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    牽張應(yīng)力刺激介導(dǎo)間充質(zhì)干細胞的信使RNA和長鏈非編碼RNA表達譜變化

    2018-04-02 13:01:48鄒慶寶靳松黃愛軍
    關(guān)鍵詞:張應(yīng)力茜素成骨

    鄒慶寶 靳松 黃愛軍

    間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)是人體內(nèi)重要的多能干細胞,廣泛存在與骨髓、脂肪和肌腱止點等結(jié)締組織中,除了具有支持造血干細胞的作用外,還具有對免疫系統(tǒng)多種細胞的抑制能力[1]。除此之外,MSC還具有強大的多向分化能力,可以在不同條件下分化為骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞[2]。新近研究顯示,人體內(nèi)的成骨細胞主要由MSC分化而來[3]。由于具有體外易于擴增、免疫原性低的特點,近年來MSC已在組織修復(fù)重建、生物醫(yī)學(xué)工程中廣泛使用,具有良好的臨床應(yīng)用前景[4]。

    機械應(yīng)力,特別是牽張應(yīng)力,是影響人體內(nèi)骨骼形成與發(fā)育的關(guān)鍵原因之一,是維持骨組織應(yīng)力平衡的重要因素[5]。近年來,許多研究已經(jīng)證實牽張應(yīng)力可以通過改變MSC基因表達譜以影響其成骨分化能力,從而參與調(diào)控機體內(nèi)的骨修復(fù)與重建平衡,但目前機制尚未完全闡明[6]。

    長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lnc- RNA)是一種長度大于200 nt、不具備編碼蛋白質(zhì)能力的RNA片段。既往認為,非編碼RNA只是細胞轉(zhuǎn)錄過程中出現(xiàn)的無用物質(zhì),然而新近的研究卻顯示lnc-RNA可以通過多種方式,參與細胞中各種功能的調(diào)控[7]。已有研究發(fā)現(xiàn),lnc-RNA可以參與MSC成骨分化的調(diào)控,但lnc-RNA是否參與了牽張應(yīng)力介導(dǎo)的MSC成骨分化,目前尚沒有研究[8]。在本研究中,對牽張應(yīng)力刺激下的MSC成骨分化能力及其lnc-RNA表達譜進行檢測,現(xiàn)報道如下。

    材料與方法

    一、主要材料與儀器

    1.主要材料:DMEM培養(yǎng)基、0.25﹪胰蛋白酶-EDTA(美國Gibco公司);胎牛血清(美國Gibco公司);CBA蛋白定量試劑盒(康為公司);堿性磷酸酶檢測試劑盒(南京建成公司);PBS緩沖液、RIPA蛋白提取液、Percoll分離液、氯仿、異丙醇、無水乙醇、DEPC水、多聚甲醛溶液(碧云天公司);地塞米松、β-磷酸甘油、抗壞血酸、氯化十六烷基吡啶(CPC)、茜素紅染色試劑盒(美國Sigma公司); Trizol提取液(美國Life公司);cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TAKARA公司);Affymetrix mRNA+長鏈非編碼RNA表達譜芯片(美國Life公司);FlexCell 6孔細胞培養(yǎng)板(美國FlexCell公司);離心 管(15 ml、50 ml)、25 cm2培養(yǎng) 瓶、96 孔板(美 國Corning公司);移液器(德國Eppendorf公司)。

    2.儀器:生物安全柜、CO2恒溫培養(yǎng)箱、低溫高速離心機、Nano分光光度計、酶標儀、PCR儀(美國Thermo Fisher公司);FlexCell細胞牽張應(yīng)力系統(tǒng)(美國FlexCell公司);倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);Hybridization Oven、Fluidics Station、GeneChip Scanner 3000 (美國Affymetrix公司)。

    二、方法

    1.正常MSC體外分離、培養(yǎng):本研究獲得中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院倫理委員會審批通過,所有骨髓捐獻志愿者均知曉本研究操作所具有的全部風(fēng)險,并簽署知情同意書。

    本研究共募集6名骨髓捐獻正常志愿者,其中男3人、女3人、年齡(25.6±3.4)歲,排除禁忌癥后按照標準方法行骨髓穿刺術(shù)。穿刺成功后抽取骨髓5 ml,加入50 ml離心管中,并加入10 ml PBS緩沖液充分混勻。隨后將稀釋的骨髓樣本用注射器緩慢加入等量Percoll分離液,保持兩者液面穩(wěn)定。以500×g離心10 min,離心后可見兩液相界面有白色膜狀層。用移液器吸取中間白膜層,加入10 ml PBS緩沖液充分混勻,以500×g離心10 min,離心后可見細胞團塊沉淀于離心管底部。用含10﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞,進行細胞計數(shù)后以2×106個/cm2的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中,放置于37 ℃、5﹪CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后棄去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基,用PBS緩沖液輕輕搖晃,洗去未貼壁細胞,加入新的含10﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。此后每3天換液1次,當細胞達到80﹪~ 90﹪融合時,0.25﹪胰蛋白酶-EDTA消化傳代,第3代細胞用于進行下一步實驗。MSC分為應(yīng)力組與非應(yīng)力組,應(yīng)力組為接受應(yīng)力刺激的MSC,無應(yīng)力組為未接收應(yīng)力刺激的對照MSC。

    2.成骨分化誘導(dǎo)與牽張應(yīng)力刺激:第3代MSC培養(yǎng)達90﹪融合時,按上述方法進行消化、計數(shù),以1×105個/孔的密度接種于FlexCell 6孔板中,待細胞完全貼壁后換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含10﹪胎牛血清、50 mg/L抗壞血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油、10 nmol/L地塞米松的DMEM),放置于37℃、5﹪CO2環(huán)境下的FlexCell細胞牽張應(yīng)力系統(tǒng)進行培養(yǎng),牽張應(yīng)力設(shè)置條件為5﹪形變、頻率0.1 Hz、作用時間為每天4 h。此后每3天全量更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基至相應(yīng)實驗時間。

    3.茜素紅染色與定量:MSC在牽張應(yīng)力刺激下進行成骨誘導(dǎo)至相應(yīng)時間點,棄去上清液,用PBS緩沖液輕輕清洗3次,隨后用4﹪多聚甲醛溶液在室溫下孵育固定5 min。棄去多聚甲醛溶液,用PBS緩沖液清洗3次,每孔加入茜素紅染色液2 ml,于室溫下染色10 min。染色完成后加入PBS緩沖液3 ml,于搖床上緩慢清洗5 min(3次),洗去非特異性染色與雜質(zhì),于倒置相差顯微鏡下拍照記錄。拍照完成后,每孔加入1 ml的氯化十六烷基吡啶萃取液,于搖床上室溫孵育1 h,充分萃取染色。用移液器吸取200 μl萃取液加入96孔板中,于酶標儀下測定吸光度。

    4.堿性磷酸酶活性測定:MSC誘導(dǎo)至10 d后,棄去上清液,用PBS緩沖液輕輕清洗3次每孔加入RIPA蛋白裂解液100 μl,冰上放置30 min。隨后吸取蛋白裂解液,于4℃下以3 000×g離心10 min。按照試劑盒方法配置堿性磷酸酶反應(yīng)液,于96孔板中每孔加入反應(yīng)液100 μl,同時加入蛋白上清30 μl,37 ℃孵育 15 min。隨后每孔加入顯色液 150 μl,充分混勻后通過酶標儀測吸光度。部分離心后的蛋白上清通過BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度,對堿性磷酸酶進行標準化定量。

    5.RNA提?。籂繌垜?yīng)力刺激下MSC成骨誘導(dǎo)至第7天,用PBS緩沖液輕輕清洗3次。每孔加入Trizol提取液1 ml,充分混勻后于冰上裂解5 min。將裂解液轉(zhuǎn)移至無酶EP管中,每管加入三氯甲烷200 μl,劇烈震蕩混勻后靜置 5 min,隨后 3 000×g離心10 min。離心后吸取上層水相液體并轉(zhuǎn)移入新的無酶EP管中,每管加入等量異丙醇,室溫靜置10 min后于3 000×g離心10 min。離心后可見RNA團塊沉淀于EP管底部,棄去上清液,加入75﹪乙醇1 ml充分混勻進行洗滌,以1 500×g離心10 min。棄去75﹪乙醇,加入20 μl無酶滅菌水。于Nanodrop紫外分光光度計下檢測RNA濃度與純度。

    6.cDNA逆轉(zhuǎn)錄:按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法,取無酶 EP 管,每管加入逆轉(zhuǎn)錄試劑 2 μl、RNA 8 μl,于PCR儀中以37 ℃孵育15 min。逆轉(zhuǎn)錄后cDNA加入40 μl DEPC水進行稀釋備用。

    7.表達譜芯片檢測:逆轉(zhuǎn)錄完成的cDNA經(jīng)過標記、芯片雜交、清洗、染色、掃描,收集數(shù)據(jù)后采用AGCC等軟件進行分析,實驗方法按照既往文獻報道方案進行[8]。實驗完成后使用Agilent Feature Extraction(v10.7)軟件對雜交圖片進行分析并提取數(shù)據(jù),然后使用 Agilent GeneSpring 軟件對數(shù)據(jù)進行歸一化和差異分析。

    8.生物信息學(xué)分析:對差異表達的mRNA進行 KEGG(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)信息學(xué)分析匯總,篩查差異表達的相關(guān)信號通路。根據(jù)序列相似性和表達相關(guān)性進行比對分析,鑒定lnc-RNA與mRNA共表達子集。通過NCBI-Blast程序比對共表達子集的lnc-RNA和mRNA的序列相關(guān)性。

    三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

    采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計,茜素紅定量、堿性磷酸酶活性結(jié)果以表示,成骨 0天、14天應(yīng)力組與無應(yīng)力組的茜素紅定量、堿性磷酸酶定量結(jié)果采用兩樣本t檢驗進行比較,以P< 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、牽張應(yīng)力促進MSC成骨分化

    將MSC接種于膠原I孵育的6孔板中,置于FlexCell細胞牽張應(yīng)力系統(tǒng),在5﹪形變、0.1 Hz、4 h/d條件下進行成骨誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)應(yīng)力刺激下的MSC在成骨誘導(dǎo)第10天堿性磷酸酶活性達(265.3±31.2) U/L,而無應(yīng)力組MSC成骨誘導(dǎo)第10天堿性磷酸酶活性僅為(121.2±21.2) U/L,應(yīng)力組高于無應(yīng)力組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。此外,成骨誘導(dǎo)第14天應(yīng)力組MSC茜素紅染色較無應(yīng)力組MSC加深,應(yīng)力組MSC茜素紅定量OD值達1.46±0.19,無應(yīng)力組MSC茜素紅定量為0.62±0.08,應(yīng)力組高于無應(yīng)力組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。這提示牽張應(yīng)力可以促進MSC成骨分化(圖 1)。

    圖1 應(yīng)力刺激下MSC成骨分化能力觀察(茜素紅染色,×40)

    二、牽張應(yīng)力刺激下MSC成骨分化mRNA和lnc-RNA表達譜

    在成骨誘導(dǎo)第7天,分別提取無應(yīng)力組與應(yīng)力刺激組MSC的RNA進行全基因組mRNA+lnc-RNA表達譜芯片實驗。通過實驗,發(fā)現(xiàn)差異表達的mRNA共有598個,其中上調(diào)的mRNA有313個、下調(diào)的mRNA有285個(圖2A),差異表達的前5 位的mRNA詳見表1。此外,發(fā)現(xiàn)差異表達的lnc-RNA有329個,其中上調(diào)lnc-RNA有151個,下調(diào)的lnc-RNA有178個(圖2B),差異表達的前5位的lnc-RNA詳見表2。對差異表達的lnc-RNA進行分類,其中基因間lnc-RNA有92個、內(nèi)含子lnc-RNA有64個、正義鏈lnc-RNA有84個、反義鏈lnc-RNA有61個,雙向lnc-RNA有28個。這些結(jié)果提示應(yīng)力刺激下MSC的mRNA和lnc-RNA表達譜發(fā)生顯著改變,從而影響其成骨分化能力。

    表1 差異表達的前5位的mRNA

    表2 差異表達的前5位的lnc-RNA

    三、差異mRNA和Lnc-RNA的生物信息學(xué)分析

    為了探討差異mRNA相關(guān)的信號通路及其對應(yīng)功能,進行KEGG生物信息學(xué)分析。通過分析,發(fā)現(xiàn)有5個信號通路的表達變化具有統(tǒng)計學(xué)意義,分別為WNT/β信號通路、Cytokine-Cytokine receptor信號 通路、Cell Cycle信號 通 路、Focal Adhesion信號通路和Lipoic acid metabolism 信號通路。WNT信號通路是差異表達最顯著的信號通路,共有11個差異表達基因,其中WNT5a上調(diào)最為明顯(6.74倍)(表 3)。

    圖2 應(yīng)力刺激下MSC的mRNA和lnc-RNA表達譜

    為了探討WNT5a表達上調(diào)的機制,以WNT5a的表達和序列為基礎(chǔ),與差異表達的329個lnc-RNA進行共表達相關(guān)性分析和序列比對分析。通過分析,發(fā)現(xiàn)有3個差異表達的lnc-RNA與WNT5a具有共表達相關(guān)性,分別為 ENSG00000237298.2、ENSG00000241956.5 和ENSG00000187229.3(表4);通過序列對比分析,結(jié)果提示ENSG00000237298.2序列中與WNT5a的編碼序列有部分結(jié)合位點,提示W(wǎng)NT5a可能是受到ENSG00000237298.2表達調(diào)控的靶基因,將ENSG00000237298.2命 名 為lnc-RNA-SSR(long non-coding RNA Strain Stimulation Related)。 這 些結(jié)果提示在應(yīng)力刺激下,lnc-RNA-SSR的表達增加,從而上調(diào)WNT5a表達、促進MSC成骨分化。

    表3 KEGG分析差異表達信號通路

    表4 與WNT5a共表達的lnc-RNA分析

    討 論

    1974年,國外學(xué)者Friedenstein等[9]首次證實在骨髓微環(huán)境中存在成纖維細胞樣、長梭型細胞,并將其命名為間充質(zhì)干細胞(MSC),這些細胞作為骨髓微環(huán)境壁龕細胞,具有支持造血干細胞的重要功能。隨后的研究發(fā)現(xiàn),MSC廣泛存在于人體多種組織中,除了在骨髓中含量豐富之外,還存在于脂肪、臍帶等多種結(jié)締組織和外周血循環(huán)中[1]。新近研究顯示,MSC不僅具有強大的免疫調(diào)節(jié)能力和較低的免疫原性,還具有多項分化的功能,可以分化為成骨細胞、成脂細胞和成軟骨細胞。近年來,一系列的實驗均證實,MSC是人體內(nèi)成骨細胞的主要來源[3]。MSC強大的成骨分化功能使其可以廣泛應(yīng)用于骨折修復(fù)、損傷重建等組織再生工程中,具有廣泛的應(yīng)用前景[4]。

    機械應(yīng)力是一種廣泛存在于人體中的物理刺激信號,而牽張應(yīng)力是其中最重要的一類機械應(yīng)力刺激。牽張應(yīng)力存在于所有細胞微環(huán)境中,主要由肌肉產(chǎn)生并直接作用于骨骼,直接對骨骼相關(guān)細胞的增殖、凋亡和分化等功能產(chǎn)生重要影響,從而影響局部骨組織骨量[10]。當人體處于低牽張應(yīng)力情況下(失重、長期臥床),則會導(dǎo)致骨量降低;而當人體處于高牽張應(yīng)力、骨組織載荷增加情況下(運動員),則會增加機體骨量[11]。這主要是由于牽張應(yīng)力影響MSC成骨分化所決定的。MSC的成骨分化能力受到環(huán)境刺激、炎癥因子等多種因素的影響。大量實驗結(jié)果表明,適當增加牽張應(yīng)力刺激可以促進MSC成骨分化,牽張應(yīng)力預(yù)刺激下MSC移植后組織修復(fù)能力增強,大大提高了其在組織工程修復(fù)中的作用[12]。進一步深入探討牽張應(yīng)力刺激調(diào)控MSC成骨分化功能的機制,對于推動MSC臨床應(yīng)用意義重大。

    在本研究中,通過茜素紅和堿性磷酸酶實驗,進一步證實5﹪形變、0.1 Hz、4 h/d條件下牽張應(yīng)力刺激可以促進MSC的成骨分化能力,這與既往文獻報道的結(jié)果一致[12]。此外,筆者也對不同牽張應(yīng)力刺激條件進行摸索,發(fā)現(xiàn)過強的牽張應(yīng)力刺激會大量誘導(dǎo)MSC凋亡,從而影響其成骨分化。這與臨床觀察中,適當?shù)膽?yīng)力或受力可以促進骨折愈合,但是過大過強的應(yīng)力刺激則會導(dǎo)致骨折延遲愈合的現(xiàn)象一致。此外,筆者進一步對成骨誘導(dǎo)分化后、牽張應(yīng)力刺激下的MSC進行全基因組表達譜芯片分析。經(jīng)過分析,共發(fā)現(xiàn)對比無應(yīng)力組,牽張應(yīng)力刺激下MSC共有598個基因差異表達,其中上調(diào)的有313個、下調(diào)285個。筆者進一步對差異表達的基因進行生物信息學(xué)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達的基因匯聚后共有5個信號通路存在異常表達,分別為WNT信號通路、Cytokine-Cytokine receptor信號通路、Cell Cycle信號通路、Focal Adhesion信號通路和Lipoic acid metabolism 信號通路,提示這些信號通路是牽張應(yīng)力介導(dǎo)MSC成骨分化能力增強的關(guān)鍵。

    WNT信號通路是介導(dǎo)MSC成骨分化的重要通路之一。已有研究證實,WNT信號通路激活可以促進MSC成骨分化[13]。WNT5a是WNT家族的一員,作為外分泌分子,WNT5a主要發(fā)揮激活WNT通路的作用,廣泛調(diào)控機體內(nèi)的多種細胞,參與組織發(fā)育、腫瘤生長等多種生理和病理過程[14]。既往已有研究提示W(wǎng)NT5a可以促進MSC成骨分化[12]。在本研究中,發(fā)現(xiàn)WNT5a上調(diào)達6.74倍,為差異表達倍數(shù)最明顯的第二位基因。筆者推測,牽張應(yīng)力刺激導(dǎo)致MSC自分泌WNT5a增加,從而激活WNT信號通路,導(dǎo)致MSC成骨分化能力增強。

    長鏈非編碼RNA是近年來研究的熱點,是一種長度大于200 nt、不具備編碼蛋白質(zhì)能力的RNA片段。lnc-RNA包括基因間、內(nèi)含子等多種類型,存在于細胞核內(nèi)或細胞質(zhì)中,可以在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控多種細胞的功能[7]。已有研究發(fā)現(xiàn)lnc-RNA對MSC成骨分化的功能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[8],但在牽張應(yīng)力下MSC的lnc-RNA表達是否發(fā)生改變、是否參與了對MSC成骨分化功能的調(diào)控,目前尚未見研究。在本研究中,對成骨誘導(dǎo)分化后、牽張應(yīng)力刺激下的MSC進行l(wèi)nc-RNA表達譜芯片分析,發(fā)現(xiàn)牽張應(yīng)力刺激后MSC的lnc-RNA表達譜發(fā)生差異改變,差異表達lnc-RNA達329個,提示lnc-RNA參與了牽張應(yīng)力介導(dǎo)MSC成骨分化的過程。

    lnc-RNA可以通過多種方式參與基因表達調(diào)控,但是發(fā)揮調(diào)控功能需具備2個前提:一是lnc-RNA與靶基因具有表達相關(guān)性,即具有共表達關(guān)系;二是lnc-RNA需存在與靶基因可能結(jié)合的位點[15]?;谏鲜鰞蓚€條件,筆者對以目標基因WNT5a作為核心進行共表達分析和序列比對分析,以進一步明確具體調(diào)控牽張應(yīng)力刺激下MSC成骨分化的關(guān)鍵lnc-RNA。本研究發(fā)現(xiàn)lnc-RNASSR在牽張應(yīng)力刺激下上調(diào)達4.11倍,且其表達與WNT5a的表達具有相關(guān)性,這說明2個分子之間存在明顯的表達聯(lián)系。進一步通過生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)lnc-RNA-SSR與WNT5a編碼序列有部分預(yù)測結(jié)合位點,這個結(jié)果提示lnc-RNASSR可能與WNT5a的mRNA序列結(jié)合。已有許多研究發(fā)現(xiàn),lnc-RNA可與基因的轉(zhuǎn)錄本進行結(jié)合,對其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后修飾與調(diào)控作用,從而影響其表達水平[15]。筆者推測,lnc-RNA-SSR可能通過直接結(jié)合WNT5a編碼序列,以調(diào)控其表達水平改變,這需要在未來的研究中通過實驗進一步證明。此外,本研究雖還發(fā)現(xiàn)ENSG00000241956.5、ENSG00000187229.3與WNT5a有共表達關(guān)系,但由于生物信息學(xué)預(yù)測提示二者之間不存在結(jié)合位點,提示 ENSG00000241956.5、ENSG00000187229.3僅僅是成骨過程中伴隨出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本,不對WNT5a進行調(diào)控。

    綜上所述,在本研究中進一步證實牽張應(yīng)力刺激下MSC的lnc-RNA表達譜發(fā)現(xiàn)明顯變化、成骨分化能力顯著增強。這可能是由于lnc-RNA-SSR表達上調(diào),通過特異性調(diào)控WNT5a自分泌增加,從而介導(dǎo)WNT信號通路激活,最終導(dǎo)致MSC成骨分化增強。本研究探索了lnc-RNA表達譜在牽張應(yīng)力介導(dǎo)MSC成骨分化中的作用,對于促進MSC特異性分化及在組織再生工程中的應(yīng)用,具有重要意義。然而,本研究尚有不足,具體lnc-RNA-SSR調(diào)控WNT5a表達及WNT信號通路激活的機制尚未完全闡明,仍需要再未來的研究中進一步探索。

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