低強度脈沖超聲對大鼠牙本質(zhì)損傷修復過程中鈣離子轉(zhuǎn)運相關蛋白表達的影響

左靜　甄佳秀　楊正艷　李月恒　羅俊

第三期牙本質(zhì)是牙齒萌出后在不斷受到各種內(nèi)源性及外源性病理刺激后牙本質(zhì)-牙髓復合體產(chǎn)生的防御修復反應，包括反應性牙本質(zhì)及修復性牙本質(zhì)2 種[1-2]。由于第三期牙本質(zhì)的形成可增加剩余牙本質(zhì)厚度[3]，且其新形成的牙本質(zhì)小管明顯彎曲、數(shù)目較少，可有效減少外部刺激向髓腔內(nèi)傳導，對于保存健康牙髓、緩解牙本質(zhì)過敏癥狀等方面有重要意義。

低強度脈沖超聲(low intensity pulsed ultrasound,LIPUS)是一種非侵入性的理療方法，因其對骨組織獨特的生物學效應，被廣泛應用于新鮮骨折及骨不連等的臨床治療[4]。由于牙體硬組織與骨組織結(jié)構(gòu)的相似性，且有報道認為早期形成的第三期牙本質(zhì)具有某些骨樣特征[5]，我們推測LIPUS可能對牙體硬組織的修復也有一定作用。有研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的牙齒經(jīng)LIPUS輻照后有修復性牙本質(zhì)形成，且可觀察到DMP1、DSPP等牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白表達增加[6]，說明LIPUS可能對牙本質(zhì)基質(zhì)形成及早期礦化誘導有一定作用，但對于其是否會調(diào)節(jié)鈣鹽轉(zhuǎn)運，促進第三期牙本質(zhì)的礦化成熟尚無任何研究。因而本實驗希望通過檢測LIPUS 輻照后牙本質(zhì)-牙髓復合體上鈣離子轉(zhuǎn)運主要蛋白Cav1.2及NCX1表達變化，探討LIPUS是否對鈣離子轉(zhuǎn)運具有調(diào)節(jié)作用及其可能的作用機制。

1　材料與方法

1.1　實驗動物，分組及模型建立

成年雄性SD大鼠[(360±13) g， 12～13 周，n=40]，由重慶醫(yī)科大學動物實驗中心提供。將40只SD大鼠10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉(0.3 ml/100 g)在右側(cè)上頜第一磨牙面采用改良備洞法建立牙本質(zhì)損傷模型[7-8]。隨機選取其中20只大鼠對備洞牙予以超聲輻照，剩余20只大鼠對未備洞的左側(cè)上頜第一磨牙予以超聲輻照，最終形成備洞組、備洞+LIPUS組、LIPUS組及空白對照組4 個研究組。所有操作均由一名經(jīng)驗豐富的實驗技術(shù)員完成。本動物實驗計劃獲得重慶醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2　超聲設備、參數(shù)設定及輻照方式

本實驗超聲設備為低強度脈沖超聲儀(重慶海扶)，使用前已通過超聲功率計UPM-DT-1重新調(diào)試并校正了強度，設定超聲波輸出頻率1.5 MHz，功率30 mW/cm2, 脈沖信號長度200 us，重復率1 KHz。超聲換能器探頭為10 mm×5 mm的長方形，形似牙刷，使用時表面涂布一層超聲耦合劑，將其縱向輕置于磨牙咬合面(圖 1)，每天連續(xù)輻照20 min?？瞻讓φ战M及LIPUS組采用超聲假照處理。

分別在持續(xù)作用1、 3、 7 d及14 d后處死SD大鼠，并即刻將SD大鼠上頜磨牙連同周圍牙槽骨一并取下，用于后續(xù)處理分析。

1.3　組織病理學分析

取出的上頜磨牙區(qū)組織40 g/L甲醛液固定48 h，充分沖洗，10%EDTA脫礦液中脫礦3～4 周，修整組織塊，石蠟包埋，層厚4 μm連續(xù)切片，HE染色，光鏡下觀察。顯微病理圖文分析軟件(Olympus DP80 YC.YX-2050，日本)采集圖片，進行對比分析。

1.4　免疫組化

上述石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2去離子水避光條件下孵育10～20 min消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，胃蛋白酶37 ℃條件下消化15～30 min進行抗原修復，正常山羊血清工作液封閉， 37 ℃孵育10～30 min后傾去封閉液，以封閉非特異性抗原，分別滴加Cav1.2， NCX1單克隆抗體(1∶200， Abcam, UK), 4 ℃孵育過夜，滴加二抗，室溫孵育30 min，滴加SABC,鏡下控制使用DAB工作液顯色，蘇木素復染1～2 min。上述每步后均用PBS沖洗5 min×3，陰性對照用PBS代替一抗，其余步驟相同。顯微病理圖文分析軟件采集圖片，Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對圖片的IOD SUM及area進行測量，計算平均吸光度值(MOD,mean density)，MOD=IOD SUM/area，繪制MOD值變化曲線，觀察比較各蛋白表達變化。

圖 1　低強度脈沖超聲儀及超聲輻照示意圖

1.5　統(tǒng)計學分析

2　結(jié)　果

2.1　組織病理學觀察

2.1.1空白對照組成牙本質(zhì)細胞呈柱狀緊密排列于牙本質(zhì)內(nèi)側(cè)，髓腔內(nèi)細胞形態(tài)正常，排列層次清楚，由外向內(nèi)分為乏細胞層、多細胞層及固有牙髓層，多個小血管散在分布于髓腔內(nèi)(圖 2)。

2.1.2LIPUS輻照組與空白對照組相比，髓腔內(nèi)細胞形態(tài)及層次結(jié)構(gòu)無明顯變化，僅近輻照側(cè)多細胞層牙髓細胞少許增多，有向成牙本質(zhì)細胞層遷移的趨勢(圖 3)。

2.1.3備洞組1 d時成牙本質(zhì)細胞層排列紊亂，近牙尖處部分成牙本質(zhì)細胞消失，有較多炎癥細胞浸潤，多細胞層細胞增多，髓腔內(nèi)血管擴張充血， 3 d時病理改變與1 d相似。 7 d時炎癥緩解，牙髓細胞增多，有少量長梭型細胞向牙本質(zhì)遷移形成成牙本質(zhì)細胞樣細胞，有少量修復性牙本質(zhì)形成， 14 d時成牙本質(zhì)細胞樣細胞增多，乏細胞層不明顯，多細胞層細胞增加(圖 3)。

2.1.4LIPUS+備洞組1 d及3 d時炎癥明顯，髓腔內(nèi)細胞表現(xiàn)與備洞組相似，但7 d及14 d時遷移而來的成牙本質(zhì)細胞樣細胞數(shù)目相對而言更多，且修復性牙本質(zhì)形成更加明顯(圖 3)。

2.2　免疫組化圖像分析

2.2.1Cav1.2定位與表達變化免疫組化染色顯示Cav1.2蛋白在各組均有表達，染色陽性呈現(xiàn)為黃色-棕黃色， 定位于深入牙本質(zhì)內(nèi)的成牙本質(zhì)細胞突起上。

備洞組、備洞+LIPUS組各時間點及LIPUS組1 d時MOD值均較空白對照組大(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。備洞+LIPUS組在1 d(P=0.008)及3 d(P=0.017)MOD值比備洞組明顯升高(圖 4)，而7 d及14 d時差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)，MOD值曲線總體表現(xiàn)為緩慢下降趨勢(圖 5A)。

D: 牙本質(zhì); PD: 前期牙本質(zhì); P: 牙髓; OD: 成牙本質(zhì)細胞層; Cf: 乏細胞層; Cr: 多細胞層

圖 2空白對照組(HE,×400)

D: Dentin; PD: Predentin; P: Pulp; OD: The odontoblastic cell layer; Cf: Cellular few layer; Cr: Cellular rich layer

Fig 2Sections of the control group(HE，×400)

圖 3牙髓牙本質(zhì)病理組織學觀察(HE，×400)

Fig 3Paothological observation of dental pulp and dentin(HE，×400)

圖 4Cav1.2蛋白的表達(→： 指黃棕色區(qū)域為蛋白表達區(qū)域)(免疫組織化學染色,×400)

Fig 4Cav1.2 expression(Arrow： Positive staining areas)(IHC,×400)

圖 5　各組陽性染色平均吸光度值變化曲線

2.2.2鈉鈣交換體NCX1蛋白定位與表達變化免疫組化染色顯示NCX1在各組均有表達，染色陽性呈現(xiàn)為棕黃色-深棕色，主要定位于髓腔內(nèi)各種牙髓細胞胞膜及細胞質(zhì)，其中在成牙本質(zhì)細胞胞體及突起上表達更明顯。

備洞組1 d(P=0.002)及備洞+LIPUS組1 d(P=0.000 3)、 3 d(P=0.001)時MOD值較空白組顯著升高，其余組別MOD值較空白對照組無明顯統(tǒng)計學差異。備洞+LIPUS組MOD值與備洞組相比在1 d(P=0.000 4)及3 d(P=0.008)時明顯升高(圖 6)， 7 d及14 d則無明顯差異，MOD值曲線總體表現(xiàn)為緩慢下降趨勢(圖 5B)。

3　討　論

本實驗通過建立牙本質(zhì)損傷的動物模型，探討低強度脈沖超聲是否對牙本質(zhì)-牙髓復合體及鈣離子轉(zhuǎn)運相關蛋白具有調(diào)節(jié)作用。組織學觀察發(fā)現(xiàn)牙本質(zhì)損傷后牙本質(zhì)-牙髓復合體會產(chǎn)生一系列炎癥修復反應，這證明了牙本質(zhì)-牙髓復合體自身的修復再生潛能，而這種修復過程是與炎癥反應密切相關的，并非一種完全獨立的生命活動[9]。備洞+LIPUS組形成的修復性牙本質(zhì)及成牙本質(zhì)細胞樣細胞均較備洞組更明顯，由此推測低強度脈沖超聲可能誘導了牙髓細胞向損傷區(qū)域遷移分化，參與并促進了第三期牙本質(zhì)的形成， 這與Al-Daghreer 等[10-11]的研究結(jié)果一致。然而有趣的是單純超聲輻照正常牙齒并不能觀察到有修復性牙本質(zhì)形成或其他明顯的病理變化。因而我們推測超聲可能是在牙齒損傷修復開啟后對修復反應具有協(xié)同強化作用。

圖 6NCX1在髓腔的表達情況，→所指黃棕色區(qū)域為蛋白表達區(qū)域(免疫組織化學染色,×400)

Fig 6The expression of NCX1， Arrow: Positive staining areas(IHC,×400)

Cav1.2為成牙本質(zhì)細胞上主要的L-型鈣離子通道蛋白基因型，可將循環(huán)血液中的鈣離子轉(zhuǎn)運進成牙本質(zhì)細胞內(nèi)，NCX1是牙髓組織上鈉鈣交換體的主要基因型，是成牙本質(zhì)細胞內(nèi)鈣離子向礦化前沿定向外排系統(tǒng)的重要組成部分，二者對于促進牙本質(zhì)礦化成熟及維持細胞內(nèi)外鈣離子穩(wěn)態(tài)具有重要作用，Cav1.2-NCX1途徑是目前學術(shù)界認可的牙本質(zhì)礦化時鈣離子的主要轉(zhuǎn)運方式[12-14]。本實驗發(fā)現(xiàn)Cav1.2及NCX1在牙本質(zhì)損傷后表達明顯增加， 1 d時最高，后逐漸下降， 14 d時基本降至空白對照組水平，提示Cav1.2、NCX1在損傷早期即被迅速激活，推測其可能參與了損傷的早期感知與修復過程。而備洞+LIPUS組在1天及3天的蛋白表達量又明顯高于單純備洞組，提示超聲可能在損傷早期對Cav1.2及NCX1的表達具有明顯促進作用，后期則不明顯，超聲的這一現(xiàn)象在促進骨折愈合方面已有相關報道[15]，但在牙齒修復尚無研究。與空白對照組相比，Cav1.2 在LIPUS輻照1 d時明顯提高，可能是由于超聲的機械刺激所致，謝亞佳 等[16]的研究發(fā)現(xiàn)Cav1.2在張應力刺激12 h時基因表達明顯增加，但24 h后表達水平即下調(diào)，這種現(xiàn)象可能解釋了Cav1.2蛋白在1 d時表達明顯升高的原因，但也不能完全排除是實驗誤差所致。其余時間點單純超聲刺激并沒有觀察到有明顯的蛋白表達增加，結(jié)合HE染色顯示的LIPUS組的形態(tài)學表現(xiàn)，這可能提示本實驗所設超聲輻照較安全，并不會誘導正常組織發(fā)生明顯明顯生理及病理改變，但其具體安全閾值及促進修復性牙本質(zhì)形成的最適閾值仍需要進一步研究。

綜上所述， 低頻脈沖超聲可能會促進牙本質(zhì)損傷早期鈣離子轉(zhuǎn)運主要蛋白的表達，加快第三期牙本質(zhì)修復進程，對牙體硬組織的防御修復具有一定的臨床意義。

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