人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合多孔羥基磷灰石支架的體內(nèi)異位成骨效果

趙倩，陳爭暉，青薇，黃麗娟，牟雁東，，任小華

(1.西南醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610000)

頜骨骨量不足或缺損是口腔種植中最常見的問題，特別是對于因腫瘤、外傷等造成大面積頜骨缺損的患者，目前的骨修復(fù)方式主要為自體骨移植、異體骨移植、人工骨移植等。其中人工骨移植可避免患者自身取材的痛苦和并發(fā)癥，以及同種異體骨免疫排斥的危險。故近年來骨組織工程的研究發(fā)展迅速，其具有良好的組織相容性及可重復(fù)性，有望成為骨缺損修復(fù)的良好替代物[1-3]。

本研究，應(yīng)用人胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合多孔HA支架在比格犬的背肌內(nèi)異位成骨，探討多孔HA支架作為人工骨替代材料的異位成骨效果。

1 材料與方法

1.1 材料

動物：12月齡比格犬3只，體重10～12 kg，雄性，四川省人民醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)室提供。細(xì)胞：人胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hPMSCs),四川大學(xué)生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。主要試劑及儀器：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、消化用胰酶、青-鏈霉素(Gibco公司)；CO2培養(yǎng)箱(SANYO公司)；JSM-7500F掃描電鏡(日本日立公司)等。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代、三系誘導(dǎo)分化、鑒定及生物相容性

方法見文獻(xiàn)[4]。

1.3 多孔HA支架的制備與消毒滅菌

多孔HA支架由西南交通大學(xué)材料與生命工程學(xué)院制備：直徑6 mm，高3 mm，孔隙率80%，孔徑750～900 μm規(guī)格的多孔HA支架，材料的宏孔孔壁表面具有條紋樣微渠結(jié)構(gòu)(圖1B)。環(huán)氧乙烷消毒，分裝備用。

1.4 構(gòu)建細(xì)胞支架復(fù)合體

取出多孔HA支架放于6孔板中，用DMEM培養(yǎng)基預(yù)先浸泡48 h。取第5代處于指數(shù)增長期的hPMSCs，用PBS洗滌兩次后加入胰酶+EDTA消化3～5 min，再用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基洗滌后，調(diào)整細(xì)胞懸液密度至終為2×105/mL，接種到已經(jīng)處理好的多孔HA支架材料上，使材料剛好被細(xì)胞懸液浸潤，3 h后將多孔HA支架翻面，將細(xì)胞懸液接種在材料的另一面，3 h后加入含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基至剛好沒過材料的頂面，構(gòu)建好的組織工程骨在6孔板中共培養(yǎng)7 d，隔1～2 d換液1次。

1.5 掃描電鏡觀察人胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞在支架表面的黏附形態(tài)

細(xì)胞支架共培養(yǎng)2 d后取出，PBS清洗3次，2.5%戊二醛4 ℃固定24 h，體積分?jǐn)?shù)為30%，50%，75%，85%，95%，100%梯度乙醇脫水，各15 min，臨界點(diǎn)干燥，噴金，掃描電鏡觀察細(xì)胞在支架表面的形態(tài)。

1.6 多孔HA支架與細(xì)胞支架復(fù)合體植入比格犬背部

麻醉：犬禁食禁飲12 h，稱重后用戊巴比妥鈉3 mg/kg濃度行靜脈注射麻醉，俯臥位固定于手術(shù)臺，背部常規(guī)備皮，碘伏消毒，鋪無菌巾。切開、植入、縫合：分別于3只犬的背部脊柱兩側(cè)分各作1個長約4 cm縱行切口，以血管鉗鈍性分離皮下組織及淺筋膜，深達(dá)脂肪深層，直至顯露肌肉淺筋膜，再于暴露的肌層表面做3個長約1 cm縱行切口，分別以血管鉗探入切口擴(kuò)大腔隙在肌肉之間形成約10 mm×10 mm的肌袋，將多孔HA支架和細(xì)胞支架復(fù)合體以生理鹽水或血液潤濕后，置入上述肌袋中，背肌左側(cè)3個肌袋中各放置1個多孔HA支架共9個為對照組，右側(cè)3個肌袋中各放置1個細(xì)胞支架復(fù)合體共9個為實(shí)驗(yàn)組，再縫合該切口，使材料完全被肌肉包裹。稀釋碘伏、生理鹽水沖洗術(shù)野后，逐層縫合切口(圖2)。術(shù)后處理：術(shù)后用青霉素160萬單位肌注，2次/d，預(yù)防感染2 d。分籠飼養(yǎng)，給足量的食物、飲水。

1.7 取材及檢測

術(shù)后12周，以上述方法麻醉后，從比格犬背部皮下肌層取材，取出后剔除材料周圍肌肉組織并以生理鹽水沖洗植入物表面后放入10%中性甲醛固定液，再進(jìn)行下一步HE、Masson、免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后組織愈合情況

術(shù)后3 d，所有犬只術(shù)后恢復(fù)良好，無感染等情況發(fā)生。

2.2 人胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)

細(xì)胞呈典型的長梭形，大小均勻一致，集簇狀生長，螺旋狀排列，類似成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，生長狀況良好，平均3～5 d傳代1次(圖1A)。

2.3 掃描電鏡觀察hPMSCs在支架表面黏附形態(tài)

hPMSCs在多孔HA支架中培養(yǎng)24 h后細(xì)胞的黏附情況佳，細(xì)胞傾向于沿著孔壁表面的條紋樣微渠結(jié)構(gòu)排列生長(圖1C、D)。

2.4 HE染色組織學(xué)觀察結(jié)果

第12周時，兩組均有大量骨基質(zhì)形成，但實(shí)驗(yàn)組已經(jīng)可見成熟骨板結(jié)構(gòu)(圖3)。

2.5 Masson染色組織學(xué)觀察結(jié)果

植入12周時，組織切片中的紅染部分為成熟骨，實(shí)驗(yàn)組明顯較對照組成熟骨的形成面積大(圖4)。

2.6 免疫組化染色組織學(xué)觀察結(jié)果

植入12周時，對照組OCN表達(dá)量強(qiáng)于實(shí)驗(yàn)組，而實(shí)驗(yàn)組的OCN在支架周圍基本無表達(dá)，表達(dá)主要集中于支架的孔洞中心(圖5)。

3 討論

組織工程骨主要由種子細(xì)胞、支架材料、生長因子三部分組成[5]。其中種子細(xì)胞研究較多的為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，但其在骨髓中含量僅有0.001%～0.01%[6]，且有研究表明，體外培養(yǎng)其傳代最大值為24～40代，以后細(xì)胞則會出現(xiàn)衰老和生長抑制現(xiàn)象[7]；脂肪干細(xì)胞屬于成體干細(xì)胞，不具備無限增殖和分化潛能，在體外長時間培養(yǎng)還有自發(fā)向惡性轉(zhuǎn)化的傾向[8]；胚胎干細(xì)胞來源廣泛、取材方便、具有全能分化能力，是胚胎發(fā)育早期囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中尚未分化的細(xì)胞，能夠長期保持未分化性增殖，充分保持干細(xì)胞的多能性，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有相似的生物學(xué)特性[9]。因此本研究所用種子細(xì)胞為人胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，為較理想的種子細(xì)胞來源。對于支架材料而言，應(yīng)需具備的關(guān)鍵性能為良好的生物相容性、骨傳導(dǎo)及骨誘導(dǎo)作用。本研究所用多孔HA支架具體具備以下特性：(1)良好的生物相容性。(2)三維立體多孔結(jié)構(gòu)。骨是一種新陳代謝率很高的組織，它需要大量的血管供應(yīng)體內(nèi)結(jié)構(gòu)的平衡、生長和重建。本材料的多孔結(jié)構(gòu)及適宜的孔隙率有利于種子細(xì)胞同外周環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換，孔與孔間的貫通性既可為種子細(xì)胞的生長、增殖和分化提供充足的三維空間，又能促進(jìn)新生血管和神經(jīng)的長入[10]。(3)良好的材料-細(xì)胞界面。多孔HA支架表面的微溝槽結(jié)構(gòu)使細(xì)胞傾向于沿著支架孔壁表面的條紋樣微渠結(jié)構(gòu)排列生長，且保持長梭形，部分細(xì)胞伸出偽足，有利于細(xì)胞更加緊密的粘附于支架表面，為細(xì)胞的黏附和增殖提供了良好的界面[11]。(4)支架材料易于消毒、保存，消毒后支架材料的內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整無破壞。

本實(shí)驗(yàn)選取的異位成骨是指在非骨組織內(nèi)成骨，一般可選擇植入肌袋內(nèi)或皮下，與原位植骨比能夠排除在原位骨組織內(nèi)植入時由于受體骨、骨膜本身成骨的假陽性結(jié)果，從而準(zhǔn)確判斷植入物的成骨能力僅來自植入的組織工程骨，使研究結(jié)果更為真實(shí)可信。而肌肉組織中具有豐富的血液供應(yīng)，移植后能夠提供良好的血供給組織工程骨，促進(jìn)其成骨。故本實(shí)驗(yàn)選擇異位成骨來研究多孔HA支架的成骨能力[12-13]。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，hPMSCs與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)極其相似，在多孔HA支架中沿著支架表面的微溝槽結(jié)構(gòu)排列，粘附情況佳，提示支架為細(xì)胞的黏附和增殖提供了很好的三維空間結(jié)構(gòu)，為組織工程骨的良好支架材料。HE及Masson染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對照組在比格犬背肌內(nèi)異位成骨情況均較好，支架孔隙中均可見大量血管結(jié)構(gòu)，證明支架材料結(jié)構(gòu)非常有利于血管的長入，能夠?yàn)楣切纬商峁┴S富的營養(yǎng)，以利于骨的形成[14-15]。實(shí)驗(yàn)組骨基質(zhì)面積與成熟骨板面積大于對照組，說明前者成骨效率可能大于后者，提示hPMSCs細(xì)胞可能在成骨過程中持續(xù)發(fā)揮重要作用，在多孔HA陶瓷支架的誘導(dǎo)下向著成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞方向分化，從而成骨效果更佳。免疫組織化學(xué)染色的OCN的表達(dá)情況顯示，在12周時對照組成骨活躍，而實(shí)驗(yàn)組可見支架表面基本沒有OCN的表達(dá)，提示此時支架表面已經(jīng)成骨，僅在支架的孔洞中心還存在活躍的成骨行為，表明實(shí)驗(yàn)組成骨性能優(yōu)于對照組。

綜上實(shí)驗(yàn)初步探討了人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合多孔HA支架體內(nèi)的異位成骨效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩組在比格犬背肌內(nèi)異位成骨效果均佳，實(shí)驗(yàn)組成骨效果優(yōu)于對照組，提示體外培養(yǎng)的人胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞能夠促進(jìn)新骨的形成。

[1] Abdel Meguid E，Ke Y，Ji J，etal.Stem cells applications in bone and tooth repair and regeneration：New insights,tools,and hopes[J].J Cell Physiol，2017，9999：1-11.

[2] Arrabal PM,Visser R,Santos-Ruiz L,etal.Osteogenic molecules for clinical applications：improving the BMPcollagen System[J].Biol Res，2013，46(4)：421-429.

[3] Sierra-Garcíal GD,Castro-Ríos R,Gónzalez-Hortal A，etal.Proteínas morfogenéticas óseas (BMP):aplicación clínica para reconstrucción de defectos en hueso[J].Gac Med Mex,2016,152(3):381-385.

[4] 伍佳，溫永梅，呂欣榮等.人胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)性能及體外生物相容性[J].中國組織工程研究，2017，21(5)：755-759.

[5〗 Zhang HF，Mao XY，Zhao DY，etal.Three dimensional printed polylactic acid-hydroxyapatite composite scaffolds for prefabricating vascularized tissue engineered bone：An in vivo bioreactor model[J].Sci Rep,2017,7(1)：15255.

[6] Caplan AI.New era of cell-based or thopedic therapies[J].Tissue Eng Part b Rev，2009，15(2)：195-200.

[7] Banfi A，Muraglia A，Dozin B，etal.Proliferation kinetics anddifferentiation potential of ex vivo expanded human bone marrow stromal cells:Implications for their use in cell therapy[J].Exp Hematol，2001，28(6)：707-715.

[8] Kern S，Eichler H，Stoeve J，etal.Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood,or adipose tissue[J].Stem Cells， 2006，24(5)：1294-1301.

[9] Kokubo T，and Takadama H.How useful is SBF in predicting in vivo bone bioactivity?[J].Biomaterials，2006,27(15):2907-2915.

[10] Vacanti C， Pietrzak WS.Musculoskeletal Tissue Regeneration:Biological Materials and Methods.New Jersey:Springer Science and Business Media,2008.

[11] Vacanti C，Pietrzak WS.Musculoskeletal Tissue Regeneration:Biological Materials and Methods[M].New Jersey: Springer Science and Business Media,2008.

[12] Miron RJ， Zhang YF.Osteoinduction: A review of old concepts with new standards[J].J Dent Res，2012，91(8)：736-744.

[13] Rao RR，Stegemann JP.Cell-Based Approaches to the Engineering of Vascularized Bone Tissue[J].Cytotherapy，2013，15(11)：1309-1322.

[14] Kaigler D，Krebsbach PH，Polverini PJ，etal.Transplanted endothelial cells enhance orthotopic bone regeneration[J].J Dent Res，2006，85(7)：633-637.

[15] Kale S，Biermann S，Edwards C，etal.Three-dimensional cellular development is essential for ex vivo formation of human bone[J].Nat Biotechnol，2000，18(9)：954-958.