海洋放線菌BH3A8代謝產(chǎn)物殺線蟲活性研究

田陽　何宗均　孫建華

摘 要：植物寄生線蟲的危害日趨嚴(yán)重，利用生物防治技術(shù)是控制線蟲危害的研究重點(diǎn)。對(duì)從渤海海域不同深度水樣中篩選出的具有殺線活性的菌株BH3A8代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，測(cè)定了BH3A8代謝產(chǎn)物殺線蟲譜和對(duì)南方根結(jié)線蟲的溫室防效以及對(duì)松材線蟲形態(tài)與運(yùn)動(dòng)頻率的影響。結(jié)果表明，BH3A8代謝產(chǎn)物對(duì)南方根結(jié)線蟲幼蟲毒力最強(qiáng)，對(duì)松材線蟲幼蟲毒力次之，對(duì)大豆孢囊線蟲幼蟲毒力最弱。在溫室測(cè)定中活性菌株發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線蟲防治效果為73.75%?；钚跃甏x產(chǎn)物明顯抑制松材線蟲運(yùn)動(dòng)頻率。中毒線蟲起初表現(xiàn)為蟲體扭曲、顫抖、痙攣，接著線蟲游動(dòng)緩慢、扭動(dòng)身軀，最后線蟲反應(yīng)遲鈍，擺動(dòng)減慢，首尾同側(cè)展開，標(biāo)志著線蟲死亡。蟲體死亡多為僵直狀態(tài)。BH3A8殺線蟲譜廣、效果好、使用成本低，在生產(chǎn)上具有很好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：海洋放線菌；活性菌株；殺線蟲活性代謝物；毒力；防效

中圖分類號(hào)：S476 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.11.003

線蟲在自然界分布廣泛，種類繁多，危害多種動(dòng)物和植物。植物寄生線蟲是植物侵染性病癥主要病原之一，廣泛寄生在各種植物的根、莖、葉、花、芽和種子上，一種植物可以有一種或者多種寄生線蟲，使植物發(fā)生各種病變，嚴(yán)重阻礙了農(nóng)林業(yè)的發(fā)展[1]。植物寄生線蟲的種類已達(dá)100多屬2 000多種[2-3]，農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)上的主要線蟲約1 100種[4]。植物寄生線蟲對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的危害很大，其中危害主要農(nóng)作物的寄生線蟲約500多種，其危害程度超過了細(xì)菌和病毒，僅次于真菌病害[5-7]。嚴(yán)重危害我國農(nóng)業(yè)、林業(yè)、經(jīng)濟(jì)作物的植物寄生線蟲已達(dá)100多種，有些植物寄生線蟲對(duì)作物的直接危害甚至比其他病、蟲、草害都嚴(yán)重，一般只要作物上發(fā)生植物寄生線蟲引起的病變，就可以使該作物減產(chǎn)10%～40%，在嚴(yán)重的情況下，可以減產(chǎn)70%～80%，最為嚴(yán)重的就是造成絕收[8-9]。

植物寄生線蟲的非生物防治方法主要包括農(nóng)業(yè)技術(shù)設(shè)施防治、抗性育種、物理防治和化學(xué)防治等4類。植物寄生線蟲目前還是主要采取化學(xué)殺線蟲劑進(jìn)行線蟲防治[10]，化學(xué)防治雖然效果好，但是其中大部分藥劑對(duì)人畜有劇毒、用量高、花費(fèi)大、嚴(yán)重污染環(huán)境和地下水源，破壞生態(tài)平衡，而且農(nóng)藥的殘留污染直接影響農(nóng)產(chǎn)品深加工的質(zhì)量和品質(zhì)，與此同時(shí)，化學(xué)農(nóng)藥在殺滅植物病原線蟲的同時(shí)，也殺傷了天敵及其他有益生物，影響了生物多樣性，破壞了生態(tài)平衡，化學(xué)殺線劑的應(yīng)用正逐步受到限制[11-13]。所以生物防治成為研究熱點(diǎn)。

在線蟲的生物防治中，抗生素的應(yīng)用是較為有效的防治途徑之一。海洋占地表面積的71%，海洋中生態(tài)環(huán)境較陸地復(fù)雜多變，所以海洋放線菌會(huì)通過一些特殊的代謝途徑來維持其生命活動(dòng)。近十幾年來，已經(jīng)從海洋微生物及其代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了許多結(jié)構(gòu)新穎、活性獨(dú)特的活性物質(zhì)，具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒、殺蟲等活性。目前有很多利用海洋真菌代謝產(chǎn)物殺線的報(bào)道，但是殺線種類較單一[14]。海洋放線菌主要分布在海底沉積物、海洋生物表面以及海水中，天津地處渤海灣，擁有豐富的海洋資源，因此，從中篩選到有殺線活性的菌株是有很大幾率的[15-17]。

海洋放線菌BH3A8是本課題組從渤海不同深度海水樣品中篩選出的具有殺線活性的生防菌株。本試驗(yàn)著重對(duì)其殺線蟲譜、溫室防效以及對(duì)松材線蟲形態(tài)與運(yùn)動(dòng)頻率的影響的初步機(jī)理進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試菌株海洋放線菌BH3A8菌株是天津市農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所微生物研究室篩選保藏的菌種。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 活性菌株BH3A8發(fā)酵液的制備 第1步，海洋放線菌菌株BH3A8的種子培養(yǎng)。挑取純化菌株至種子培養(yǎng)液中，28 ℃，200 r·min-1，震蕩培養(yǎng)3 d。第2步，海洋放線菌菌株BH3A8的發(fā)酵培養(yǎng)。配制發(fā)酵培養(yǎng)基，將種子液按1∶10比例轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)液中，28 ℃，200 r·min-1，震蕩培養(yǎng)7 d。將發(fā)酵液用甲醇萃取后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成8倍液后，放入-10 ℃冰箱保存。

1.2.2 供試線蟲的制備 （1）松材線蟲二齡幼蟲（J2）的制備。參照文獻(xiàn)[18]中松材線蟲J2制備方法。在無菌操作條件下，將灰葡萄孢霉（Batrytiscinerea）接種于察氏培養(yǎng)基上，21 ℃下避光培養(yǎng)7 d，待菌絲長滿培養(yǎng)皿后，將松材線蟲接種于該菌絲上進(jìn)行培養(yǎng)繁殖，26 ℃下避光培養(yǎng)5～7 d。通過貝爾曼（Baermann）漏斗法收集松材線蟲，無菌水離心洗滌3次，2 000 r·min-1離心3次，每次3 min。用無菌水將離心得到的松材線蟲稀釋為1 000頭·mL-1的懸液備用。

（2）南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）的制備。參照文獻(xiàn)[18]中根結(jié)線蟲J2制備方法。取溫室里接種南方根結(jié)線蟲60 d后的番茄的根，將根剪成1～2 cm的小段；把根放于200 mL 1%的次氯酸鈉溶液中，在豆?jié){機(jī)中攪拌剪切1～4 min；將懸浮液快速經(jīng)孔直徑0.15 mm，0.05 mm和0.03 mm的網(wǎng)篩，上下震蕩網(wǎng)篩，在0.03 mm的網(wǎng)篩上即可收集到游離的卵；隨即快速用無菌水沖洗0.03 mm的篩網(wǎng)上的的卵，以除去殘留的次氯酸鈉；再次沖洗震蕩根段以獲取更多的卵，用過篩法收集到離心管中，在底部加入40%蔗糖溶液20 mL梯度離心，3 500 r·min-1，5 min，吸取界面溶液過0.03 mm篩，用水沖洗篩子去除蔗糖，反向?qū)⒙褯_入三角瓶中。將卵置于自制孵化器中，加無菌水放置在25～28 ℃環(huán)境條件下孵化；4 d左右會(huì)孵出大量的J2，收集到滅菌三角瓶中，置于4 ℃冰箱中備用[19]。

（3）大豆孢囊線蟲二齡幼蟲（J2）的制備。參照文獻(xiàn)[18]中孢囊線蟲J2制備方法。將大豆種植在溫室的病原土壤中，孢囊成熟后挖出根系和根系周圍土壤，用過篩法分離孢囊，選取新鮮飽滿成熟的褐色孢囊放在自制孵化池中用0.5%次氯酸鈉溶液消毒3 min，再用無菌水沖洗3遍，加入自制孵化池中，在25 ℃，4 mmol·L-1ZnCl2溶液中孵化。4 d左右會(huì)孵化出大量的J2，收集至滅菌的三角瓶中，置于4 ℃冰箱備用。

1.2.3 活性菌株BH3A8發(fā)酵液殺線蟲譜的測(cè)定 采用梯度稀釋法，在滅菌的96孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入50 μL不同處理濃度的BH3A8菌株發(fā)酵液，以無菌水為陰性對(duì)照，以5×10-6的阿維菌素和苯線磷為陽性對(duì)照，分別向處理和對(duì)照中加入50 μL濃度為1 000 條·mL-1南方根結(jié)線蟲、松材線蟲和大豆孢囊線蟲3種不同線蟲，4次重復(fù)，放入25 ℃生化培養(yǎng)箱中，24 h后觀察線蟲形態(tài)，僵直或卷曲不動(dòng)的蟲體視為死亡，記錄線蟲死亡率，計(jì)算校正死亡率，線蟲死活判斷采用NaOH刺激法[20]。

死亡率=（死亡線蟲數(shù)/總線蟲數(shù)）× 100%

校正死亡率= [處理組線蟲死亡率-對(duì)照組線蟲死亡率/1-對(duì)照組線蟲死亡率] ×100%

1.2.4 活性菌株BH3A8發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線蟲的溫室防治效果 在平均溫度26 ℃左右、濕度68%左右的溫室大棚中，將黏土和沙子按1∶3混合，干熱滅菌后，放入15 cm×15 cm的塑料缽內(nèi)，每缽1 kg，之后移入三葉期番茄幼苗，每盆使用4倍放線菌BH3A8菌株發(fā)酵液50 mL進(jìn)行灌根處理，以清水作為陰性對(duì)照，5×10-6的苯線磷作為陽性對(duì)照，培養(yǎng)5 d后，在植物根周圍均勻地插3個(gè)小孔，將配置好的南方根結(jié)線蟲卵懸浮液滴入小孔中，每盆接種1 000個(gè)蟲卵。培養(yǎng)45 d后，根據(jù)根部癥狀評(píng)定病情指數(shù)，計(jì)算防治效果，并測(cè)量番茄植株的根長和根重。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理20個(gè)重復(fù)。

病情指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0級(jí)，健康無?。ǜ瞪蠠o根結(jié)）；1級(jí)，1%～20%根系上有根結(jié)，但根結(jié)相互不連接；2級(jí)，21%～40%的根系上有根結(jié)，僅少量根結(jié)相互連接；3級(jí)，41%～60%的根系上有根結(jié)，半數(shù)以下根結(jié)相互連接；4級(jí)， 61%～80%的根系上有根結(jié)，半數(shù)以上根結(jié)相互連接，部分主、側(cè)根變粗呈畸形；5級(jí)，80%以上的根系上有根結(jié)，且相互連接，多數(shù)主、側(cè)根呈畸形。

病情指數(shù)=[Σ（各級(jí)病根數(shù)×級(jí)數(shù)）/調(diào)查株數(shù)×5] ×100%

防治效果=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)/對(duì)照病情指數(shù)）×100%

1.2.5 活性菌株BH3A8代謝產(chǎn)物對(duì)松材線蟲運(yùn)動(dòng)頻率及形態(tài)變化的影響 （1）松材線蟲處理方法。線蟲的收集方法同上介紹的，用無菌水將離心得到的線蟲稀釋為約15 000 頭·mL-1的懸液，每200 μL分裝于滅菌的玻璃瓶中，同時(shí)分別加入兩株菌的代謝產(chǎn)物原液2 mL[21-23]，迅速混勻，計(jì)時(shí)測(cè)量，加滅菌水作對(duì)照，置于26 ℃培養(yǎng)箱中；（2）觀測(cè)方法。在供試線蟲分別處理0，2，4，8，16，24 h后，取平行對(duì)照和處理同時(shí)觀察。具體方法為取含10條左右線蟲的混合液點(diǎn)于表面皿上，室溫26 ℃解剖鏡下觀察線蟲的形態(tài)變化和擺動(dòng)頻率，同時(shí)用顯微成像儀進(jìn)行記錄；每個(gè)處理均觀測(cè)3次，擺動(dòng)頻率取3次觀測(cè)值的平均值[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性菌株BH3A8發(fā)酵液對(duì)3種線蟲幼蟲活性的影響

BH3A8菌株發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線蟲、松材線蟲和大豆孢囊線蟲幼蟲均有較好的抑制作用，對(duì)南方根結(jié)線蟲抑制效果最好、松材線蟲次之，對(duì)大豆孢囊線蟲效果最差。稀釋4倍的活性菌株發(fā)酵液對(duì)大豆孢囊線蟲、南方根結(jié)線蟲、松材線蟲的致死率均為100%；稀釋16倍后，對(duì)南方根結(jié)線蟲、松材線蟲的致死率仍為100%，但對(duì)大豆孢囊線蟲致死率顯著下降，僅為13.11%。活性菌株發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線蟲的抑制作用明顯高于松材線蟲，稀釋24倍后，對(duì)南方根結(jié)線蟲的致死率為100%，但對(duì)松材線蟲的致死率為46.31%。

2.2 活性菌株BH3A8發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線蟲溫室防效

在溫室，對(duì)盆栽番茄用BH3A8發(fā)酵液的4倍稀釋液進(jìn)行灌根處理，培養(yǎng)45 d后對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果見表2。

活性菌株的溫室試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株BH3A8發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線蟲的防效達(dá)73.75%，陽性藥物苯線磷對(duì)南方根結(jié)線蟲防效為81.25%，活性菌株發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線蟲的防效與陽性藥物防效相當(dāng)。此活性菌株代謝產(chǎn)物不僅在實(shí)驗(yàn)室測(cè)定中表現(xiàn)出了很高的殺線活性，在溫室測(cè)定中同樣表現(xiàn)出了較高的防效，具有開發(fā)成為線蟲生防制劑的潛能。

2.3 活性菌株BH3A8代謝產(chǎn)物對(duì)松材線蟲運(yùn)動(dòng)頻率及形態(tài)變化的影響

由結(jié)果可知，在2 h處理時(shí)間內(nèi)，處理組和對(duì)照組在刺激前后運(yùn)動(dòng)頻率有微小變化，但并不是很明顯；處理時(shí)間達(dá)到4 h后，對(duì)照組和處理組相比有較明顯的變化，分別為1.18 次·s-1和0.88 次·s-1；8 h時(shí)，對(duì)照組與處理組的平均頻率有了明顯變化，分別為1.02 次·s-1和0.62 次·s-1，線蟲反應(yīng)緩慢；16 h時(shí)，對(duì)照組與處理組平均頻率有了明顯變化，分別為0.99 次·s-1、0.36 次·s-1，處理組線蟲僅有少部分偶爾極其緩慢地伸展開，處理前后，16 h處理組的反應(yīng)靈敏度和運(yùn)動(dòng)頻率同4 h處理組運(yùn)動(dòng)頻率相比，幾乎呈等比下降，說明線蟲的反應(yīng)靈敏度及運(yùn)動(dòng)能力均隨著處理時(shí)間的增加幾乎呈線性下降趨勢(shì)；至24 h，對(duì)照組平均頻率為0.97 次·s-1，處理組的平均運(yùn)動(dòng)頻率為0 次·s-1，線蟲全部僵直死亡。根據(jù)線蟲的運(yùn)動(dòng)頻率，可以看出，處理組的線蟲運(yùn)動(dòng)頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組的運(yùn)動(dòng)頻率，即BH3A8的16倍稀釋發(fā)酵濾液減緩線蟲運(yùn)動(dòng)頻率的效果很明顯。

2.3.2 BH3A8活性代謝產(chǎn)物對(duì)松材線蟲形態(tài)的影響 在試驗(yàn)過程中，觀察到中毒線蟲起初表現(xiàn)為蟲體扭曲、顫抖、痙攣，接著線蟲游動(dòng)緩慢、扭動(dòng)身軀，最后線蟲反應(yīng)遲鈍，偶爾扭動(dòng)身軀，直至線蟲死亡、蟲體僵直（圖2）。

正常的線蟲形態(tài)為圖2（a）所示的“S”型，隨著時(shí)間的延長，發(fā)酵液處理后線蟲形態(tài)發(fā)生變化。處理組線蟲在短時(shí)間內(nèi)（<8 h）由正常的“S”型大量轉(zhuǎn)變?yōu)閼?yīng)激性的扭曲和纏繞狀態(tài)，有“Ω”型和“ξ”型如圖2（b，c），隨著時(shí)間的延長，中毒加深，蟲體由應(yīng)急狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檠由鞝顟B(tài)，有“7”型和“C”型如圖2（d，e），這一過程，以頭尾同向?yàn)轱@著特征，是線蟲瀕死的形態(tài)和行為標(biāo)記，最終成C形和直挺狀，線蟲死亡如圖2（f）。其瀕死過程的行為特征表現(xiàn)為應(yīng)激性的扭動(dòng)頻率加快、滾動(dòng)紐結(jié)，進(jìn)而痙攣性抖動(dòng)，隨后線蟲的動(dòng)頻減緩、擺幅減小、應(yīng)激反應(yīng)遲鈍，蟲體呈頭尾同側(cè)展開，標(biāo)志著線蟲即將死亡。死亡蟲體多呈僵直狀態(tài)。發(fā)酵濾液處理的線蟲與對(duì)照相比，線蟲的運(yùn)動(dòng)有明顯的減慢趨勢(shì)，明顯影響線蟲的活力。形態(tài)學(xué)的變化也證明了該菌株的發(fā)酵濾液確實(shí)有殺線蟲的活性，而對(duì)于線蟲的中毒機(jī)理有待于今后繼續(xù)研究。

3 結(jié)論與討論

放線菌菌株發(fā)酵液活性成分復(fù)雜，不同成分對(duì)不同線蟲的活性位點(diǎn)作用也不盡相同，所以同一菌株的發(fā)酵液對(duì)不同種類線蟲的生物活性存在很大的差異。菌株發(fā)酵液對(duì)于3種不同線蟲J2均有一定抑制作用。溫室防效試驗(yàn)中該菌株發(fā)酵液防效與陽性對(duì)照相當(dāng)，具有開發(fā)成環(huán)境友好生物農(nóng)藥的潛能，北方蔬菜大棚種植面積大，蔬菜根結(jié)線蟲侵染嚴(yán)重，若將其應(yīng)用于生產(chǎn)將對(duì)蔬菜根結(jié)線蟲防治產(chǎn)生重大影響。菌株發(fā)酵液對(duì)松材線蟲活動(dòng)有明顯抑制作用，其作用機(jī)理有可能是抑制神經(jīng)傳遞。BH3A8是一株具有廣泛應(yīng)用前景的生物防治菌株，對(duì)該菌代謝產(chǎn)物中活性物質(zhì)的分離純化和致死機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

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3 結(jié)論與討論

放線菌菌株發(fā)酵液活性成分復(fù)雜，不同成分對(duì)不同線蟲的活性位點(diǎn)作用也不盡相同，所以同一菌株的發(fā)酵液對(duì)不同種類線蟲的生物活性存在很大的差異。菌株發(fā)酵液對(duì)于3種不同線蟲J2均有一定抑制作用。溫室防效試驗(yàn)中該菌株發(fā)酵液防效與陽性對(duì)照相當(dāng)，具有開發(fā)成環(huán)境友好生物農(nóng)藥的潛能，北方蔬菜大棚種植面積大，蔬菜根結(jié)線蟲侵染嚴(yán)重，若將其應(yīng)用于生產(chǎn)將對(duì)蔬菜根結(jié)線蟲防治產(chǎn)生重大影響。菌株發(fā)酵液對(duì)松材線蟲活動(dòng)有明顯抑制作用，其作用機(jī)理有可能是抑制神經(jīng)傳遞。BH3A8是一株具有廣泛應(yīng)用前景的生物防治菌株，對(duì)該菌代謝產(chǎn)物中活性物質(zhì)的分離純化和致死機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

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放線菌菌株發(fā)酵液活性成分復(fù)雜，不同成分對(duì)不同線蟲的活性位點(diǎn)作用也不盡相同，所以同一菌株的發(fā)酵液對(duì)不同種類線蟲的生物活性存在很大的差異。菌株發(fā)酵液對(duì)于3種不同線蟲J2均有一定抑制作用。溫室防效試驗(yàn)中該菌株發(fā)酵液防效與陽性對(duì)照相當(dāng)，具有開發(fā)成環(huán)境友好生物農(nóng)藥的潛能，北方蔬菜大棚種植面積大，蔬菜根結(jié)線蟲侵染嚴(yán)重，若將其應(yīng)用于生產(chǎn)將對(duì)蔬菜根結(jié)線蟲防治產(chǎn)生重大影響。菌株發(fā)酵液對(duì)松材線蟲活動(dòng)有明顯抑制作用，其作用機(jī)理有可能是抑制神經(jīng)傳遞。BH3A8是一株具有廣泛應(yīng)用前景的生物防治菌株，對(duì)該菌代謝產(chǎn)物中活性物質(zhì)的分離純化和致死機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

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