聯(lián)苯胺試驗對血痕DNA檢驗的影響

金 明，巴華杰，朱愛華，馬 駿，石津瑋，劉亞楠 ，林子清

（1.常州市公安局物證鑒定所，江蘇 常州 213003；2.上海市公安局物證鑒定中心 法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場應(yīng)用技術(shù)公安部重點實驗室 上海市現(xiàn)場物證重點實驗室，上海 200083；3.中國刑警學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，遼寧 沈陽 110035）

聯(lián)苯胺試驗為案發(fā)現(xiàn)場可疑血痕常用的預(yù)檢驗方法之一[1-2]，因其靈敏度高、檢驗方法簡便、結(jié)果判斷明確等優(yōu)點，已成為現(xiàn)場可疑血痕篩選的首選方法[3]。已有研究[4]顯示，聯(lián)苯胺試驗對血痕中的DNA有顯著的破壞作用，聯(lián)苯胺試驗后的血痕不能再進(jìn)行STR分型檢驗。因此在實際操作中多用濾紙轉(zhuǎn)移部分可疑血痕進(jìn)行聯(lián)苯胺試驗，以避免聯(lián)苯胺試驗對血痕DNA的破壞。然而，實踐中常會遇到需要對聯(lián)苯胺試驗顯現(xiàn)后的潛隱血指掌紋中的血痕繼續(xù)進(jìn)行STR分型檢驗，此時就無法避免聯(lián)苯胺試驗及相關(guān)試劑對血痕中DNA的破壞，從而影響后續(xù)的STR分型檢驗。隨著近年來DNA提取方法的不斷改進(jìn)，DNA提取的效率和質(zhì)量不斷提升。同時，STR分型復(fù)合擴(kuò)增試劑盒的靈敏度和抗抑制能力也得到了不斷的改善?？梢姡斜匾獙β?lián)苯胺試驗后的血痕能否進(jìn)行常規(guī)STR分型檢驗進(jìn)行重新評估，這對于實際案件中聯(lián)苯胺試驗后血痕（特別是聯(lián)苯胺試驗顯現(xiàn)指掌紋后的血痕）的STR分型檢驗具有重要的指導(dǎo)意義。本研究擬探討聯(lián)苯胺試驗對DNA提取產(chǎn)生的影響，以發(fā)現(xiàn)對DNA提取影響較小的血痕預(yù)檢驗方法和潛隱血指掌紋顯現(xiàn)方法，為實際案件中聯(lián)苯胺試驗后的血痕DNA檢驗提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本

一名女性志愿者提供的外周靜脈血2mL，EDTA抗凝，于采集血樣后1h內(nèi)，分別吸取1μL滴于血樣采集卡（天津諾維萊博科技有限公司）上，室溫自然干燥12h，制成濾紙血痕970份，其中對照組10份，實驗組960份。

1.2 聯(lián)苯胺試驗

采用血痕預(yù)檢驗試劑盒（北京布蘭特警用裝備有限公司）對血痕進(jìn)行聯(lián)苯胺試驗。順序加入試劑盒內(nèi)的A（冰醋酸）、B（四甲基聯(lián)苯胺乙醇飽和溶液）、C（3%過氧化氫溶液）3種液體各10μL。

1.3 DNA提取

對照組10份濾紙血痕不進(jìn)行聯(lián)苯胺試驗，直接采用Chelex-100 DNA提取純化試劑盒（天津諾維萊博科技有限公司）提取DNA。

將實驗組960份濾紙血痕分成16組，每組60份。1～8組采用Chelex-100 DNA提取純化試劑盒提取DNA，即Chelex-100法；9～16組采用硅珠提取純化DNA試劑盒（天津諾維萊博科技有限公司）提取DNA，即硅珠法。兩種方法的8組樣本分為4個亞組，提取前的處理分別為聯(lián)苯胺試驗（順序加A、B、C液）、只加A液、只加B液、只加C液。加完液體后又分為立即提取DNA和室溫通風(fēng)干燥1 h后再進(jìn)行DNA提取。

兩種商品化試劑盒的操作方法參照說明書進(jìn)行，Chelex-100法加入 Chelex-100懸液量為 100 μL，硅珠法洗脫液用量為20μL。

1.4 復(fù)合擴(kuò)增及分型檢驗

取模板 DNA 1μL，采用 AmpF?STRTMIdentifilerTMPlus PCR擴(kuò)增試劑盒（美國AB公司，含有15個STR基因座）進(jìn)行擴(kuò)增，體系為10 μL，在9700型PCR儀（美國AB公司）上進(jìn)行擴(kuò)增，熱循環(huán)參數(shù)按照試劑盒說明書進(jìn)行，循環(huán)數(shù)為28次。以9947A和去離子水為陽性和陰性對照。擴(kuò)增產(chǎn)物用3500xl基因分析儀（美國AB公司）進(jìn)行檢測，采用GeneMapperTMID-X v1.3軟件分析數(shù)據(jù)。STR基因座檢出的標(biāo)準(zhǔn)為：基因座能正確分型，譜峰清晰，判型準(zhǔn)確，峰值大于150RFU，雜合子兩個峰高比例大于70%，無丟峰，無或少雜峰等干擾判型的因素[5]。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。各組STR基因座檢出數(shù)的比較采用獨立樣本t檢驗，檢驗水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 STR基因座檢出數(shù)的比較

各組樣本的STR基因座檢出情況見表1。

對照組采用Chelex-100法提取DNA，獲得完整15個STR基因座分型結(jié)果。

聯(lián)苯胺試驗和只加A液后立即采用Chelex-100法提取DNA，均未獲得STR分型結(jié)果，STR基因座檢出數(shù)低于其余14組（P〈0.05）；聯(lián)苯胺試驗干燥后行Chelex-100 法提取 DNA，獲得（4.70±1.96）個 STR 基因座，STR基因座檢出數(shù)高于聯(lián)苯胺試驗后立即行硅珠法提取 DNA［（3.80±1.34）個 STR 基因座，P〈0.05］，但低于聯(lián)苯胺試驗干燥后行硅珠法提取DNA［（12.90±1.49）個STR基因座，P〈0.05］和加A液后立即行硅珠法提取DNA［（9.40±2.09）個 STR 基因座，P〈0.05］；聯(lián)苯胺試驗干燥后行硅珠法提取DNA有13例（21.7%）獲得完整15個STR基因座分型結(jié)果，且其STR基因座檢出數(shù)均高于其余獲得部分STR基因座的實驗組（2、9、11 組，P〈0.05），但均低于獲得完整 15 個 STR 基因座分型結(jié)果的實驗組（4～8、12～16 組，P〈0.05）。

2.2 案例應(yīng)用

某年2月26日21：23，在某村一出租屋內(nèi)發(fā)生一起兩人被殺死一人被捅傷的惡性案件。嫌疑人在作案后從臥室窗戶逃走時，在窗沿上留下了一枚潛血指紋。經(jīng)聯(lián)苯胺試驗顯現(xiàn)，提取到了一枚具有比對條件的殘缺指紋，并在指紋庫中比中了龔某，成功鎖定了嫌疑人。為了增加案件證據(jù)的強(qiáng)度，對血指紋上的血跡進(jìn)行了提取，采用硅珠法提取潛隱血的DNA，成功獲得了單一女性的DNA分型結(jié)果，并與女死者的DNA分型結(jié)果一致，為案件的起訴提供了強(qiáng)有力的證據(jù)支撐。

表1 各組樣本的STR基因座檢出情況 （n=60）

3 討 論

聯(lián)苯胺試驗除用于血痕預(yù)檢驗外，還常用于現(xiàn)場潛隱血指掌紋的顯現(xiàn)。但聯(lián)苯胺試驗對血痕DNA具有較大的破壞作用[4]，在進(jìn)行潛隱血指掌紋檢驗時，較難決定采用聯(lián)苯胺試驗顯現(xiàn)潛隱血指掌紋和直接提取潛隱血指掌紋上血痕的先后順序。如果先行聯(lián)苯胺試驗顯現(xiàn)指掌紋有可能會影響血痕的后續(xù)STR分型檢驗，如果先行指掌紋上血痕的提取，必然會損壞指掌紋的顯現(xiàn)。因此，進(jìn)一步評估聯(lián)苯胺試驗及相關(guān)試劑對現(xiàn)有DNA提取方法和STR分型檢驗的影響程度具有重要的意義。

本研究比較了聯(lián)苯胺試驗及相關(guān)試劑對不同DNA提取方法的提取效率及STR分型檢驗的影響。研究結(jié)果顯示：聯(lián)苯胺試驗后立即進(jìn)行檢驗，硅珠法的STR基因座檢出數(shù)高于Chelex-100法，但均未獲得有效的DNA分型結(jié)果。進(jìn)行干燥處理后再行檢驗，兩種方法的STR基因座檢出數(shù)均有大幅度提升，特別是硅珠法有21.7%的樣本獲得了完整15個STR基因座分型結(jié)果，其余的最少也獲得了10個STR基因座分型結(jié)果，已經(jīng)能夠滿足現(xiàn)有DNA數(shù)據(jù)庫比對及個體識別的需要。這表明聯(lián)苯胺試驗中的試劑不僅會損傷血痕中的DNA片段，其中的易揮發(fā)試劑還會對DNA提取效率產(chǎn)生較大的影響。進(jìn)一步比較聯(lián)苯胺試驗中3種試劑單獨對STR分型檢驗的影響，結(jié)果顯示：單獨加入A液后立即檢驗會對后續(xù)的STR分型檢驗產(chǎn)生顯著影響，但加入A液后干燥處理及單獨加入B、C液對后續(xù)的DNA檢驗均無顯著影響。表明A液對DNA提取效率會產(chǎn)生主要的影響，其原因可能為：A液（冰醋酸）呈弱酸性，順序加入A、B、C液或A液后會使DNA提取體系呈酸性，在酸性環(huán)境中，Chelex-100樹脂鰲合金屬離子的能力降低或喪失，不能有效防止核酸酶對DNA的降解作用，酸性環(huán)境也會大幅減弱硅珠對DNA片段的吸附能力，從而降低DNA的提取效率。單獨加入A液后室溫通風(fēng)干燥1h再進(jìn)行檢驗，兩種方法均能獲得完整15個STR基因座分型結(jié)果，表明冰醋酸已揮發(fā)完全，不再對DNA提取體系產(chǎn)生影響，DNA的提取效率也得到了恢復(fù)。

本研究結(jié)果還表明：單獨加入B、C液不會對血痕DNA片段產(chǎn)生顯著損傷，也不會對DNA提取及后續(xù)STR分型檢驗產(chǎn)生顯著的影響，但順序加入A、B、C液干燥處理后進(jìn)行檢驗，硅珠法的STR基因座檢出數(shù)遠(yuǎn)低于對照組，Chelex-100法的檢驗結(jié)果更是無法應(yīng)用于實際。可見，聯(lián)苯胺試驗3種試劑與血痕反應(yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)可能對血痕中DNA產(chǎn)生了較大程度的損傷或?qū)NA提取效率產(chǎn)生了影響，在冰醋酸揮發(fā)完全后，依舊對后續(xù)DNA檢驗造成較大的影響。聯(lián)苯胺試驗的原理為血紅蛋白或血紅素的過氧化酶活性使過氧化氫釋放出新生態(tài)的氧，使無色的四甲基聯(lián)苯胺氧化成四甲基聯(lián)苯胺藍(lán)。因此，推測是生成的四甲基聯(lián)苯胺藍(lán)對血痕中的DNA造成了損傷或者影響了DNA的提取效率，該原理有待進(jìn)一步研究加以驗證。

朱傳紅等[4]曾對血痕聯(lián)苯胺試驗后DNA含量的變化及對STR分型檢驗的影響進(jìn)行研究，結(jié)果顯示聯(lián)苯胺試驗對后續(xù)STR分型影響較大，認(rèn)為血痕聯(lián)苯胺試驗后不能再進(jìn)行STR分型檢驗，本研究結(jié)論與其并不一致。原因可能為：（1）其研究中未采用硅珠法提取DNA，不同的DNA提取方法導(dǎo)致DNA提取效率存在差異；（2）兩研究中聯(lián)苯胺試驗后放置的時間不同（本研究進(jìn)行聯(lián)苯胺試驗后室溫通風(fēng)放置1h再進(jìn)行DNA提取，其研究采用室溫放置30min～24h在不同時間段進(jìn)行DNA提?。赡軐?dǎo)致后續(xù)的DNA提取及統(tǒng)計數(shù)據(jù)存在差異；（3）其研究中樣本例數(shù)偏少（每組僅6例），且未考慮聯(lián)苯胺試驗中每種試劑對DNA提取效率的影響。但朱傳紅等[4]的研究也發(fā)現(xiàn)，不同的DNA提取方法對聯(lián)苯胺試驗處理的血痕進(jìn)行DNA提取后的DNA含量有著顯著的影響，本研究結(jié)論與其一致。因此，筆者認(rèn)為血痕聯(lián)苯胺試驗后進(jìn)行干燥處理，并采用硅珠法提取DNA，完全可以滿足實際案件的需要。

綜上所述，聯(lián)苯胺試驗對血痕的后續(xù)DNA檢驗有較大的影響，Chelex-100法不適合聯(lián)苯胺試驗后血痕的DNA檢驗，聯(lián)苯胺試驗后干燥處理及采用硅珠純化的方法可有效提升聯(lián)苯胺試驗后血痕的STR基因座檢出數(shù)，以達(dá)到實際案件的需要。本研究僅比對了聯(lián)苯胺試驗及相關(guān)試劑短期（立即檢驗和室溫干燥1 h）對血痕DNA檢驗的影響，后續(xù)將在本研究的基礎(chǔ)上，在更多的時間點對聯(lián)苯胺試驗及相關(guān)試劑對血痕DNA檢驗的影響進(jìn)行研究，并對聯(lián)苯胺試驗影響血痕DNA檢驗的原理進(jìn)行深入的探討。

[1]羅凱，李明謙，曾途.隱性血痕在命案現(xiàn)場中的運用[J].廣西警官高等專科學(xué)校學(xué)報，2007（S1）：61-63.

[2]巴華杰，馬駿，朱愛華，等.雨淋外衣上潛在血跡DNA檢驗 1 例[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2010，26（3）：240.

[3]DE ALMEIDA J P，GLESSE N，BONORINO C.Effect of presumptive tests reagents on human blood confirmatory tests and DNA analysis using real time polymerase chain reaction[J].Forensic Sci Int，2011，206（1-3）：58-61.

[4]朱傳紅，鄭道利，倪堯志，等.聯(lián)苯胺預(yù)試驗處理血痕后樣本 DNA 定量的研究[J].刑事技術(shù)，2012（6）：13-16.

[5]巴華杰，林子清，劉亞楠，等.5種免提取試劑盒檢驗濾紙血痕結(jié)果的比較[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2013，28（1）：49-51.