飲料化學(xué)污染物生物傳感檢測(cè)研究進(jìn)展

張 莉， 王慧婷， 張 文， 張 奇*， 毛 勁， 范志勇， 江 豐， 余婷婷， 張兆威， 李培武

(1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北武漢 430000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部生物毒素檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料作物產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(武漢)，湖北武漢 430072)

1 前言

飲料是一種供直接飲用，或用水沖調(diào)飲用的乙醇含量不超過0.5%的制品[1]，主要有碳酸飲料、茶飲料、咖啡飲料、果蔬飲料、蛋白飲料、礦泉水等。飲料能提供人體所需的水分和營(yíng)養(yǎng)成分，具有消除疲勞、提神、保健、娛樂等功能。我國(guó)的飲料工業(yè)起步于1980年，當(dāng)年全國(guó)飲料總產(chǎn)量不足30萬噸；2000年全國(guó)飲料總產(chǎn)量為1 490萬噸；2015年全國(guó)飲料總產(chǎn)量已經(jīng)突破1.7億噸，是1980年總產(chǎn)量的567倍[2]。然而，近年飲料質(zhì)量安全事件頻發(fā)。為了保障飲料質(zhì)量安全，我國(guó)于2015年11月頒布《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-飲料》(GB 7101-2015)，規(guī)定了飲料中化學(xué)污染物的最大限量標(biāo)準(zhǔn)：如展青霉素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等3種真菌毒素，阿維菌素等69種農(nóng)藥殘留，鉛等3種重金屬的最大限量標(biāo)準(zhǔn)。由于飲料化學(xué)污染物的限量標(biāo)準(zhǔn)日益嚴(yán)格，因此，亟需研究建立飲料中化學(xué)污染物的高靈敏檢測(cè)方法。

飲料化學(xué)污染物檢測(cè)技術(shù)主要有依托氣相色譜、液相色譜、質(zhì)譜等大型儀器的確證性檢測(cè)技術(shù)，以及微芯片、試紙條等快速檢測(cè)技術(shù)。依托大型儀器的確證性檢測(cè)技術(shù)主要用于微量或痕量組分的測(cè)定，這些技術(shù)具有靈敏度高、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。但因其儀器昂貴、操作環(huán)境要求高、技術(shù)難度大，前處理繁雜等不足，無法滿足當(dāng)前飲料質(zhì)量安全現(xiàn)場(chǎng)快速篩查的需求[3]。快速檢測(cè)方法用時(shí)短、操作簡(jiǎn)單，適宜于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)篩查。其中，生物傳感檢測(cè)技術(shù)作為一種先進(jìn)的快速檢測(cè)技術(shù)，將免疫反應(yīng)等產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)換為光電信號(hào)讀出，具有高靈敏度、高準(zhǔn)確性、高特異性等優(yōu)勢(shì)，適合大批量樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。目前，生物傳感技術(shù)已經(jīng)在生物技術(shù)[4]、食品安全[5 - 6]、環(huán)境檢測(cè)[7 - 8]、醫(yī)學(xué)[9 - 10]、農(nóng)學(xué)[11]等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。1962年，Clark等人研制了酶?jìng)鞲衅饔糜跈z測(cè)葡萄糖，開啟了生物傳感器發(fā)展的時(shí)代。隨后，Updike和Hicks成功研制出葡萄糖氧化酶電極，引起了各個(gè)領(lǐng)域科學(xué)家的高度重視和廣泛研究[12]。而隨著納米科學(xué)、分析科學(xué)、生物科學(xué)、納微電子加工技術(shù)的迅速發(fā)展及融合，生物傳感檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)成為近年來飲料質(zhì)量安全快速檢測(cè)篩查的新技術(shù)平臺(tái)。

2 生物傳感器的原理與分類

生物傳感檢測(cè)器主要由感受器和信號(hào)轉(zhuǎn)換器兩部分組成。感受器的主要部分是生物識(shí)別元件，包括抗原、抗體、適配體、酶、分子印跡等。識(shí)別元件與被測(cè)物質(zhì)特異性反應(yīng)引起光學(xué)、電化學(xué)、電學(xué)、熱學(xué)、力學(xué)或磁學(xué)等信號(hào)改變，其信號(hào)變化強(qiáng)度與待測(cè)物質(zhì)的含量具有直接或間接的相關(guān)性。信號(hào)轉(zhuǎn)換器主要由信號(hào)轉(zhuǎn)化元件構(gòu)成，包括光學(xué)元件(表面等離子共振等)、電化學(xué)電極、壓電裝置(石英微晶天平等)等[13]。信號(hào)轉(zhuǎn)換器可以將光、電化學(xué)、電、熱、力或磁信號(hào)的變化轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。通過校正和計(jì)算，光、電化學(xué)、電、熱、力或磁信號(hào)的變化可以轉(zhuǎn)化為電信號(hào)的改變量，從而測(cè)定待測(cè)物的含量或濃度。

生物傳感器的種類很多，根據(jù)感受器中生物識(shí)別元件所含的生物分子分類可分為：DNA傳感器、酶?jìng)鞲衅?、免疫傳感器、?xì)胞傳感器、組織傳感器、微生物傳感器等。根據(jù)信號(hào)轉(zhuǎn)換器的不同又可以分為：電化學(xué)生物傳感器、熒光生物傳感器、熱生物傳感器、磁生物傳感器、壓電生物傳感器等[14]。與傳統(tǒng)的分析檢測(cè)手段相比，生物傳感器結(jié)合了生物、化學(xué)、物理等各學(xué)科中的最新研究成果，具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)選擇性高，抗干擾能力強(qiáng)，通常不需要進(jìn)行復(fù)雜的樣品前處理；(2)體積小，有利于在線監(jiān)測(cè)；(3)可以進(jìn)行實(shí)時(shí)原位檢測(cè)；(4)靈敏度高、分析速度快、樣品用量少，可以重復(fù)多次使用；(5)分析成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它大型儀器分析，適于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域推廣應(yīng)用。

3 生物傳感檢測(cè)技術(shù)在飲料質(zhì)量安全檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1 重金屬生物傳感檢測(cè)

重金屬易在水環(huán)境和土壤中累積，且難以被微生物降解，可通過食物鏈影響人類健康。飲料中的重金屬主要來自飲料生產(chǎn)的原料以及金屬罐包裝物、加工設(shè)備，包括飲料用水、果蔬、茶、牛奶、咖啡豆等。飲料中的重金屬主要有Pb2+、Hg2+、Cu2+、Cd2+、Ni2+等?，F(xiàn)有重金屬檢測(cè)方法有原子吸收法(AAS)[15 - 16]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)法[17 - 18]、電感耦合等離子體-發(fā)射光譜法(ICP-OES)法[19 - 20]，但這些方法因?qū)z測(cè)環(huán)境要求高、儀器便攜性差，難以滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。

生物傳感檢測(cè)技術(shù)克服了基質(zhì)干擾的難題，飲料中化學(xué)污染物熒光和拉曼生物傳感檢測(cè)可以提高檢測(cè)靈敏度。熒光嗜鐵素是由銅綠假單胞菌在缺鐵狀態(tài)下分泌的鐵載體，Kun等將其作為生物識(shí)別元件研制出重金屬熒光生物傳感器，研究并建立了飲料中Cu2+(中性環(huán)境)[21]和Fe3+(酸性環(huán)境)[22]的高選擇性檢測(cè)技術(shù)。相對(duì)于目前的檢測(cè)Cu2+的方法，該傳感器更加簡(jiǎn)單，已成功地應(yīng)用于飲用水、海水和生物樣品中Cu2+的檢測(cè)，其結(jié)果與電感耦合等離子體質(zhì)譜法的結(jié)果一致。

Song等[23]研制了一種便攜式超靈敏納米棒陣列表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)傳感器用于水中痕量Hg2+的檢測(cè)。固定于SERS基片上的納米棒可以結(jié)合標(biāo)記有熒光染料的L-半胱氨酸寡核苷酸探針，當(dāng)待測(cè)液中存在Hg2+時(shí)，標(biāo)記有熒光染料的L-半胱氨酸寡核苷酸探針發(fā)生聚合，并游離出納米棒，生物傳感器檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度降低，檢測(cè)線性范圍為1 pmol/L～1 μmol/L，檢測(cè)限為0.16 pmol/L。基于SERS的Hg2+檢測(cè)技術(shù)容易實(shí)現(xiàn)便攜化，可廣泛應(yīng)用于大批量飲料質(zhì)量安全的現(xiàn)場(chǎng)篩查。

Wang等[24]發(fā)展了一種檢測(cè)Hg2+的生物傳感技術(shù)，該技術(shù)將巨磁阻(Giant Magnetoresistance，GMR)傳感技術(shù)和DNA有機(jī)結(jié)合。超順磁性的磁性納米粒子(MNPs)作為磁偶極子被用于交變電場(chǎng)磁化，磁化后MNPs產(chǎn)生的雜散電場(chǎng)強(qiáng)度與被約束在傳感器表面的MNPs的數(shù)量成正相關(guān)，從而間接與Hg2+的含量具有正相關(guān)性，因此可以實(shí)現(xiàn)Hg2+檢測(cè)。檢測(cè)限為10 nmol/L。T-Hg2+-T中間體使GMR生物傳感器對(duì)Hg2+具有高選擇性，因此，GMR生物傳感器具有高靈敏和實(shí)時(shí)信號(hào)輸出等優(yōu)點(diǎn)。

Gumpu等[25]研制的基于脲酶的生物傳感器；Hong等[26]研制的基于核酸內(nèi)切酶的生物傳感器實(shí)現(xiàn)了對(duì)Hg2+和Pb2+的高靈敏同步檢測(cè)。另外，基于DNA開發(fā)的傳感器進(jìn)一步提高了汞、鉻、鉛等重金屬檢測(cè)的特異性[27 - 29]。

3.2 農(nóng)藥殘留生物傳感檢測(cè)

目前，農(nóng)藥已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中必不可少的一部分，嚴(yán)重污染果蔬汁飲料、茶飲料、酒精飲料、咖啡類飲料以及植物蛋白飲料原材料，也會(huì)對(duì)飲料制造所需的水造成污染。飲料中常見的農(nóng)藥殘留包括有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留、有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留等。水果、茶葉中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留問題非常普遍，殘留的農(nóng)藥進(jìn)入加工的飲料中，殘留量一般是原果品、茶葉中的30%～50%[30]。傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留檢測(cè)的方法主要有氣相色譜法[31 - 33]、液相色譜法[34]以及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[35 - 36]。這些方法的檢測(cè)限低、可靠性強(qiáng)，但儀器昂貴、技術(shù)要求高、前處理步驟繁瑣。

基于可見光反射光譜，Koukouvinos等[37]發(fā)展了飲用水或酒樣中多組分農(nóng)藥殘留的同步生物傳感檢測(cè)技術(shù)，可同時(shí)檢測(cè)毒死蜱、抑霉唑和噻苯咪唑3種農(nóng)藥殘留，檢測(cè)限分別為60、60、80 pg/mL，回收率范圍為86%～116%。用5種葡萄酒樣進(jìn)行的比對(duì)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該傳感器檢測(cè)方法結(jié)果與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)方法結(jié)果高度一致。

有機(jī)磷類農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥能對(duì)人畜體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶產(chǎn)生不可逆的抑制作用，造成神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿的含量增加，導(dǎo)致人畜患病甚至死亡[38]。研究者利用有機(jī)磷類農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的致病機(jī)理研制了基于乙酰膽堿酯酶的生物傳感器。Caetano等[39]建立了基于碳糊電極的電化學(xué)乙酰膽堿酯酶生物傳感器，與HPLC法相比，該方法的檢測(cè)限較高，為30.4 μg/kg，但低于巴西對(duì)滅多威的限量標(biāo)準(zhǔn)(3 mg/kg)。該方法不需要前處理及后續(xù)的清理，省時(shí)省力。另外，樣品的提取不需要消耗大量的有機(jī)溶劑、分析用時(shí)短、選擇性好，適合大量樣品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)?；诳筛咝揭阴Ｄ憠A酯酶的含有殼聚糖、TiO2溶膠-凝膠、還原氧化石墨烯的多層固定基質(zhì)，Cui等[40]制備了一種高度穩(wěn)定的可再生電化學(xué)乙酰膽堿酯酶生物傳感器，并用于檢測(cè)白菜汁中的敵敵畏，檢測(cè)范圍為7.9～4 960 μg/kg，檢測(cè)限為6.4 μg/kg。

Mishra等[41]研發(fā)了自流動(dòng)農(nóng)藥殘留電化學(xué)生物傳感同步檢測(cè)技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)牛奶中毒死蜱氧磷、乙基對(duì)氧磷、馬拉氧磷3種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的同步檢測(cè)，測(cè)定的時(shí)間短，小于15 min。毒死蜱氧磷、乙基對(duì)氧磷、馬拉氧磷的檢測(cè)限分別為5.0×10-12mol/L、5.0×10-9mol/L、5.0×10-10mol/L，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9910。該方法通過檢測(cè)流經(jīng)流通池的各有機(jī)磷農(nóng)藥的量實(shí)現(xiàn)對(duì)各有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。在檢測(cè)過程中可以對(duì)樣品進(jìn)行多次取樣檢測(cè)，準(zhǔn)確度高，無假陽(yáng)性和假陰性，檢測(cè)成本低、靈敏、便攜，為牛奶中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了可能。

3.3 生物毒素生物傳感檢測(cè)

生物毒素也稱為天然毒素，它是一種由植物、動(dòng)物或微生物等代謝產(chǎn)生的、不可以自我復(fù)制的有毒物質(zhì)[42]。生物毒素主要包括植物毒素、動(dòng)物毒素、真菌毒素、細(xì)菌毒素和海洋毒素等，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的生物毒素有2 000多種[43]。其中，真菌毒素和海洋毒素與食品安全密切相關(guān)，這兩種毒素污染廣、毒性大、難防控，嚴(yán)重污染飲料生產(chǎn)用水以及堅(jiān)果、花生、玉米等蛋白飲料，果蔬汁、玉米汁飲料等飲料原料?，F(xiàn)有生物毒素檢測(cè)技術(shù)主要是基于色譜法[44]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[45]、酶聯(lián)免疫吸附法[46]等，不能滿足飲料生物毒素現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。

黃曲霉毒素(AFT)是由黃曲霉和寄生曲霉代謝產(chǎn)生的一類真菌毒素，天然的黃曲霉毒素根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異分為B1、B2、G1、G2四種[47]。其中，黃曲霉毒素B1(AFT B1)的毒性最強(qiáng),是已知真菌毒素中毒性最強(qiáng)的一種毒素。動(dòng)物攝入AFT B1后代謝產(chǎn)生黃曲霉毒素M1(AFT M1)，AFT M1的毒性僅次于AFT B1。Paniel等[48]開發(fā)了一種電化學(xué)免疫傳感器用于檢測(cè)牛奶中的超痕量AFT M1。該傳感器是基于辣根過氧化酶(HRP)作為標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析，檢測(cè)限為0.01 μg/kg，檢測(cè)范圍為0.01～0.25 μg/kg。與高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法等傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，該方法前處理簡(jiǎn)單(僅需樣品離心)，操作簡(jiǎn)單。

微囊藻毒素LR(MC-LR)是毒性最強(qiáng)的海洋毒素，Shi等[49]研究建立了自動(dòng)化在線光學(xué)生物傳感系統(tǒng)(Automated Online Optical Biosensing System,AOBS)用于微囊藻毒素LR的快速檢測(cè)和預(yù)警。共價(jià)固定在玻璃芯片表面上的囊藻毒素LR卵清蛋白(MC-LR-OVA)與樣品中的微囊藻毒素LR競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合待檢溶液中添加的熒光標(biāo)記抗體。結(jié)果顯示，檢測(cè)范圍為0.2～4 μg/L，檢測(cè)限為0.09 μg/L，回收率為90%～120%。該方法與高效液相色譜法驗(yàn)證結(jié)果顯示高度一致(R2=0.9762)。Zhang等[50]研制了三維多孔石墨烯傳感器用于檢測(cè)水中的微囊藻毒LR，石墨烯的多孔結(jié)構(gòu)和大的比表面積提高了檢測(cè)的靈敏度，該生物傳感器的檢測(cè)限為0.05 μg/kg，低于世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定的飲用水中微囊藻毒素LR的暫行限制濃度(1 μg/kg)。

赭曲霉毒素A(OTA)是曲霉屬和青霉屬菌產(chǎn)生的一類真菌毒素，常常污染豆制品、葡萄酒、啤酒、茶等，對(duì)人的腎臟、肝臟造成損傷，有較強(qiáng)的致畸形和致癌的作用，還具備免疫毒性[51]。Karczmarczyk等[52]基于耗散型石英晶體微天平(QCM-D)和識(shí)別特定分析物的抗體建立了快速、靈敏的檢測(cè)紅葡萄酒中赭曲霉毒素A的生物傳感器，并借助與二抗共軛的金納米粒子(AuNPs)使信號(hào)進(jìn)一步被放大。該生物傳感器的線性檢測(cè)范圍為0.2～40 μg/kg，檢測(cè)限為0.16 μg/kg。Yuan等[53]建立了表面等離子體共振(SRP)生物傳感器，用于檢測(cè)飲料中赭曲霉毒素A。由于OTA-聚乙二醇(PEG)-卵清蛋白(OVA)復(fù)合體的形成，提高了其特異性。該表面等離子體共振傳感器利用AuNPs增強(qiáng)信號(hào)，提高了其靈敏度，檢測(cè)限低至0.058 ng/mL。檢測(cè)中樣品只需用3%～5%的聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)提取，不需其他處理，前處理簡(jiǎn)單。

4 結(jié)論

飲料質(zhì)量安全問題已經(jīng)得到我國(guó)政府和消費(fèi)者的高度重視和廣泛關(guān)注。生物傳感檢測(cè)技術(shù)靈敏度高、準(zhǔn)確性高、特異性好，操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性高、耗時(shí)短。然而，現(xiàn)有的飲料化學(xué)污染物生物傳感器多局限于一種或兩種化學(xué)污染物的檢測(cè)，生物傳感器識(shí)別元件的壽命、穩(wěn)定性和非特異性結(jié)合方面依舊存在一定的局限性，不能滿足飲料復(fù)雜體系的現(xiàn)場(chǎng)、實(shí)時(shí)、超靈敏自動(dòng)化檢測(cè)需求。而隨著新型納米材料的合成、加工和集成技術(shù)不斷發(fā)展完善，微全分析檢測(cè)系統(tǒng)等將會(huì)進(jìn)一步提高生物傳感器的檢測(cè)靈敏度、通量，縮短檢測(cè)時(shí)間，簡(jiǎn)化檢測(cè)步驟，促使研制出集成化、微型化的飲料化學(xué)污染物生物傳感檢測(cè)技術(shù)，為飲料多種化學(xué)污染物混合污染檢測(cè)提供技術(shù)支撐。