16S rRNA基因測(cè)序在法醫(yī)學(xué)中的研究進(jìn)展

宋國(guó)慶 ，曹 禹 ，李 輝 ，馬 克 ，趙雪瑩 ，鄒凱南 ，周懷谷

（1.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，上海 200032；2.上海市公安局物證鑒定中心 法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市現(xiàn)場(chǎng)物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200083；3.上海市刑事科學(xué)技術(shù)研究院，上海 200083）

微生物無處不在，生態(tài)環(huán)境中的微生物在地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮著重要的生態(tài)作用，在人體內(nèi)的微生物更是廣泛參與免疫、消化、代謝等生理過程。早期的微生物研究主要依靠純培養(yǎng)分離的方法，1998年，HANDELSMAN等[1]在研究土壤微生物時(shí)將環(huán)境中的全部微生物基因組當(dāng)作研究對(duì)象并提出“宏基因組學(xué)”的概念，有別于傳統(tǒng)的微生物研究，宏基因組學(xué)無須分離純培養(yǎng)微生物，克服了傳統(tǒng)研究中大多數(shù)微生物不能被大量培養(yǎng)、無法被測(cè)序的缺陷，更拓展了微生物的研究方法，可以從群落水平上揭示微生物及其相互之間的作用機(jī)理[2]。細(xì)菌是微生物的主要類群之一，在細(xì)菌中，主要存在 3種核糖體 RNA（5S、16S、23S），其中16S rRNA是細(xì)菌核糖體RNA的小亞基，該亞基的編碼基因?yàn)?6S rDNA，由于DNA容易提取并相對(duì)穩(wěn)定，所以一般進(jìn)行細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)或功能分析時(shí)均選取16S rDNA。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，特別是高通量測(cè)序（high-throughput sequencing，HTS），又稱大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)（massively parallel sequencing，MPS）的出現(xiàn)，生命科學(xué)領(lǐng)域掀起了新的技術(shù)革命[3-4]，16S rDNA的研究也進(jìn)入了新的發(fā)展階段。微生物16S rDNA作為種群分類的系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記，使得非培養(yǎng)微生物的發(fā)現(xiàn)和研究成為可能，同時(shí)極大程度地促進(jìn)了微生物學(xué)的發(fā)展[5]。

16S rDNA分子大小適中，由于功能上高度保守，而序列不同位置的變異速率不同，其進(jìn)化具有良好的時(shí)鐘特性，所以16S rDNA作為分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌物種分類學(xué)的研究中[6]。16S rDNA由9個(gè)高變區(qū)和10個(gè)保守區(qū)構(gòu)成，保守區(qū)反映細(xì)菌物種間的親緣關(guān)系，可根據(jù)其序列設(shè)計(jì)細(xì)菌的通用擴(kuò)增引物，而高變區(qū)則反映細(xì)菌物種間的差異，可根據(jù)其序列設(shè)計(jì)通用引物對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定分類，雖然高變區(qū)無法準(zhǔn)確地將所有細(xì)菌分類到種屬水平，但依靠某些高變區(qū)仍可在特定的分類水平上預(yù)測(cè)細(xì)菌。例如：V3區(qū)在鑒定檢測(cè)病原體的種屬方面效果最佳；V4區(qū)為半保守高變區(qū)，在門類鑒定水平與完整16S rDNA序列的分辨率相近；V6區(qū)在鑒定炭疽病菌方面最為準(zhǔn)確[7-8]。由于法庭科學(xué)領(lǐng)域更關(guān)注個(gè)體間的分類特征差異與檢測(cè)鑒定時(shí)效的特點(diǎn)，無須過多關(guān)注基因功能相關(guān)的編碼區(qū)序列，因此，16S rDNA在法醫(yī)學(xué)檢測(cè)中有很強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值?；?6S rDNA保守區(qū)設(shè)計(jì)測(cè)序引物，建立各個(gè)可變區(qū)的復(fù)合擴(kuò)增體系，利用HTS和生物信息學(xué)分析方法檢測(cè)出生物檢材中微生物群落的結(jié)構(gòu)特征，是目前法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的新熱點(diǎn)。雖然多數(shù)工作還在實(shí)驗(yàn)階段，但16S rDNA基因測(cè)序分析輔助偵查已經(jīng)開始初步應(yīng)用于法醫(yī)實(shí)踐工作[9]。早在20世紀(jì)，就有人提出尸體附近土壤微生物演替可以預(yù)測(cè)死亡時(shí)間[10]，發(fā)展至今，微生物學(xué)已經(jīng)在死亡時(shí)間推測(cè)、死后毒（藥）物分析、個(gè)體識(shí)別以及藥物濫用等方面都展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力和價(jià)值[9，11-14]。本文闡述了16S rDNA基因測(cè)序應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究方法和相關(guān)測(cè)序技術(shù)，綜述了其測(cè)序在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展，探討了16S rDNA在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用價(jià)值和潛力。

1 16S rRNA的相關(guān)測(cè)序技術(shù)

1.1 第一代測(cè)序技術(shù)

以Sanger提出的雙脫氧核苷酸鏈終止法和Maxam提出的化學(xué)降解法為代表的第一代測(cè)序技術(shù)在1977年完成第一個(gè)基因組序列（噬菌體X174）[15]，VAINIO等[16]研究活性淤泥中的培養(yǎng)樣本和未培養(yǎng)樣本，從多個(gè)菌落中提取16S rDNA并通過Sanger測(cè)序法來檢測(cè)微生物種群結(jié)構(gòu)差異，發(fā)現(xiàn)未培養(yǎng)的樣本中絕大部分16S rDNA序列是未知的，但當(dāng)時(shí)基因數(shù)據(jù)庫并沒有這些序列信息，只能推斷可能是變形桿菌的某種亞型，無法準(zhǔn)確鑒別。其他一些對(duì)16S rDNA測(cè)序的研究中也有類似發(fā)現(xiàn)，但受限于當(dāng)時(shí)的技術(shù)條件和數(shù)據(jù)庫信息，無法做進(jìn)一步研究[17-18]。第一代測(cè)序技術(shù)結(jié)果精確并且操作簡(jiǎn)單，促進(jìn)了微生物在核酸序列檢測(cè)上的發(fā)展，但由于其通量所限，無法滿足微生物基因組學(xué)的測(cè)序需求[19]。

1.2 HTS技術(shù)

相比于第一代測(cè)序技術(shù)，HTS更適合微生物基因組學(xué)的研究，其通量更高，且無須進(jìn)行微生物培養(yǎng)就可同時(shí)對(duì)樣本中所有微生物進(jìn)行檢測(cè)，這使得對(duì)微生物群落進(jìn)行細(xì)致分類和功能預(yù)測(cè)成為可能，HTS已迅速成為微生物基因組學(xué)的主要檢測(cè)方法。454測(cè)序平臺(tái)作為早期的HTS平臺(tái)，通量和準(zhǔn)確率遠(yuǎn)超于當(dāng)時(shí)基于Sanger測(cè)序法的毛細(xì)管電泳[20]，同時(shí)有學(xué)者開始將微生物學(xué)與法醫(yī)學(xué)鑒定結(jié)合[21-22]。KAKIZAKI等[23]利用454測(cè)序平臺(tái)對(duì)溺水死者體內(nèi)器官微生物16S rDNA位點(diǎn)的V7和V8兩個(gè)高變區(qū)進(jìn)行特異性擴(kuò)增和測(cè)序，這也是首次使用HTS技術(shù)來進(jìn)行溺水死亡的法醫(yī)學(xué)鑒定。BENBOW等[24]通過454測(cè)序平臺(tái)對(duì)16S rDNA基因擴(kuò)增測(cè)序，發(fā)現(xiàn)水中腐敗尸體表面的細(xì)菌在夏季和冬季有著明顯的差異。近年來，其他通量更高、成本更低的測(cè)序技術(shù)平臺(tái)迅速發(fā)展，454測(cè)序平臺(tái)被逐漸淘汰到市場(chǎng)邊緣，目前主流的微生物基因組測(cè)序平臺(tái)有Illumina測(cè)序平臺(tái)（美國(guó)Illumina公司）和Ion TorrentTM測(cè)序平臺(tái)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），在16S rDNA的研究中均有所應(yīng)用[25-26]。

Illumina測(cè)序平臺(tái)的主要測(cè)序原理是邊測(cè)序邊合成（sequencing by synthesis，SBS）技術(shù)和可逆終止反應(yīng)，這種方法很大程度上避免了同聚物測(cè)序時(shí)的相關(guān)錯(cuò)誤和遺漏，在短時(shí)間內(nèi)可以獲得海量測(cè)序數(shù)據(jù)[27]。根據(jù)不同的研究目的，可選擇最初的HiSeq及之后推出的 MiSeq、NextSeq、MiniSeq 和 NovaSeq 等測(cè)序平臺(tái)。除了這些常規(guī)通用的平臺(tái)外，美國(guó)Illumina公司還推出了專門適用于法醫(yī)遺傳學(xué)應(yīng)用的MiSeq FGx測(cè)序平臺(tái)。Illumina測(cè)序平臺(tái)高精確度的數(shù)據(jù)和簡(jiǎn)化的工作流程非常適合法醫(yī)微生物學(xué)的研究，基于該平臺(tái)的Nextera XT DNA文庫制備試劑盒縮短了文庫制備過程，靶向擴(kuò)增16S rDNA的V3和V4高變區(qū)并針對(duì)擴(kuò)增子優(yōu)化，得到微生物的系統(tǒng)發(fā)育分類信息。HABTOM等[28]比較了目前實(shí)驗(yàn)室常見土壤微生物分析技術(shù)的有效性和可靠性，靶向擴(kuò)增16S rDNA的V4高變區(qū)，結(jié)果表明，在土壤微生物研究中，MiSeq測(cè)序平臺(tái)的表現(xiàn)優(yōu)于Ion PGMTM&Ion ProtonTM快速高通量測(cè)序（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）和Roche 454超高能量測(cè)序（美國(guó)Roche公司），但得出準(zhǔn)確結(jié)論仍然需要系統(tǒng)的多因素分析。

Ion TorrentTM測(cè)序平臺(tái)進(jìn)入HTS市場(chǎng)較晚，這一平臺(tái)擯棄了主流測(cè)序儀器的光學(xué)系統(tǒng)而采用半導(dǎo)體測(cè)序，將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，這種基于電化學(xué)檢測(cè)的半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)憑借其測(cè)序效率和價(jià)格優(yōu)勢(shì)迅速成為主流HTS平臺(tái)之一。至今為止，共發(fā)布了四種Ion TorrentTM測(cè)序平臺(tái)，分別是Ion PGM（2010年）、Ion Proton（2012 年）、Ion S5（2015 年）和 Ion S5XL（2015年）。IonTorrentTM測(cè)序平臺(tái)半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)化了16S rDNA的研究過程，縮短了研究時(shí)間，其成本也是目前市場(chǎng)主流測(cè)序平臺(tái)中最低的，為實(shí)驗(yàn)室提供了一種經(jīng)濟(jì)高效的選擇[29-30]?；谠撈脚_(tái)的宏基因組試劑盒Ion 16STMMetagenomics試劑盒可以多重?cái)U(kuò)增細(xì)菌16S rDNA七個(gè)高變區(qū)（V2～V9），從種屬水平上獲得微生物群落的信息。JUNEMANN等[31]最早在Ion TorrentTM測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行微生物學(xué)研究，通過靶向擴(kuò)增16S rDNA的V6來比較兩種不同治療方案對(duì)慢性牙周炎患者齦下菌群差異和變化，從側(cè)面驗(yàn)證了微生物學(xué)在疾病治療評(píng)價(jià)中的重要性。YOUNG等[32]利用Ion PGMTM測(cè)序系統(tǒng)比較了針對(duì)不同靶基因的四種分子標(biāo)記的重復(fù)性和辨識(shí)度，并設(shè)置了空白對(duì)照組，以區(qū)分不同地點(diǎn)的土壤樣品。

1.3 16S rDNA的分析方法

16S rDNA作為目前法醫(yī)微生物學(xué)的主要研究對(duì)象，其基本研究流程包括微生物DNA的提取、16S rDNA高變區(qū)的PCR模板、文庫構(gòu)建、模板制備、上機(jī)測(cè)序和測(cè)序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析。而數(shù)據(jù)分析流程主要包括：（1）測(cè)序數(shù)據(jù)的預(yù)處理。由于測(cè)序過程中各種影響因素會(huì)導(dǎo)致測(cè)序錯(cuò)誤的發(fā)生，所以需要在分析之前排除或過濾這些數(shù)據(jù)，包括接頭、引物及標(biāo)簽序列的去除，低質(zhì)量序列過濾，序列去噪，嵌合體去除和數(shù)據(jù)均一化處理。（2）操作性分類單元（operational taxonomic unit，OTU）表的建立。OTU是指通過一定的距離度量方法計(jì)算兩兩不同序列之間的相似性，繼而設(shè)置特定的分類閾值，進(jìn)行聚類操作，形成不同的分類單元，在進(jìn)行微生物多樣性分析的時(shí)候，通常需要引入OTU，序列之間的相似水平大于97%[33]則劃分為同一種微生物。通過將OUT的代表序列與相應(yīng)的微生物數(shù)據(jù)庫比對(duì)，進(jìn)行物種注釋并建立OTU的系統(tǒng)發(fā)育樹。（3）后續(xù)分析。包括Alpha多樣性（樣本內(nèi)）、Beta多樣性（樣本間）、物種豐度及群落結(jié)構(gòu)等分析，從而得到微生物群落內(nèi)和群落之間的相互聯(lián)系和代謝特征等數(shù)據(jù)信息[34]。

2 16S rDNA測(cè)序在法醫(yī)學(xué)中的研究進(jìn)展

2.1 生物檢材鑒定

判斷犯罪現(xiàn)場(chǎng)遺留的生物檢材類型和來源不僅是法醫(yī)物證學(xué)的重要內(nèi)容，更是重建犯罪現(xiàn)場(chǎng)的重要依據(jù)。實(shí)際檢案中，人體生物性物質(zhì)來源鑒定對(duì)作案過程的重建具有重要意義。傳統(tǒng)上，生物檢材的檢測(cè)主要依靠免疫反應(yīng)或酶學(xué)試劑盒等方法，但存在假陽性和假陰性的干擾。生物檢材，如唾液、糞便及陰道分泌液等，含有大量的微生物，通過分析體液樣本中微生物群落的種屬、構(gòu)成和豐度可以達(dá)到區(qū)分、鑒別不同體液的目的，所以，微生物檢測(cè)有望成為常規(guī)技術(shù)的補(bǔ)充[35]。GIAMPAOLI等[36]基于各種生物檢材的微生物特征，先通過16S rDNA鑒定某幾種細(xì)菌的存在，然后通過實(shí)時(shí)定量PCR（real time PCR，RT-PCR）對(duì)微生物群落中某些基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增并檢測(cè)特定微生物信號(hào)，測(cè)定不同體液中這幾種細(xì)菌的濃度，以達(dá)到體液鑒定的目的，其研究成功分辨出唾液和糞便中的陰道分泌液。隨后，研究團(tuán)隊(duì)將這項(xiàng)成果商業(yè)化，形成ForFLUID試劑盒。經(jīng)八個(gè)國(guó)家的八個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)5個(gè)樣品（其中1個(gè)為陰性對(duì)照）進(jìn)行盲測(cè)，均可對(duì)陰道分泌液樣本準(zhǔn)確識(shí)別，各實(shí)驗(yàn)室還使用自己的樣本（包括唾液、糞便及陰道分泌液）進(jìn)行驗(yàn)證，除了2個(gè)糞便樣本外，其他樣本均可判斷是否含有陰道分泌液，證明了其穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性[37]。HANSSEN等[38]通過HTS對(duì)6種相互對(duì)照的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停儍敉僖骸⑼僖?棉簽拭子、唾液+膠條、皮膚唾液+棉簽拭子、皮膚唾液+膠條、皮膚稀釋唾液+膠條）、144個(gè)來自口腔和皮膚的微生物樣本的16S rDNA基因進(jìn)行測(cè)序并分析，以探索個(gè)體唾液微生物的穩(wěn)定性和特異性，結(jié)果顯示，微生物群落較好地區(qū)分了唾液和皮膚，而不同個(gè)體的唾液微生物具有特異性，交叉驗(yàn)證的準(zhǔn)確率為94%。ZOU等[39-40]使用通用引物對(duì)陰道分泌液、唾液、糞便、鼻腔分泌液中的微生物進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)陰道分泌液中可能存在特異性細(xì)菌，而后又基于16S rDNA測(cè)序技術(shù)分析了73份來自漢族人群的唾液、陰道分泌液和糞便樣本，進(jìn)一步證實(shí)了陰道分泌液中存在特異性細(xì)菌，這種細(xì)菌有望成為陰道分泌液鑒別的特異性指標(biāo)。NAKANISHI等[41]使用PCR擴(kuò)增檢測(cè)口腔唾液中的唾液鏈球菌和變異鏈球菌，在20份唾液樣品中均檢測(cè)到唾液鏈球菌和變異鏈球菌，而在精液、尿液、陰道分泌液中或皮膚表面上未檢測(cè)到此兩種細(xì)菌，說明這兩種鏈球菌可成為唾液鑒定的新的微生物標(biāo)記。16S rDNA作為生物檢材鑒定的生物標(biāo)記仍有一定的缺陷，BRENIG等[42]認(rèn)為，相比全基因組測(cè)序，16S rDNA減少了可被發(fā)現(xiàn)的微生物范圍，而且對(duì)于微量檢材效果較差。

2.2 個(gè)體識(shí)別鑒定

個(gè)體識(shí)別是法醫(yī)物證學(xué)的兩大主要任務(wù)之一，對(duì)案件偵查和嫌疑人排除有著重大意義。目前，個(gè)體識(shí)別主要依賴STR和SNP等DNA指紋技術(shù)，有研究[12，43-44]表明，“定居”人體的微生物作為人體的“第二基因組”，其群落結(jié)構(gòu)特征在一定的時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定存在，而不同的個(gè)體由于生活環(huán)境、飲食習(xí)慣等差異，導(dǎo)致個(gè)體所擁有的微生物群落特征各不相同，雖然某些微生物標(biāo)記會(huì)隨著時(shí)間逐漸丟失，但在一定程度上仍可以將微生物作為個(gè)體識(shí)別的生物學(xué)標(biāo)記。STAHRINGER等[45]分析了264份唾液樣品，發(fā)現(xiàn)個(gè)體間唾液微生物群落特征存在差異，而LEAKE等[46]的研究表明，通過唾液微生物可作為個(gè)體識(shí)別的一種補(bǔ)充，特別是同卵雙生子的鑒別。SCHMEDES等[47]通過人工智能中監(jiān)督學(xué)習(xí)的方法，在兩年半內(nèi)選取三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別對(duì)12名健康個(gè)體皮膚位點(diǎn)的微生物進(jìn)行取樣，而后通過16S rDNA基因測(cè)序鑒定其皮膚微生物群落特征，結(jié)果表明，14個(gè)皮膚取樣位點(diǎn)中，3個(gè)位點(diǎn)的個(gè)體識(shí)別準(zhǔn)確率高達(dá)100%。此后，該研究團(tuán)隊(duì)又分析了來自8名健康個(gè)體中3個(gè)皮膚位點(diǎn)微生物群落的分支特異性標(biāo)記物，可判斷、分類身體部位，準(zhǔn)確率達(dá)94%。這種用于鑒定個(gè)體皮膚微生物群落的靶向分析新型方法，能準(zhǔn)確地辨識(shí)出個(gè)體的皮膚微生物，可為個(gè)體識(shí)別提供一種新的研究思路[48]。

2.3 土壤檢材鑒定

確定特定土壤檢材的來源是法醫(yī)實(shí)踐工作的重要組成部分，通過分析轉(zhuǎn)移到個(gè)體表面的土壤組成和特性，可輔助推斷犯罪現(xiàn)場(chǎng)、提供嫌疑人線索等[49-50]。土壤中微生物種類繁多且數(shù)量龐大，對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征的分析有助于區(qū)分不同來源的土壤[9]。SENSABAUGH[51]提出土壤微生物群落分析用于法醫(yī)學(xué)需要解決三個(gè)問題：（1）證明不同地方微生物群落的構(gòu)成方式各不相同；（2）分析方法要將分辨性、穩(wěn)定性和可靠性結(jié)合起來；（3）統(tǒng)計(jì)方法必須客觀評(píng)估樣本間的相似性和非相似性。XU等[52]采集了33份土壤樣本，比較分析草地、森林土壤、北極圈土壤、紅樹林沉積土壤中的微生物群落多樣性信息，揭示了在不同類型的土壤中微生物存的豐度和組成有一定的規(guī)律：在門水平，變形菌門在紅樹林沉積土壤中主要微生物（豐度＞2%的微生物）中占90%以上，而在沙漠土壤中只有30%；在科水平，外硫紅螺旋菌科在紅樹林沉積土壤主要微生物為35%，但在其他幾種草地中都不到5%。YOUNG等[32]針對(duì)土壤微生物不同類別進(jìn)行分類擴(kuò)增，分別擴(kuò)增了 16S rDNA（細(xì)菌）、18S rDNA（真核生物）、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（internally transcribed spacer sequence，ITS，真菌）以及植物葉綠體基因trnL的內(nèi)含子片段，比較四種擴(kuò)增子測(cè)序結(jié)果對(duì)不同地區(qū)土壤的分辨度，研究結(jié)果顯示，16S rDNA、18S rDNA、ITS對(duì)于不同地區(qū)來源土壤均有一定分辨度，其中非細(xì)菌群落中的真菌，對(duì)不同地區(qū)的土壤區(qū)分度最高。YOUNG等[53]進(jìn)一步評(píng)估了兩種土壤剖面技術(shù)：真核生物（包括特定細(xì)菌，真菌和植物）18S rRNA測(cè)序技術(shù)和中紅外（mid-infrared，MIR）光譜技術(shù)，對(duì)比六個(gè)法醫(yī)模擬現(xiàn)場(chǎng)和七個(gè)參考地點(diǎn)的土壤檢材，發(fā)現(xiàn)HTS技術(shù)補(bǔ)充了傳統(tǒng)的MIR光譜土壤剖面圖，能夠提供統(tǒng)計(jì)學(xué)上更好的區(qū)分能力，表明了微生物學(xué)16S rDNA在法醫(yī)學(xué)分析中的潛在應(yīng)用。

2.4 死亡時(shí)間推斷

死亡時(shí)間（postmortem interval，PMI）推斷是法醫(yī)病理學(xué)研究中的難題，傳統(tǒng)方法主要依靠尸體現(xiàn)象或尸體內(nèi)源性指標(biāo)，影響因素較多。死亡后，微生物參與了尸體的腐敗過程，早期研究[54-56]證實(shí)，真菌群落的組成分布與尸體腐敗有關(guān)，尸體周圍微生物群落隨時(shí)間不斷演替，其變化參數(shù)可作為法醫(yī)學(xué)死亡時(shí)間推斷的輔助工具。OLAKANYE等[57]比較了動(dòng)物尸體附近土壤和草地土壤，并設(shè)置陰性對(duì)照（只有土壤），通過16S rDNA基因測(cè)序鑒定細(xì)菌群落的構(gòu)成，分析計(jì)算群落的香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)，研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物尸體附近土壤的pH值在一定時(shí)間內(nèi)（180d）持續(xù)降低，而尸體細(xì)菌群落豐度和多樣性在30 d內(nèi)持續(xù)增高，并明顯高于草地土壤和對(duì)照組，180 d后趨于草地土壤的構(gòu)成，一定程度上證實(shí)了通過土壤微生物16S rDNA測(cè)序推斷死亡時(shí)間的可能性。KAKIZAKI等[23]對(duì)溺水尸體血液、器官中微生物和尸體附近水域水體微生物進(jìn)行16S rDNA位點(diǎn)基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)二者的微生物種類差異較小，這種新的分子生物學(xué)方法可為溺水死亡的確定提供證據(jù)支持。HYDE等[58]研究發(fā)現(xiàn)，尸體腫脹期前后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)微生物群落從需氧菌為主轉(zhuǎn)變?yōu)閰捬蹙鸀橹?，尸體腐敗過程中微生物群落結(jié)構(gòu)在不停地演替變化。PECHAL等[59]的研究也證實(shí)了以上結(jié)論，在尸體腐敗的各個(gè)階段都有各自主要的微生物群落，隨著時(shí)間演替，某些種屬的細(xì)菌豐度和積溫（某一時(shí)間內(nèi)溫度的總和）呈明顯的負(fù)線性關(guān)系，并建立了相關(guān)數(shù)學(xué)模型推斷死亡時(shí)間，結(jié)果表明，在科水平，彎曲桿菌科、腸球菌科和普雷沃氏菌科等17科細(xì)菌的豐度總和可以預(yù)測(cè)96%的死亡時(shí)間，但仍需要綜合更多的樣本量、地理因素和季節(jié)因素進(jìn)行分析。

2.5 毒品成癮機(jī)制

毒品成癮是一種長(zhǎng)期反復(fù)、持續(xù)地以強(qiáng)制性自我給藥為特征的慢性復(fù)發(fā)性腦疾病，患者往往表現(xiàn)出對(duì)毒品的高度渴求和依賴。受經(jīng)濟(jì)全球化和社會(huì)信息化的影響，毒品成癮已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。毒品成癮的機(jī)制十分復(fù)雜，法醫(yī)學(xué)者研究毒品的主要方向包括毒品的快速鑒定和成癮機(jī)制等。研究[60]表明，腸道微生物和大腦之間通過“腸-腦軸（gut-brain axis）”在免疫、內(nèi)分泌、營(yíng)養(yǎng)吸收等方面有著千絲萬縷的聯(lián)系。腸道微生物在神經(jīng)遞質(zhì)水平影響著個(gè)體大腦，與多種神經(jīng)疾病相關(guān)，包括帕金森病、阿爾茨海默病、精神疾病和藥物依賴等。VOLPE等[61]比較了可卡因使用者和非可卡因使用者人群的腸道菌群組成，發(fā)現(xiàn)可卡因使用者腸道微生物比非使用者的擬桿菌豐度更高，但厚壁菌的豐度更低。心理因素，尤其心理壓力，是多種藥物成癮發(fā)展的關(guān)鍵性風(fēng)險(xiǎn)因素，而腸道微生物群落的改變可能導(dǎo)致個(gè)體心理應(yīng)激反應(yīng)和行為改變。從治療的角度來看，腸道微生物群落的恢復(fù)可以促進(jìn)個(gè)體精神疾病的康復(fù)[62-64]。KIRALY等[65]通過小鼠實(shí)驗(yàn)，給實(shí)驗(yàn)組的小鼠飲用的水源含有腸道無法吸收的抗生素，使其腸道細(xì)菌大大減少，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠大腦核團(tuán)發(fā)生了改變，表現(xiàn)出對(duì)可卡因的敏感性顯著增強(qiáng)。NING等[13]使用條件性位置偏愛（conditioned place preference，CPP）模型研究甲基苯丙胺對(duì)大鼠行為的影響，通過收集糞便樣本，對(duì)16S rDNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行HTS，結(jié)果顯示，注射了甲基苯丙胺的大鼠腸道微生物群落的多樣性和相對(duì)豐度更大，但厚壁菌顯著減少，除此之外還發(fā)現(xiàn)丙酸桿菌屬和分枝桿菌屬被甲基苯丙胺抑制。近年來，腸道微生物群、大腦功能和個(gè)體行為之間的相互作用正逐步被證實(shí)[66]，而毒品成癮機(jī)制和人體微生物的關(guān)系需要進(jìn)一步探索。

3 展 望

目前，微生物基因組學(xué)已是法醫(yī)學(xué)研究中的前沿?zé)狳c(diǎn)，其“微生物指紋”在個(gè)體識(shí)別和體液鑒定中有著自己獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，而其演替過程可以輔助推斷土壤檢材來源和死亡時(shí)間，也為毒品成癮機(jī)制的研究提供新的思路。但16S rDNA基因測(cè)序在實(shí)際應(yīng)用中仍存在一些不足和限制，宏基因組學(xué)是以整體微生物群落為研究對(duì)象，包括細(xì)菌、真菌、古細(xì)菌等，而16S rDNA基因測(cè)序僅分析了細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)。此外，由于微生物容易受環(huán)境因素及研究過程中各種干擾因素的影響，研究方法的穩(wěn)定性還有待提高，相關(guān)的生物信息學(xué)分析和統(tǒng)計(jì)方法尚不完善，其特異性和可靠性需進(jìn)一步考證。不過，我們相信隨著測(cè)序技術(shù)與生物信息技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展與完善，系統(tǒng)的研究方法和有效的質(zhì)量控制進(jìn)一步成熟，微生物鑒定將有望成為法醫(yī)學(xué)發(fā)展的一個(gè)新動(dòng)力。