食品中維生素B12和葉酸微生物檢測(cè)法的研究進(jìn)展

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(1.廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(廣東),廣東佛山 528300; 2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510300)

維生素B12(VB12)和葉酸均屬于B族維生素,它們參與人體重要的生理代謝過(guò)程,是一類不可或缺的水溶性維生素。針對(duì)VB12和葉酸的特殊功能,為迎合消費(fèi)者對(duì)營(yíng)養(yǎng)保健食品的需求,市場(chǎng)上越來(lái)越多的食品中添加這類維生素,如嬰幼兒配方食品、谷物產(chǎn)品和果汁飲料等,但其是否符合要求有待進(jìn)一步確證。為了評(píng)價(jià)食品標(biāo)簽標(biāo)注維生素含量的準(zhǔn)確性,美國(guó)FDA和European Directive 2002/46/EC均制定了一系列檢測(cè)食品中標(biāo)注添加維生素含量的法規(guī)[1]。2010年我國(guó)也出臺(tái)了檢測(cè)食品及乳品中VB12和葉酸的國(guó)家強(qiáng)制性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn),對(duì)其含量的檢測(cè)方法、檢出限、適用范圍等都做了明確的規(guī)定[2-4]。因此,加強(qiáng)VB12和葉酸檢測(cè)技術(shù)的研究,對(duì)消費(fèi)者的科學(xué)攝入量和監(jiān)管部門的有效控制添加量具有重要意義。目前,這兩類維生素的檢測(cè)技術(shù)主要分為微生物法和化學(xué)分析法,其中化學(xué)分析法很難滿足含量低和基質(zhì)復(fù)雜的食品中的檢測(cè)要求,多用于高含量的樣品(如保健品、藥物、復(fù)合添加劑等)[5-6],但對(duì)于含量低,且低于儀器檢出限的維生素仍然需要微生物法進(jìn)行測(cè)定。目前,本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目是VB12、葉酸、泛酸和生物素,其中泛酸的檢測(cè)方法相對(duì)比較穩(wěn)定,生物素的方法可以使用等同效果的檢測(cè)試劑盒,只有VB12和葉酸的檢測(cè)方法為傳統(tǒng)的微生物法,在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中不確定因素較多,不易掌握[7]。針對(duì)上述問題,本文對(duì)VB12和葉酸這兩種維生素的微生物檢測(cè)方法進(jìn)行歸納總結(jié),以期為將來(lái)的檢測(cè)提供指導(dǎo)性意見。

1 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中VB12和葉酸的微生物檢測(cè)法

我國(guó)現(xiàn)有維生素的微生物檢測(cè)法依據(jù)某種微生物對(duì)特定維生素的生長(zhǎng)依賴性,在特定條件下,其生長(zhǎng)速度與維生素含量成一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系,從而對(duì)維生素進(jìn)行定量。微生物法測(cè)定食品中的維生素源于美國(guó)官方分析家協(xié)會(huì)手冊(cè)(Association of Official Analytical Chemists,AOAC),GB 5413.14-2010[2]中檢測(cè)VB12和葉酸的微生物法等同采用AOAC的方法,只是格式和適用條件發(fā)生一些變化。利用微生物法檢測(cè)葉酸是當(dāng)前技術(shù)條件下國(guó)際官方機(jī)構(gòu)唯一認(rèn)可的檢測(cè)方法。GB 5009.211-2014[4]食品中葉酸的測(cè)定同樣采用的是微生物法。微生物法可靈敏檢測(cè)出具有生物活性的維生素,體現(xiàn)的是基質(zhì)中總維生素的含量,這是儀器分析方法難以做到的。該方法具有成本低、可操作性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),但同樣存在一定局限性,如耗時(shí)長(zhǎng)、準(zhǔn)確度較低、重復(fù)性差等。

2 食品中VB12微生物檢測(cè)方法的應(yīng)用研究

VB12又稱為氰鈷素或鈷胺素,因結(jié)合的基團(tuán)不同,在體內(nèi)有多種形式存在,以輔酶的形式參加一碳基團(tuán)的代謝。它是唯一含有金屬離子的水溶性維生素,在維持機(jī)體造血功能和健全神經(jīng)系統(tǒng)功能方面起關(guān)鍵作用。VB12微量缺乏會(huì)引起心情壓抑和慌亂,嚴(yán)重缺乏則易產(chǎn)生疲勞、神經(jīng)衰弱和老年性癡呆等[8-9],因此,研究VB12微生物檢測(cè)方法及技術(shù)對(duì)科學(xué)控制微量VB12在食品中的添加量具有重要的意義。

2.1 嬰幼兒食品和乳品中VB12微生物檢測(cè)方法的研究

我國(guó)現(xiàn)有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法為傳統(tǒng)微生物法,存在操作復(fù)雜、檢測(cè)周期長(zhǎng)、易受外部因素干擾等諸多問題,因此如何優(yōu)化現(xiàn)有的檢測(cè)方法成為研究熱點(diǎn)。魯盛靜等[10]針對(duì)GB 5413.14-2010[2]的測(cè)定方法,通過(guò)對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行控制,可獲得理想的精密度和重復(fù)性,RSD值為0.01%～0.03%(n=5)。針對(duì)上述標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)化,張麗宏等[11]則結(jié)合實(shí)際經(jīng)驗(yàn),從提取方法、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備、防污染措施及菌種保存等幾個(gè)方面,對(duì)該方法進(jìn)行補(bǔ)充說(shuō)明。為確定微生物法檢測(cè)奶粉中水溶性維生素的波動(dòng)性,劉志楠等[12]采取對(duì)同一樣品進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)的方法,最終確定VB12的穩(wěn)定性和精密度相對(duì)較好,RSD和CV值分別為0.05%和5%。測(cè)定用菌株是微生物法中至關(guān)重要的工具,不同菌株的特異性及其生長(zhǎng)特性是決定最終結(jié)果重復(fù)性和穩(wěn)定性的重要因素。高星等[13]選用大腸桿菌定量檢測(cè)奶粉中的VB12,標(biāo)準(zhǔn)曲線呈拋物線形,VB12含量與菌體生長(zhǎng)不成正比,分析可能是奶粉中存在某些抑制菌體生長(zhǎng)的因素,但對(duì)這種抑制因素以及如何排除它的影響,有待進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。

為提高微生物法測(cè)定VB12的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性,眾多研究學(xué)者采用微孔板式微生物法檢測(cè)試劑盒測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中VB12含量,相比傳統(tǒng)方法具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確和重復(fù)性好的特點(diǎn)[14-19]。對(duì)商品化的試劑盒而言,影響其試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素是標(biāo)準(zhǔn)溶液的保藏與制備,并且只做一個(gè)稀釋度的樣品也會(huì)對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確性造成影響,同時(shí)其價(jià)格昂貴,增加了檢驗(yàn)成本。針對(duì)這一問題,科研人員把研究方向也轉(zhuǎn)向基于微生物法的快速檢測(cè)方法。劉冬虹等[20]在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上,使用1.2 mL PP小管替代了傳統(tǒng)的試管,通過(guò)低溫保存測(cè)試菌液,縮小試驗(yàn)體積,實(shí)現(xiàn)縮短檢測(cè)周期和簡(jiǎn)化操作步驟,提高了結(jié)果準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性,為常規(guī)實(shí)驗(yàn)室利用微生物法快速測(cè)定VB12提供了參考。余文等[21]通過(guò)凍干萊士曼氏乳酸桿菌(Lactobacillusleichmannii)和濃度為5 ng/mL的VB12標(biāo)準(zhǔn)品,96孔板代替?zhèn)鹘y(tǒng)培養(yǎng),酶標(biāo)儀代替紫外分光光度計(jì),實(shí)現(xiàn)了快速檢測(cè)。與商品化試劑盒相比,成本更低廉,適用于大批量樣品檢測(cè)。王旻[22]通過(guò)研究國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和德國(guó)拜發(fā)微生物法測(cè)VB12試劑盒,優(yōu)化前處理過(guò)程,減少反應(yīng)體積,并找出試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)際質(zhì)量分?jǐn)?shù),建立了實(shí)驗(yàn)室適用的試劑盒方法。

2.2 其他食品中VB12微生物檢測(cè)方法的研究

目前,GB 5413.14-2010[2]中檢測(cè)VB12方法的研究對(duì)象為嬰幼兒食品和乳品,對(duì)于其他食品的檢測(cè)方法尚沒有明確規(guī)定。基于此,針對(duì)其他食品中VB12的檢測(cè)方法陸續(xù)開展研究,主要以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的方法為研究基礎(chǔ)。微生物法中一個(gè)關(guān)鍵的步驟就是如何從復(fù)雜的基質(zhì)中提取目標(biāo)維生素,其對(duì)結(jié)果的影響占整個(gè)實(shí)驗(yàn)誤差的很大部分[23]。因此,提取方法的優(yōu)化主要基于4個(gè)方面:基質(zhì)的特性;基質(zhì)中維生素的存在形式(原生形式和添加形式的比重);維生素對(duì)pH和熱的穩(wěn)定性;分析方法的選擇性和特異性。林耀文等[24]在GB 5413.14-2010[2]檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上,通過(guò)優(yōu)化樣品前處理方式,建立了微生物法測(cè)定含乳飲料中VB12含量的方法,檢出限可達(dá)0.04 ng/mL,有效解決了含乳飲料中VB12含量低的問題。王志偉等[25]為測(cè)定燕麥中的VB12含量,以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法為參照,對(duì)比采用添加淀粉酶的前處理方式,結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶解處理法有更好的適用性。高志斌[26]通過(guò)優(yōu)化微生物檢測(cè)方法,測(cè)定功能性飲料中VB12的含量,該方法重現(xiàn)性好,靈敏度高,能夠滿足日常檢驗(yàn)的定量分析。陳亞波等[27]同樣也建立了微生物法檢測(cè)維生素飲料中VB12的定量方法,該方法靈敏度和精密度高,測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。但此方法較難掌握,需嚴(yán)格按照要求操作每一步,并盡量保持每次的試驗(yàn)條件一致,從而保證試驗(yàn)的重復(fù)性及符合精密度要求。蔣孟虹等[28]基于微生物法,建立了腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)粉劑中微量VB12含量的測(cè)定方法,該方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠,適用于該類產(chǎn)品中VB12含量的測(cè)定。

3 食品中葉酸微生物檢測(cè)方法的應(yīng)用研究

葉酸(又稱為維生素B9)是人體許多生化反應(yīng)的輔酶。葉酸缺乏可引起細(xì)胞性貧血和粒細(xì)胞減少,還與新生兒神經(jīng)管畸形有關(guān),也可導(dǎo)致出生缺陷發(fā)生率上升,如唐氏綜合癥、先天性心臟病以及唇腭裂等[29]。孕婦在懷孕期間一般需要補(bǔ)充葉酸,缺乏可引起早產(chǎn)、流產(chǎn)等不良妊娠[30]。

微生物法測(cè)定葉酸過(guò)程中使用試管進(jìn)行培養(yǎng),在大批量檢測(cè)時(shí),工作量非常大,96孔酶標(biāo)板的引用大大提高了工作效率?；矢φ盏萚31]建立了96孔板微生物法微量測(cè)定人血漿和紅細(xì)胞內(nèi)葉酸含量的方法,該方法培養(yǎng)基使用量少、檢測(cè)時(shí)間短、重復(fù)性好和檢測(cè)樣本量大。同樣是96孔板微生物法,徐文婕等[32]則將甘油冷凍保存乳酸桿菌氯霉素耐藥株與96孔酶標(biāo)板相結(jié)合,極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間,能測(cè)定單和多谷氨酸葉酸,靈敏度能達(dá)到ng水平,具有較高的重現(xiàn)性。上述兩種方法均可用于其他生物組織和食品中葉酸含量的測(cè)定。張慧等[33]通過(guò)改進(jìn)菌株的保存和傳代,優(yōu)化樣液制備和加樣體積,結(jié)合96孔酶標(biāo)板技術(shù),建立一種高效快速檢測(cè)嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量的微生物方法。該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.9992,檢出限為2 μg/100 g,檢測(cè)周期縮短為2 d。李飛飛等[34]考察了新型維生素檢測(cè)試劑盒測(cè)定奶粉中葉酸含量的檢測(cè)效果,該試劑盒具有較好地準(zhǔn)確度、精密度和穩(wěn)定性,相比國(guó)標(biāo)法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好。張旺等[35]采用德國(guó)IFP微孔板試劑盒檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù),與GB 5413.16-2010[3]方法相比,降低了菌種在保存、傳代中發(fā)生污染和突變的可能性,提高了實(shí)驗(yàn)的可操作性。為了更加精確地計(jì)算,該研究還創(chuàng)建了四次方程進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的計(jì)算。同樣地,唐靚等[36]也曾指出干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)標(biāo)準(zhǔn)管的OD值隨著葉酸濃度增加而增長(zhǎng)趨緩,若使用線性方程,求得的葉酸濃度不準(zhǔn)確,建議使用4階方程來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,使計(jì)算結(jié)果更為精確。蔡雙福等[37]從維生素提取、試劑與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制、菌株接種等方面對(duì)GB 5413.16-2010[3]的測(cè)定方法進(jìn)行改進(jìn),使步驟簡(jiǎn)化,準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性與國(guó)標(biāo)法相似。張旭等[38]比較酪乳酸桿菌(Lactobacilluscasei)和糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis)測(cè)定強(qiáng)化食品中葉酸的含量,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩種檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性差異不大(p>0.05),實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,兩種微生物都是良好的實(shí)驗(yàn)選擇,為用微生物法測(cè)定葉酸提供多一種參考。唐靚等[39]將微生物法與高效液相色譜法相比較,發(fā)現(xiàn)前者不僅可以測(cè)定復(fù)雜樣品中的化合物形式的葉酸,而且對(duì)于添加劑形式的葉酸與高效液相色譜法具有同樣的準(zhǔn)確度,其檢測(cè)限可達(dá)到0.01 ng/mL。馬景宏等[40]建立了用微生物法測(cè)定保健食品中葉酸含量的方法,并對(duì)其精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行分析,為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制訂和該項(xiàng)目的檢驗(yàn)提供參考。

葉酸的衍生物較多,食品中部分葉酸以與蛋白結(jié)合的方式存在,再加上干擾物的影響,使葉酸的測(cè)定具有一定困難,因此必需采用合適的樣品前處理方法對(duì)葉酸進(jìn)行降解和提取。曾有學(xué)者報(bào)道,20個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室用微生物法檢測(cè)大豆、魚粉和早餐麥片中的葉酸含量,其中17個(gè)實(shí)驗(yàn)室用酪乳酸桿菌(Lactobacilluscasei),3個(gè)實(shí)驗(yàn)室用糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis),上述三種產(chǎn)品的變異系數(shù)分別為24%、35%和24%,變異范圍如此寬泛主要?dú)w因于葉酸提取的操作不同[41]。王竹[42]則采用微生物法針對(duì)不同類食物研究其前處理方法對(duì)葉酸檢測(cè)結(jié)果的影響,發(fā)現(xiàn)適宜的前處理方法有助于獲得最大檢出結(jié)果。由上可見,樣品前處理在葉酸的檢測(cè)分析中是一個(gè)既耗時(shí)又極易引入誤差的步驟,處理過(guò)程是否有效將直接影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

4 結(jié)論與展望

食品中VB12和葉酸的微生物檢測(cè)方法正處于優(yōu)化和開發(fā)創(chuàng)新的階段,一方面不斷研究更加簡(jiǎn)便、快捷、干擾小的樣品前處理方法,一方面開發(fā)可進(jìn)一步提高檢測(cè)準(zhǔn)確性和靈敏度的快速檢測(cè)方法,這對(duì)規(guī)范使用與提升利用率具有較大的促進(jìn)作用。微生物法作為檢測(cè)維生素的經(jīng)典有效方法,具有其自身的局限性,然而，隨著新技術(shù)的不斷發(fā)展,該方法已不再是檢測(cè)維生素的黃金標(biāo)準(zhǔn)。目前,GB/T 5009.217-2008中采用高效液相色譜法檢測(cè)保健食品中的VB12,該方法在檢測(cè)一種或多種水溶性維生素時(shí)更加快捷、靈敏和準(zhǔn)確[43-44]。為拓寬檢測(cè)方法的應(yīng)用范圍,高通量、多組分同時(shí)檢測(cè)將是維生素檢測(cè)的主要發(fā)展趨勢(shì)。任何檢測(cè)方法都存在利弊,針對(duì)不同的食品基質(zhì),選擇合理的檢測(cè)技術(shù),充分發(fā)揮該技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn),有效監(jiān)控食品中維生素的添加量,對(duì)保證消費(fèi)者的營(yíng)養(yǎng)全面具有重要意義。