者股骨干骨折術(shù)后康復(fù)護理
    天津護理(2015年4期)2015-11-10 06:11:41
    一级a爱视频在线免费观看| 亚洲七黄色美女视频| 美女大奶头黄色视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 我的亚洲天堂| 欧美日韩黄片免| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲伊人色综图| 精品少妇黑人巨大在线播放| 成人手机av| 黑人猛操日本美女一级片| 美女福利国产在线| 国产在线一区二区三区精| 国产一区二区三区综合在线观看| 69精品国产乱码久久久| 久久久久久久久免费视频了| 国产精品99久久99久久久不卡| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产精品av久久久久免费| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 日本av手机在线免费观看| 国产亚洲av高清不卡| 一区福利在线观看| 麻豆av在线久日| 高清av免费在线| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 嫩草影视91久久| 女人久久www免费人成看片| 国产一区二区三区av在线| 搡老乐熟女国产| 成年人午夜在线观看视频| 18禁观看日本| 美女高潮到喷水免费观看| 国产一区二区三区av在线| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 九色亚洲精品在线播放| 青春草视频在线免费观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 狂野欧美激情性xxxx| 美国免费a级毛片| 99久久人妻综合| 国产成人精品在线电影| 女人精品久久久久毛片| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 69精品国产乱码久久久| 久久99热这里只频精品6学生| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲av国产av综合av卡| 精品一区二区三区av网在线观看 | 人妻一区二区av| av超薄肉色丝袜交足视频| 2018国产大陆天天弄谢| 久久国产精品影院| 1024香蕉在线观看| 国产成人精品无人区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 日韩免费高清中文字幕av| 午夜精品国产一区二区电影| 国产男女超爽视频在线观看| 十分钟在线观看高清视频www| 丝袜美足系列| 男女午夜视频在线观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产一区二区在线观看av| 在线观看免费高清a一片| 纯流量卡能插随身wifi吗| 欧美黑人欧美精品刺激| 十八禁人妻一区二区| 一级毛片电影观看| 久久国产精品影院| 国产主播在线观看一区二区| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 波多野结衣一区麻豆| 国产成人av激情在线播放| 性色av一级| 99精品欧美一区二区三区四区| 91国产中文字幕| 久久热在线av| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产在线免费精品| 日本vs欧美在线观看视频| 午夜91福利影院| 男女午夜视频在线观看| 久久久久久久久久久久大奶| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 日韩中文字幕欧美一区二区| 欧美激情极品国产一区二区三区| 99久久精品国产亚洲精品| 精品久久久精品久久久| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲国产欧美在线一区| 一边摸一边做爽爽视频免费| www.av在线官网国产| 日韩有码中文字幕| 国产在视频线精品| 精品人妻在线不人妻| 亚洲精华国产精华精| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 99热全是精品| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 老司机午夜十八禁免费视频| 不卡av一区二区三区| 青春草视频在线免费观看| 亚洲av国产av综合av卡| 久久青草综合色| 18禁观看日本| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 免费av中文字幕在线| 99热全是精品| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 最近最新免费中文字幕在线| 精品少妇久久久久久888优播| 午夜视频精品福利| 久久中文字幕一级| 高清在线国产一区| 亚洲国产成人一精品久久久| 免费高清在线观看日韩| 男女国产视频网站| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产福利在线免费观看视频| 天堂8中文在线网| 少妇粗大呻吟视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产精品欧美亚洲77777| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久性视频一级片| 国产成人欧美在线观看 | 亚洲欧美激情在线| 蜜桃国产av成人99| 国产深夜福利视频在线观看| 蜜桃在线观看..| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲成国产人片在线观看| 我的亚洲天堂| 岛国在线观看网站| 好男人电影高清在线观看| 美女午夜性视频免费| 男女床上黄色一级片免费看| 天天操日日干夜夜撸| 热99re8久久精品国产| 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品免费视频内射| 性高湖久久久久久久久免费观看| 婷婷丁香在线五月| 亚洲成人免费电影在线观看| 天天添夜夜摸| 久久久久精品国产欧美久久久 | 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久久久久久久久免费视频了| 丝袜喷水一区| 国产精品偷伦视频观看了| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产亚洲精品第一综合不卡| 桃红色精品国产亚洲av| 一本久久精品| 国产精品国产av在线观看| 国产av又大| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产主播在线观看一区二区| 久久这里只有精品19| 欧美国产精品va在线观看不卡| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 青春草视频在线免费观看| 成人手机av| 欧美乱码精品一区二区三区| 欧美激情 高清一区二区三区| 欧美日韩福利视频一区二区| 午夜激情av网站| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 日本vs欧美在线观看视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产成人免费观看mmmm| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久久久视频综合| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 欧美激情高清一区二区三区| 国产人伦9x9x在线观看| 999久久久国产精品视频| 欧美激情高清一区二区三区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 一级,二级,三级黄色视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美日韩成人在线一区二区| 不卡av一区二区三区| 18禁国产床啪视频网站| 各种免费的搞黄视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久人妻熟女aⅴ| 搡老乐熟女国产| 飞空精品影院首页| 老鸭窝网址在线观看| 9色porny在线观看| 午夜影院在线不卡| 国产黄频视频在线观看| 在线 av 中文字幕| 成在线人永久免费视频| 一级毛片电影观看| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 又黄又粗又硬又大视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 人妻久久中文字幕网| 不卡一级毛片| 亚洲黑人精品在线| 午夜91福利影院| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产成人欧美在线观看 | 久久久久网色| 99精国产麻豆久久婷婷| 久久99热这里只频精品6学生| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲美女黄色视频免费看| 超碰成人久久| 久久精品人人爽人人爽视色| 9色porny在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 69精品国产乱码久久久| a级毛片黄视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 91国产中文字幕| 夜夜夜夜夜久久久久| 丁香六月欧美| 三上悠亚av全集在线观看| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产精品偷伦视频观看了| 久久久精品94久久精品| 久久久久网色| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 天天添夜夜摸| 性少妇av在线| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久精品国产a三级三级三级| 成人免费观看视频高清| 国产成人免费观看mmmm| 99国产精品一区二区三区| 久久久国产欧美日韩av| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 一二三四社区在线视频社区8| 欧美一级毛片孕妇| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲 欧美一区二区三区| 久久久精品免费免费高清| 精品国产一区二区久久| 老汉色∧v一级毛片| 69av精品久久久久久 | 国产精品影院久久| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲精品第二区| 黄频高清免费视频| 午夜日韩欧美国产| 亚洲精品美女久久av网站| 国产精品欧美亚洲77777| 男女午夜视频在线观看| 日本wwww免费看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产免费福利视频在线观看| 丝袜美足系列| 啦啦啦 在线观看视频| √禁漫天堂资源中文www| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 一进一出抽搐动态| 亚洲精品中文字幕在线视频| 又大又爽又粗| 亚洲五月色婷婷综合| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产一区二区激情短视频 | 午夜福利在线免费观看网站| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 久久久久国内视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | av欧美777| a在线观看视频网站| 欧美乱码精品一区二区三区| 欧美激情 高清一区二区三区| av片东京热男人的天堂| 秋霞在线观看毛片| 成年人免费黄色播放视频| 成人国语在线视频| 亚洲精品第二区| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产精品一区二区在线不卡| 精品人妻1区二区| 国产精品 国内视频| 美女福利国产在线| 一二三四社区在线视频社区8| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲五月色婷婷综合| 久久精品人人爽人人爽视色| 大码成人一级视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久中文字幕一级| av网站在线播放免费| 亚洲欧美激情在线| 久久久久精品人妻al黑| 婷婷丁香在线五月| 三上悠亚av全集在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 最近最新免费中文字幕在线| 首页视频小说图片口味搜索| 日本av手机在线免费观看| 九色亚洲精品在线播放| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 一区二区三区四区激情视频| 动漫黄色视频在线观看| avwww免费| 91av网站免费观看| 免费在线观看日本一区| 亚洲成人免费av在线播放| 欧美成狂野欧美在线观看| 人妻人人澡人人爽人人| 久久久久久久国产电影| 啦啦啦 在线观看视频| 少妇人妻久久综合中文| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产91精品成人一区二区三区 | 青春草亚洲视频在线观看| 少妇精品久久久久久久| 制服诱惑二区| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 男人操女人黄网站| 免费日韩欧美在线观看| 十八禁网站网址无遮挡| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲国产精品成人久久小说| 欧美黑人欧美精品刺激| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 久久人人爽人人片av| 国产一区二区激情短视频 | 国产免费av片在线观看野外av| 一进一出抽搐动态| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 91成年电影在线观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 色播在线永久视频| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲伊人久久精品综合| 国产精品免费视频内射| 女性生殖器流出的白浆| 桃花免费在线播放| 国产精品熟女久久久久浪| 十八禁网站网址无遮挡| 日韩中文字幕视频在线看片| 欧美日韩黄片免| 国产男女超爽视频在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 久久久久久久精品精品| 91成人精品电影| 一级,二级,三级黄色视频| 精品国产国语对白av| 欧美97在线视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 欧美一级毛片孕妇| 超碰成人久久| 国产欧美日韩精品亚洲av| √禁漫天堂资源中文www| 国产野战对白在线观看| 桃红色精品国产亚洲av| 咕卡用的链子| 欧美午夜高清在线| 最黄视频免费看| 亚洲五月色婷婷综合| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 欧美久久黑人一区二区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美在线一区亚洲| 久久青草综合色| 男人添女人高潮全过程视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲精品国产av成人精品| 久久亚洲国产成人精品v| 老司机午夜十八禁免费视频| 又紧又爽又黄一区二区| 免费高清在线观看日韩| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 好男人电影高清在线观看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 丁香六月欧美| 免费在线观看完整版高清| 亚洲综合色网址| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产黄色免费在线视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产精品二区激情视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲国产成人一精品久久久| 交换朋友夫妻互换小说| 午夜日韩欧美国产| 高清视频免费观看一区二区| 高清av免费在线| 99国产极品粉嫩在线观看| 免费高清在线观看视频在线观看| 老司机深夜福利视频在线观看 | 欧美国产精品一级二级三级| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产av又大| 国产精品久久久久久精品电影小说| 一二三四社区在线视频社区8| 国产区一区二久久| 狠狠精品人妻久久久久久综合| a级毛片在线看网站| 亚洲中文日韩欧美视频| a级片在线免费高清观看视频| 日韩大片免费观看网站| 亚洲精品国产区一区二| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲国产欧美网| www.999成人在线观看| 女人精品久久久久毛片| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 欧美日韩视频精品一区| 曰老女人黄片| 色94色欧美一区二区| 久久ye,这里只有精品| av欧美777| 国产亚洲欧美精品永久| 波多野结衣av一区二区av| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 黄色 视频免费看| 国产精品成人在线| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲国产欧美一区二区综合| 一个人免费看片子| 亚洲精品中文字幕在线视频| 最近最新中文字幕大全免费视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 国产精品免费大片| 久久久国产欧美日韩av| 人人妻人人澡人人看| 亚洲精品在线美女| 一级片免费观看大全| 一本久久精品| 视频区欧美日本亚洲| 9色porny在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 日韩大片免费观看网站| 好男人电影高清在线观看| 亚洲美女黄色视频免费看| 久久精品成人免费网站| 亚洲av片天天在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 青青草视频在线视频观看| 国产精品.久久久| 丰满少妇做爰视频| 最近最新免费中文字幕在线| 欧美 日韩 精品 国产| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 精品亚洲成国产av| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 午夜福利在线观看吧| 国产精品一二三区在线看| 国产熟女午夜一区二区三区| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲avbb在线观看| 久久久久精品人妻al黑| 一本大道久久a久久精品| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 亚洲国产成人一精品久久久| 中文字幕色久视频| 久久亚洲国产成人精品v| 美女福利国产在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 欧美成人午夜精品| 久久这里只有精品19| 久久狼人影院| 一级毛片女人18水好多| 久久人妻熟女aⅴ| 国产亚洲av高清不卡| 香蕉国产在线看| 丝瓜视频免费看黄片| 成年女人毛片免费观看观看9 | 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲天堂av无毛| 亚洲成人免费av在线播放| 精品一区在线观看国产| 久久久国产精品麻豆| 欧美性长视频在线观看| 免费高清在线观看视频在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 精品欧美一区二区三区在线| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久精品国产综合久久久| 一级片免费观看大全| 成人av一区二区三区在线看 | 黄片小视频在线播放| 亚洲成人手机| 最近最新免费中文字幕在线| 久久人人97超碰香蕉20202| 一级片'在线观看视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 又黄又粗又硬又大视频| 国产黄频视频在线观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产片内射在线| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲一区中文字幕在线| av福利片在线| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 免费观看人在逋| 秋霞在线观看毛片| 三级毛片av免费| 男人添女人高潮全过程视频| 一区二区三区四区激情视频| 99国产精品一区二区蜜桃av | 日韩中文字幕欧美一区二区| e午夜精品久久久久久久| 日韩欧美一区视频在线观看| 美女福利国产在线| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久精品国产a三级三级三级| svipshipincom国产片| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| av不卡在线播放| tocl精华| 青春草视频在线免费观看| 精品国内亚洲2022精品成人 | 精品视频人人做人人爽| 啦啦啦在线免费观看视频4| 性色av乱码一区二区三区2| 妹子高潮喷水视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| 黄片小视频在线播放| 午夜福利影视在线免费观看| 成人手机av| 国产成人系列免费观看| 中文字幕最新亚洲高清| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产视频一区二区在线看| 亚洲精品在线美女| 亚洲成国产人片在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 成人黄色视频免费在线看| 一个人免费看片子| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲一码二码三码区别大吗| 另类精品久久| 成人三级做爰电影| 五月开心婷婷网| 亚洲专区国产一区二区| 久久这里只有精品19| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 久久久久久久久久久久大奶| 国产深夜福利视频在线观看| 搡老乐熟女国产| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲三区欧美一区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 99精品欧美一区二区三区四区| 99国产精品一区二区三区| 美女主播在线视频| 人妻 亚洲 视频| 精品少妇内射三级| 免费高清在线观看视频在线观看| 一个人免费看片子| 久久99热这里只频精品6学生| cao死你这个sao货| 亚洲全国av大片| 黑人猛操日本美女一级片| 久久国产精品大桥未久av| 国产亚洲一区二区精品| 婷婷丁香在线五月| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产成人欧美在线观看 | 亚洲第一青青草原| 亚洲精品国产av成人精品| 一区在线观看完整版| 国产主播在线观看一区二区| 久久精品国产综合久久久| 香蕉国产在线看| avwww免费| 亚洲av片天天在线观看| 久久九九热精品免费| 亚洲国产看品久久| 亚洲国产欧美网| 欧美精品一区二区免费开放| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 在线观看免费高清a一片| 亚洲人成电影观看| 免费少妇av软件| 精品高清国产在线一区| 久久精品亚洲av国产电影网| 精品视频人人做人人爽| 黑人操中国人逼视频| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久狼人影院| 91九色精品人成在线观看| 久9热在线精品视频| h视频一区二区三区| 美国免费a级毛片| 99香蕉大伊视频| 亚洲精品一二三| 久久久久网色| 99久久精品国产亚洲精品| 国产欧美日韩精品亚洲av| 97精品久久久久久久久久精品| 中文字幕色久视频| 成人亚洲精品一区在线观看|