玻璃體液推斷死亡時間的研究進(jìn)展

楊明真 ，張?zhí)烊~ ，李輝軍 ，楊天潼 ，丁自嬌 ，劉 茜

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，湖北 武漢 430030；2.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063；3.上海市公安局物證鑒定中心 法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場應(yīng)用技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市現(xiàn)場物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200083；4.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430030；5.中國政法大學(xué)教育部證據(jù)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088）

死亡時間（postmortem interval，PMI）推斷是法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最具困難和挑戰(zhàn)性的問題之一[1]。早期PMI推斷最常用的指標(biāo)依然是直腸溫度[2]。既往的晚期PMI推斷研究[3-6]主要集中在血液、血清及腦脊液中，目前的研究方向主要集中在玻璃體液，但由于死后的物質(zhì)變化受外界環(huán)境和尸體自身等多種因素影響，至今未有確切的PMI推斷方法。

玻璃體液用于PMI推斷研究已有50余年歷史，大量學(xué)者[7-10]應(yīng)用新的檢測方法檢測玻璃體液中各種物質(zhì)濃度，建立了物質(zhì)濃度與PMI之間的推導(dǎo)方程，使玻璃體液推斷PMI的研究不斷深入。隨著生化檢測技術(shù)的發(fā)展，各種物質(zhì)檢測方法不斷更新，技術(shù)逐漸多樣化，物質(zhì)濃度檢測的靈敏度不斷提高，單次檢測所需樣本量逐漸減少，使得玻璃體液微量取樣成為可能。本文就玻璃體液推斷PMI的優(yōu)勢、死后變化的影響因素、取樣方法、數(shù)據(jù)擬合模型進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為利用玻璃體液進(jìn)行PMI推斷提供新的思路。

1 玻璃體液較其他常見體液的優(yōu)勢

玻璃體液位于眼球后部的玻璃體內(nèi)，由于玻璃體特殊的解剖位置，與其他組織相對隔離，又受周圍眼眶的保護(hù)，因此不易受到破壞，使得玻璃體液在死亡早期以及后期均受污染較少，且所含物質(zhì)的濃度變化較血液、腦脊液、心包積液、滑膜液等其他體液的變化相對緩慢且規(guī)律性更強(qiáng)。自20世紀(jì)60年代STURNER等[11]首次證實(shí)玻璃體液內(nèi)鉀離子濃度與PMI呈正相關(guān)性以來，玻璃體液一直是法醫(yī)病理學(xué)用于PMI推斷研究和死后化學(xué)物質(zhì)分析的熱點(diǎn)。此外，玻璃體液還是動物醫(yī)學(xué)中的研究熱點(diǎn)[12]。

心包積液是心外膜的滲出物，含有大量血液和心臟組織中的化學(xué)物質(zhì)[13]，在排除心臟損傷和醫(yī)療干預(yù)的情況下，心包積液是尸體死亡化學(xué)很好的檢材之一[14]。KAWAMOTO等[15]認(rèn)為，心包積液內(nèi)的鉀、鎂、鈣等離子濃度隨PMI延長而變化的趨勢與玻璃體液相似，但是由于檢測樣本量大，物質(zhì)濃度變化與死亡原因相關(guān)性強(qiáng)，因此不適用于PMI的推斷。PALMIERE等[16]研究發(fā)現(xiàn)，心包積液內(nèi)肌酐、尿素氮和尿酸與PMI無相關(guān)性，此外，取樣困難，心包積液中容易混入血液成分，因此也限制了其應(yīng)用價值。

QUERIDO[17]用火焰光度法檢測大鼠死后血清內(nèi)鈉、鉀離子濃度及兩者比值的變化，證實(shí)了大鼠血清內(nèi)鈉、鉀離子濃度與PMI高度相關(guān)，可用于PMI的推斷。隨后其證實(shí)了大鼠死后血清中氯離子的濃度變化也與PMI相關(guān)[3]。DONALDSON等[4]將大鼠、豬和人的血液作為研究對象，檢測血液pH值變化及血液內(nèi)血氨等六種物質(zhì)的死后變化情況，其pH值和血氨等六種物質(zhì)濃度隨PMI延長而改變，但其變化速率呈多樣性。SUN等[18]應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測家兔右心室內(nèi)血液腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的降解，得到家兔血液ATP的降解與PMI具有較好的相關(guān)性。但近期研究[19]證實(shí)，死后血液內(nèi)的一些生化指標(biāo)穩(wěn)定性很高，而另一些生化物質(zhì)卻變化巨大，且有的物質(zhì)變化無規(guī)律性。這些研究結(jié)果表明，死后血液內(nèi)的生化物質(zhì)變化不夠穩(wěn)定，難以用于PMI推斷。

很多學(xué)者都曾以腦脊液為研究對象進(jìn)行PMI的推斷，但研究結(jié)果存在很大差異。MASON等[5]研究發(fā)現(xiàn)，58例尸體腦脊液內(nèi)鉀離子濃度增加與PMI呈正相關(guān)。FRASCHINI等[6，20]在后續(xù)的研究中也得到了類似的結(jié)論。但SWAIN等[21]在比較玻璃體液和腦脊液內(nèi)鉀、鈉離子及葡萄糖濃度推斷PMI時發(fā)現(xiàn)：鉀離子濃度在腦脊液和玻璃體液內(nèi)均升高，玻璃體液內(nèi)鉀離子濃度推斷PMI的方程R2為0.62，而腦脊液內(nèi)鉀離子濃度推斷PMI的方程R2僅為0.37；葡萄糖濃度在腦脊液和玻璃體液內(nèi)隨PMI的延長均下降，根據(jù)腦脊液內(nèi)葡萄糖濃度變化推斷PMI的方程R2為-0.35，而玻璃體液內(nèi)葡萄糖濃度變化推斷PMI的方程R2為-0.63。因此他們認(rèn)為，玻璃體液較腦脊液推斷PMI更準(zhǔn)確，更接近實(shí)際PMI，此外，在以腦脊液為實(shí)驗(yàn)樣本時，同樣很難提取到不含血液的腦脊液，且對取樣技術(shù)的要求很高。

關(guān)節(jié)滑膜液是研究風(fēng)濕性疾病的重要成分，僅有少數(shù)學(xué)者報(bào)道乙醇和藥物在滑膜液內(nèi)的代謝[22]，然而其用于死后生化分析研究較少見。MORE等[23]在1985年應(yīng)用滑膜液內(nèi)鈣、磷離子和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的濃度變化等探索尸體死亡原因時并未發(fā)現(xiàn)任何規(guī)律性的變化。MADEA等[24]于2001年首次研究膝關(guān)節(jié)滑膜液內(nèi)鉀、鈉、氯離子及葡萄糖等物質(zhì)濃度的死后變化，發(fā)現(xiàn)滑膜液內(nèi)只有鉀離子和葡萄糖的濃度變化可用于PMI推斷，其他物質(zhì)濃度的變化均與PMI無相關(guān)性，且滑膜液與玻璃體液內(nèi)鉀離子濃度變化相當(dāng)，都與PMI的延長具有高度相關(guān)性，因此在因顱腦外傷等無法提取玻璃體液時，可以應(yīng)用滑膜液作為替代品進(jìn)行鉀離子濃度檢測推斷PMI。但是由于滑膜液黏度更大，其分析前處理更復(fù)雜，取樣較玻璃體液困難[24]，因此在目前的PMI推斷中仍以玻璃體液為研究重點(diǎn)。

2 溫度對玻璃體液內(nèi)物質(zhì)的影響

在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，PMI推斷受諸多因素的影響，其中以環(huán)境溫度的影響最大[25]。KOMURA等[26]首次表明低溫會延緩人和家兔眼玻璃體液內(nèi)鉀離子濃度的上升。同時SCHONING等[27]以60只成年的雜交狗為研究對象，證實(shí)在4℃下，死后48 h內(nèi)玻璃體液的肌酐和尿素氮濃度呈緩慢上升趨勢，處于穩(wěn)定狀態(tài)，但在較高的環(huán)境溫度下，玻璃體液內(nèi)的肌酐和尿素氮濃度變化不穩(wěn)定，無法用于PMI推斷。BRAY[28]在研究綿羊和馬的玻璃體液時也得到了類似的結(jié)果。MCLAUGHLIN等[12]在4℃、20℃、37℃三個溫度條件下研究120頭牛和120頭豬血清和玻璃體液內(nèi)尿素氮、肌酐以及鈉、鉀、鈣、鎂、氯、磷離子的濃度變化，發(fā)現(xiàn)血清和玻璃體液內(nèi)各指標(biāo)濃度幾乎保持穩(wěn)定，但在低溫下及死亡早期更穩(wěn)定，鉀和磷離子的濃度隨PMI延長和溫度的增加而升高。SCHONING[29]研究發(fā)現(xiàn)，狗玻璃體液內(nèi)鉀離子濃度隨溫度的增加及PMI的延長而增加，鈉、氯離子以及尿素氮的濃度在4℃環(huán)境下死后48 h內(nèi)保持穩(wěn)定，而在20℃、37℃環(huán)境下難以穩(wěn)定。VISHAL[30]研究200例尸體后發(fā)現(xiàn)，燒死尸體玻璃體液內(nèi)鉀離子濃度顯著高于非燒死尸體。ZILG等[2]研究發(fā)現(xiàn)，死者年齡、體質(zhì)量及死亡原因等對鉀離子濃度無影響，而溫度對鉀離子濃度有一定影響。ROGNUM等[31]在研究人眼玻璃體液內(nèi)鉀離子和次黃嘌呤濃度與溫度的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的增加，擬合方程的斜率增加。因此，在進(jìn)行PMI推斷時，應(yīng)將溫度作為重要變量擬合入方程，以提高推斷的準(zhǔn)確性。

3 玻璃體液的取樣方法

COE[32]認(rèn)為死后玻璃體液內(nèi)離子濃度梯度會發(fā)生重建，有學(xué)者[33-35]認(rèn)為雙眼玻璃體液內(nèi)的電解質(zhì)有重大的區(qū)別，因此應(yīng)一次取出全部玻璃體液避免濃度梯度對樣本物質(zhì)的影響。也有學(xué)者[36]認(rèn)為，雙眼內(nèi)玻璃體液的死后變化不一致，應(yīng)以雙眼均值作為檢測樣本。此外，活體眼科生物化學(xué)研究者[37]也認(rèn)為玻璃體液內(nèi)各部分物質(zhì)含量不等。因此，在早期的研究[38]中，一眼內(nèi)的玻璃體液只能一次全部取出。但是，MULLA等學(xué)者[39-41]在檢測人雙眼玻璃體液電解質(zhì)濃度后發(fā)現(xiàn)，人雙眼玻璃體液內(nèi)離子濃度無明顯差異。SIDDAMSETTY等[19]在研究半干旱氣候條件下人眼玻璃體液內(nèi)電解質(zhì)與PMI的關(guān)系時，也證實(shí)了雙眼玻璃體液內(nèi)電解質(zhì)濃度無差異。WANG等[42]在前人研究的基礎(chǔ)上嘗試應(yīng)用微量取樣法取樣，研究證實(shí)了雙眼玻璃體液鈣、鉀、鈉、氯和磷離子含量無差異，雙眼組分變化一致，肯定了微量取樣的可行性，此方法充分利用了實(shí)驗(yàn)動物和檢材，大大減少了實(shí)驗(yàn)動物用量，在獲得同等數(shù)據(jù)量的前提下節(jié)省實(shí)驗(yàn)動物數(shù)達(dá)90%，此外也減少了取樣檢測值變異系數(shù)，增加了穩(wěn)定性，同時減少了不同因素（性別、年齡、死因等）的影響，使得實(shí)驗(yàn)樣本的連續(xù)性大大提高。劉茜等[43]應(yīng)用WANG等建立的微量取樣法對家兔雙眼進(jìn)行交替取樣，證實(shí)了該方法的可行性，同時也證實(shí)了雙眼玻璃體液物質(zhì)濃度無差異。

4 玻璃體液的檢測及分析技術(shù)

4.1 毛細(xì)管電泳法

TAGLIARO等[7]認(rèn)為，毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）法是檢測玻璃體液內(nèi)鉀離子濃度可靠、簡單、快捷的方法，且可增加檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。經(jīng)毛細(xì)管電泳法檢測鉀離子的結(jié)果與火焰光度法的結(jié)果呈強(qiáng)相關(guān)性。此兩種方法均沒有對樣本進(jìn)行特殊的預(yù)處理，并且只需極少量的玻璃體液樣本量。毛細(xì)管電泳法可用于復(fù)雜樣本（如死后樣本）的檢測，與傳統(tǒng)的檢測方法（如火焰光度法、離子選擇法等）相比，毛細(xì)管電泳法不僅能用于檢測玻璃體液內(nèi)鉀離子濃度，還可以檢測血氨以及鈉、鋇離子等的濃度。BOCAZ-BENEVENTI等[8]也證實(shí)毛細(xì)管電泳法可用于快速檢測細(xì)胞外液中的無機(jī)離子成分。

4.2 低壓離子色譜法

周斌等[9]采用其自主研發(fā)的低壓離子色譜儀對玻璃體液中鉀離子濃度進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，玻璃體液內(nèi)鉀離子色譜峰與濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)大于0.99，色譜法精密度良好，符合色譜分析要求，經(jīng)低壓離子色譜儀分析得到的玻璃體液內(nèi)鉀離子濃度精確、可靠。但該方法目前仍未得到廣泛的應(yīng)用。

4.3 順序噴射分析法

順序噴射分析（sequential injection analysis，SIA）法是基于獲得大量樣本的自動化快速分析，并在后期可以快速、準(zhǔn)確查看檢測結(jié)果的原理基礎(chǔ)上而設(shè)立的自動化技術(shù)[44]。這種自動化技術(shù)極具吸引力，因?yàn)槠涑杀镜汀⒖焖?、可靠且通用，與常規(guī)方法相比，其樣品預(yù)處理簡單，僅需要過濾和稀釋。其計(jì)算機(jī)控制的性質(zhì)保證了操作的靈活性并能建立不同的分析策略而且沒有重復(fù)。此外，該系統(tǒng)的核心具有多位選擇性，允許所有類型的設(shè)備或解決方案的聚類，這使得系統(tǒng)內(nèi)各項(xiàng)操作成為可能。重要的是，SIA法允許執(zhí)行系統(tǒng)內(nèi)所有操作，不會出現(xiàn)與操作者相關(guān)的錯誤，并具有更快的測定速度，如在測定黃嘌呤時通常每小時可比高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法多約3次。此外，由于SIA法具有不連續(xù)的性質(zhì)，因而提供了獨(dú)立開發(fā)不同測定的可能性，因此適合于多重測定。PASSOS等[44]嘗試將開發(fā)的SIA系統(tǒng)首次應(yīng)用于檢測玻璃體液內(nèi)鉀離子和次黃嘌呤含量，為了評估SIA系統(tǒng)獲得結(jié)果的準(zhǔn)確性，所有檢測樣本也用火焰光度法進(jìn)行了鉀離子檢測，該研究證實(shí)，SIA系統(tǒng)提供了可靠的結(jié)果，在今后的法醫(yī)學(xué)研究中可以作為一個較好的替代檢測法。

5 數(shù)據(jù)擬合分析方法

5.1 回歸模型

自1963年STURNER[45]首次明確提出玻璃體液內(nèi)鉀離子濃度變化與PMI呈線性正相關(guān)以來，眾多法醫(yī)學(xué)者[46-47]建立了截距、斜率不同的鉀離子濃度推斷PMI的線性方程，直至1994年LANGE等[48]得出玻璃體液內(nèi)鉀離子濃度和PMI并非完全線性關(guān)系，并應(yīng)用新的數(shù)據(jù)分析模型，提出了玻璃體液內(nèi)鉀離子濃度和PMI的一元回歸方程、置信區(qū)間等，但由于單個離子的離散程度較大，其擬合回歸方程的可靠性仍有不確定性。HENSSGE等[49]在LANGE等研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用多元線性回歸模型擬合玻璃體液內(nèi)鉀和鈉離子濃度、鉀離子濃度和尿素氮、鉀離子濃度和葡萄糖等的線性方程，指出多元線性回歸方程可增加PMI推斷的精度。劉茜等[43]在應(yīng)用玻璃體液內(nèi)鉀和鎂離子濃度進(jìn)行多元回歸推斷PMI時指出，在實(shí)際應(yīng)用中，不僅要考慮評價方程的R2，還需要結(jié)合其在推斷PMI時產(chǎn)生的預(yù)測偏離時間，應(yīng)用多指標(biāo)建立多元回歸方程進(jìn)行PMI推斷是提高PMI推斷準(zhǔn)確性的可行性方法，尤其是晚期的PMI推斷。

5.2 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（artificial neural network，ANN）模型是一種計(jì)算機(jī)化的化學(xué)計(jì)算分析方法，簡稱為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)或連接模型，是對人腦或自然神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)若干基本特性的抽象和模擬，其目的在于模擬大腦的某些機(jī)理與機(jī)制，實(shí)現(xiàn)某個方面的功能。ANN模型由大量被稱為節(jié)點(diǎn)的簡單信息處理單元（神經(jīng)元）組成，每個節(jié)點(diǎn)向鄰近的其他節(jié)點(diǎn)發(fā)出抑制或激勵信號，整個網(wǎng)絡(luò)的信息處理通過這些節(jié)點(diǎn)之間的相互作用而完成[50]。BOCAZ-BENEVENTI等[8]在研究 61 例 PMI在 3～144h的人眼玻璃體液內(nèi)鉀、氨、鈉和鋇離子濃度時，嘗試應(yīng)用ANN模型對經(jīng)毛細(xì)管電泳法檢測得到的人玻璃體液離子濃度進(jìn)行擬合。在評價ANN模型時，應(yīng)用檢測濃度值和PMI進(jìn)行建模，并與傳統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行了對比。為了確保隱藏層中的最優(yōu)節(jié)點(diǎn)數(shù)，ANN模型系統(tǒng)內(nèi)設(shè)定了誤差值作為隱藏層中的神經(jīng)元數(shù)量的函數(shù)。經(jīng)探索得出，4個或者5個節(jié)點(diǎn)就足以獲得低誤差值，且進(jìn)一步增加節(jié)點(diǎn)數(shù)量并不會再次降低誤差值，最終應(yīng)用ANN模型建立了擬合PMI和玻璃體液內(nèi)離子濃度的最優(yōu)化模式。該研究最終得出，應(yīng)用ANN模型可以使檢測數(shù)據(jù)得到充分的利用，建立了四種離子濃度推斷PMI的擬合方程，使PMI的推斷得到了質(zhì)的改變，經(jīng)模型擬合后，獲得了良好的相關(guān)關(guān)系（R2=0.98），并且使推斷誤差由15h減少到3h。

5.3 插值函數(shù)模型

插值函數(shù)（interpolation function）是數(shù)學(xué)領(lǐng)域的一種數(shù)值分析方法，即在離散數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上補(bǔ)插連續(xù)函數(shù)，使各條連續(xù)曲線通過全部給定的離散數(shù)據(jù)點(diǎn)。插值分析已經(jīng)應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)，SUN等[18]建立了應(yīng)用插值函數(shù)擬合不同溫度條件下家兔右心室血液ATP水平與PMI的相關(guān)性曲線，驗(yàn)證了插值函數(shù)應(yīng)用于PMI推斷的可行性，并證實(shí)了插值函數(shù)擬合較SPSS分析更接近實(shí)際情況。姜竹青等[51]應(yīng)用插值函數(shù)在外界環(huán)境溫度變化條件下，對小鼠肝細(xì)胞18S rRNA降解與PMI的關(guān)系進(jìn)行擬合時，也得到了較好的結(jié)果。楊明真等[52]應(yīng)用該模型，得出了在5～35℃的環(huán)境溫度區(qū)間內(nèi)，家兔眼玻璃體液中鉀離子濃度變化與PMI符合三元五次方程分布，證實(shí)了利用插值函數(shù)擬合的方法可將環(huán)境溫度作為參數(shù)，實(shí)現(xiàn)在環(huán)境溫度變化條件下推斷PMI。

5.4 混合效應(yīng)模型

混合效應(yīng)模型（mixed-effect model）即所擬合的模型中既包含固定效應(yīng)又包含隨機(jī)效應(yīng)，特別是個體數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的選擇將對各因素的評價產(chǎn)生直接影響，固定效應(yīng)類似于標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)，直接估計(jì)得到，而隨機(jī)效應(yīng)則是從其方差和協(xié)方差估計(jì)值中總結(jié)而來。此模型可用于重復(fù)測量數(shù)據(jù)，即對同一個觀察對象在不同時間點(diǎn)上進(jìn)行的多次測量，由于測量資料是對同一受試對象某一觀察指標(biāo)進(jìn)行的重復(fù)觀察所得的數(shù)據(jù)，同一受試者的觀察數(shù)據(jù)間可能存在相關(guān)性，一些傳統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法可能無法充分揭示這一內(nèi)在特點(diǎn)?；旌闲?yīng)模型既考慮了觀察對象在不同時間點(diǎn)的內(nèi)在聯(lián)系，又考慮了觀察值間的內(nèi)部相關(guān)性，結(jié)論更為可靠。在應(yīng)用動物實(shí)驗(yàn)推斷PMI時，得到的檢測數(shù)據(jù)即是重復(fù)測量資料，楊明真等[53]在檢測不同溫度下家兔尸體玻璃體液內(nèi)鉀、鎂離子濃度隨PMI變化的規(guī)律時，首次應(yīng)用該模型對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得出在5～35℃環(huán)境溫度區(qū)間內(nèi)，該模型可以實(shí)現(xiàn)利用環(huán)境溫度和玻璃體液內(nèi)離子濃度雙參數(shù)推斷PMI，并驗(yàn)證了該模型可用于PMI的推斷，且在死后40h內(nèi)推斷偏離時間在10h內(nèi)，具有良好的吻合性。在后期的研究中，可嘗試應(yīng)用混合效應(yīng)模型對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，擴(kuò)大數(shù)據(jù)擬合模型的范圍，提高PMI推斷的準(zhǔn)確性。

6 展 望

在利用尸體化學(xué)進(jìn)行PMI推斷時，玻璃體液是較穩(wěn)定、可靠的樣本。后期研究中可考慮聯(lián)合應(yīng)用玻璃體液和其他體液進(jìn)行PMI推斷研究。應(yīng)用玻璃體液推斷PMI時，使用微量取樣法可減少實(shí)驗(yàn)動物用量，也能充分利用人體檢材。此外，應(yīng)在PMI推斷方程中考慮更多的影響因素，加強(qiáng)與實(shí)際情況的吻合度，嘗試不同的數(shù)據(jù)擬合方法，提高PMI推斷的準(zhǔn)確性。

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