淫羊藿苷/載明膠納米復(fù)合物-PLGA緩釋系統(tǒng)的制備及工藝優(yōu)化

宋效慶,劉　紅,陳天杰,劉稱稱,路政寬,秦　爽,黃　山

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院綜合治療科，吉林 長春 130021)

先天畸形、外傷、感染及手術(shù)所導(dǎo)致的骨缺損患者日益增多，且臨床修復(fù)難度較大，對患者的身心健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，已經(jīng)成為極其嚴(yán)重的公共健康問題[1]。近年來，中醫(yī)藥治療骨缺損方面顯示出巨大優(yōu)勢，尤其是單味中藥有效成分具有選擇性高、針對性強(qiáng)的特點(diǎn)。在眾多中藥提取的有效成分的對比研究中，淫羊藿苷(icariin,ICA)具有顯著的成骨效能，被認(rèn)為是最具潛力的促進(jìn)骨修復(fù)的天然藥物之一[2-3]。

但I(xiàn)CA較低的生物利用率和短的半衰期限制了其臨床應(yīng)用。將ICA載入緩釋體系，提高其生物利用率是目前較為熱門的研究課題[4]。聚合物載體系統(tǒng)可以保護(hù)藥物免于降解，并在藥物釋放的靶點(diǎn)提供一個(gè)預(yù)先設(shè)計(jì)的方式給藥，獲得更好的療效，同時(shí)排除了過高和過低給藥的可能。 明膠是一種從膠原中提取的水溶性大分子鏈，明膠本身具有大量的氨基和羧基，并且可以通過pH值的調(diào)節(jié)改變其表面電勢[5]，是一種良好的載體和保護(hù)劑，明膠納米微球用于載藥研究已近三十年，并首先應(yīng)用于小相對分子質(zhì)量藥物的載體[6]。聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid,PLGA]是一種高分子聚合物，是被美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)認(rèn)證的生物載體材料，其具有良好的生物相容性和可降解性。納米-微球系統(tǒng)是新型的載藥體系，在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中均取得了較為理想的結(jié)果。目前，已有學(xué)者[7-9]將PLGA、脂質(zhì)體和殼聚糖包封于PLGA微球中，形成復(fù)合載藥體系，但尚未見有關(guān)明膠PLGA復(fù)合微球載藥系統(tǒng)的相關(guān)報(bào)道。本研究利用S/O/W法[10]制備一種新型緩釋系統(tǒng)。這種方法是基于制備出具有吸附作用的明膠納米粒(gelatin nanoparticles,GNPs)[11]，ICA通過氫鍵結(jié)合于納米粒的表面，形成無特定相對分子質(zhì)量的納米復(fù)合物，納米復(fù)合物可以與可降解的控釋聚合物兼容，容易被PLGA聚合物包封。本研究對載體系統(tǒng)的設(shè)計(jì)、物理化學(xué)特性和釋放特點(diǎn)進(jìn)行檢測,并優(yōu)化制備工藝。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器PLGA(50∶50 PLGA, 相對分子質(zhì)量為30 000～60 000)、 聚乙烯醇(PVA)和A 型明膠(美國Sigma公司);二氯甲烷(CH2Cl2)和分析純(中國北京化工廠)；丙酮、無水乙醇和50%戊二醛(中國天津市廣成試劑有限公司，均為分析純)。熒光倒置顯微鏡和光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)，臺式高速離 心 機(jī)(德國Eppendorf公司)，JB-2型 恒 溫磁力攪拌器(中國上 海 雷 磁新涇儀器有限公司)，KQ-100DA型超聲儀(中國昆山市超聲儀器有限公司)，高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，掃描電子顯微鏡(SEM)(日本 Hitachi公司)，納米粒度點(diǎn)位分析儀(美國Zeta PALS公司)，普通臺式離心機(jī)(中國上海安亭離心機(jī)械廠)，JB-2 型恒溫磁力攪拌器(中國上海雷磁新涇儀器有限公司)

1.2 ICA納米復(fù)合物的制備GNPs的制備使用二步去溶劑法[11-12]。取500 mg明膠加入到10 mL去離子水中，加熱溶解制成明膠水溶液；再向明膠水溶液中加入10 mL丙酮，獲得沉淀的明膠200～300 mg，然后用10 mL去離子水再次溶解，得到明膠水溶液，并將溶液的pH值調(diào)整為2.5～4.0；在500～1 000 r·min-1磁力攪拌下將30～40 mL丙酮逐滴加入得到的明膠水溶液中，使體系乳化，然后立即向上述體系中加入40 μL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的戊二醛水溶液，40℃繼續(xù)攪拌1 h，再將乳液室溫靜置8 h使GNPs固化，得到GNPs懸浮液,置于4℃冰箱冷藏；取2 mL上述溶液，去離子水清洗沉淀3～5次，向最后所得的沉淀中加入1 mL去離子水，得到6 g·L-1GNPs保存液，再加入1 g·L-1ICA的甲醇儲備液1 mL，然后于恒溫箱25℃內(nèi)共混24 h，將得到的乳液離心，去上清，加入0.5 mL的去離子水溶液，超聲5～10 min,得到吸附ICA的GNPs混懸液。

1.3 ICA@GNPs-PLGA復(fù)合微球的制備將得到的吸附ICA的GNPs混懸液加入到1.5 mL PLGA(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%～2.00%)的CH2Cl2溶液中，超聲5～10 min，形成S/O混合相；形成的S/O混合相中緩慢滴入15～20 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的聚乙烯醇(PVA)水溶液，滴加的速度為1～2 mL·min-1，然后于1 000～2 000 r·min-1下攪拌4 h，5 000 r·min-1離心，離心產(chǎn)物用去離子水洗滌3～4次，凍干，最后于4℃冰箱冷藏，從而得到所述的載ICA的PLGA-明膠復(fù)合微球。

1.4 GNPs和ICA@GNPs-PLGA微球表征的觀測GNPs的尺寸和形貌利用SEM觀測，去離子水洗滌 3 次，離心 15 min 后濃縮，樣品凍干，得到GNPs粉末，置于硅片上，真空下噴金2 nm。PLGA的尺寸和形貌利用SEM觀測，方法同上。使用 Nano measurer 1.2 軟件計(jì)算粒徑分布范圍。

1.5 ICA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制色譜條件及樣品制備：高效液相色譜法(high performance liquid chromatography， HPLC)檢測方法為內(nèi)標(biāo)法[13]。色譜柱：Zorbax SB-C18 HPLC column (5 μm,4.6,150 mm)；流動相：-55%A+45%D (A: H2O+0.2% H3PO4, D: 甲醇)；檢測波長：270 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30.0℃；進(jìn)樣量：10 μL。將ICA明膠納米復(fù)合物的水溶液恒溫震蕩分散2 h后，取500 μL溶液，10 000 r·min-1離心5 min后，再用微孔濾膜濾過，得樣品溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精確量取ICA甲醇溶液對照樣品溶液1.0 mL，加水稀釋成濃度分別為1、3、7、10、30、50和70 mg·L-1的水溶液，依次取10 μL 注入高效液相色譜儀內(nèi)，按上述色譜條件測定色譜峰面積，以樣品濃度(mg·L-1)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到回歸方程。

1.6納米粒復(fù)合物中ICA吸附量的檢測將0.5 mL納米復(fù)合物儲備液加入去離子水，補(bǔ)液至10 mL，超聲5 min，離心，測量上清液中ICA的濃度，后收集GNPs再次分散，重復(fù)2次，采用HPLC測試染料木素的含量，將3次結(jié)果相加得到染料木素的含量。HPLC檢測條件同上。按以下公式計(jì)算吸附率：吸附率=[N1(上清液藥物含量)+N2(上清液藥物含量)+ N3(上清液藥物含量)]/初始投入量×100%(N為離心的次數(shù))。

1.7藥物體外釋放規(guī)律和載藥量觀察檢測所用微球制備條件同表1中微球7。稱取10 mg制備的復(fù)合微球分為3份，置于裝有40 mL PBS的試管中。在37℃條件下，將試管放入恒溫?fù)u床中震蕩，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1，隨著明膠的溶脹，ICA逐漸被釋放出來，每隔一段時(shí)間取緩釋液500 μL，并同時(shí)補(bǔ)充500 μL生理鹽水到釋放體系中，HPLC條件同上。按以下公式計(jì)包封率(entrapment efficiency，EE)：EE= (微球中藥物含量/初始投藥量)×100%；按以下公式計(jì)算載藥量(drug loading,DL)：DL=(微球中藥物含量/微球總質(zhì)量)×100%。

2　結(jié)　果

2.1 GNPs和載藥微球的形態(tài)冷凍干燥后的GNPs外觀呈白色或淡黃色，大小均一，微球的粒徑為150～200 nm。冷凍干燥后得到的載藥微球?yàn)榘咨勰?，在室溫下放置穩(wěn)定，分散性良好。SEM觀察：載藥微球的球形度較好、表面光滑、分散性良好，微球的粒徑為4～12 μm。見圖1。

圖1　GNPs(A)和載藥微球(B)的表面形貌

Fig.1Surface morphology of GNPs (A) and microspheres(B)

2.2ICA的標(biāo)準(zhǔn)曲線采用HPLC對不同濃度的ICA進(jìn)行吸光度(A)值的測定，得到其線性回歸方程為：y=22 170x+51.092,R2=0.987 8。

2.3 ICA@GNPs-PLGA復(fù)合微球的優(yōu)化當(dāng)PLGA與明膠的質(zhì)量比為5∶2時(shí)，形成的復(fù)合微球的比例達(dá)到100%；當(dāng)PLGA與明膠的質(zhì)量比超過5∶2時(shí)，復(fù)合微球的制備過程中出現(xiàn)大量的明膠碎片。復(fù)合微球的形貌特征由核心球的大小、PLGA與明膠的質(zhì)量比和轉(zhuǎn)速決定。轉(zhuǎn)速為2 000 r·min-1時(shí)，復(fù)合微球的均一性優(yōu)于1 000 r·min-1，轉(zhuǎn)速超過2 000 r·min-1時(shí)，制備出的復(fù)合微球乳液中出現(xiàn)大量的明膠團(tuán)塊狀沉淀，完全復(fù)合微球形成比例也明顯下降。見表1。

2.4 GNPs對ICA的吸附量當(dāng)溫度超過25℃、時(shí)間超過24 h、GNPs的濃度超過6 g·L-1時(shí)，GNPs對ICA的吸附量超過90%;當(dāng)溫度超過33℃時(shí)，GNPs對ICA的吸附量下降至77%;繼續(xù)升高溫度達(dá)到37℃時(shí)，明膠對ICA的吸附量低于65%。

表1　在不同條件下制備的ICA@GNPs-PLGA復(fù)合微球

2.5 ICA@GNPs-PLGA復(fù)合微球EE和DLPLGA微球的載藥量取決于GNPs對藥物的吸附量，在復(fù)合微球可以完全包封GNPs的范圍內(nèi)，復(fù)合微球的DL與明膠對藥物的吸附能力呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。同時(shí)ICA投入量與PLGA的EE呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。見圖2。ICA@GNPs-PLGA微球的EE高于(62.00±1.25)%。核殼比為5∶2時(shí)，復(fù)合微球的DL最高，約為13.7%，當(dāng)超過一比例和低于這一比例復(fù)合微球的DL均會下降。

CM:Total content of drug in microsphere;C∑-C:Adsorbing capacity of drug in GNPs;I:ICA.

圖2ICA的EE和ICA投入量的關(guān)系

Fig.2Relationship between EE of ICA and quality of ICA added

2.6ICA@GNPs-PLGA復(fù)合微球體外釋放曲線PLGA微球的釋放從2 h到40 d,累積釋放率為65.21%。釋放特征顯示出較小的突釋, 24 h內(nèi)微球累積釋放率低于5.47%,由于藥物的溶解和分散于微球的表面，隨后藥物的持續(xù)釋放周期超過25 d。見圖3。

圖3　ICA@GNPs-PLGA復(fù)合微球體外釋放曲線

Fig.3 Release curve of ICA@GNPs-PLGA composite microspheres in vitro

3　討　論

目前，治療缺損的藥物主要有基礎(chǔ)性用藥、骨吸收抑制劑、骨形成促進(jìn)劑和混合制劑四類, 雖然二膦酸鹽和降鈣素等藥物在治療骨缺損方面經(jīng)臨床證實(shí)療效顯著，但其昂貴的價(jià)格和可能引起的一系列并發(fā)癥限制了其臨床應(yīng)用[14]。ICA是從淫羊藿中提取出來的一種異戊烯基黃酮醇苷，具有親水特性，大量研究[15-17]表明：ICA通過骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)通路、Wnt-β-Catenin通路、MAPK通路和Runx2、Osterix 2個(gè)蛋白節(jié)點(diǎn)調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為ICA具有強(qiáng)筋健骨，補(bǔ)腎助陽的作用，取材方便且價(jià)格低廉。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：ICA的藥理活性濃度為1×10-8～1×10-5mol·L-1,總體來看,1×10-8～1×10-5mol·L-1應(yīng)該是ICA發(fā)揮其最佳藥理活性可能出現(xiàn)的區(qū)間，當(dāng)濃度超過這一區(qū)間，ICA組破骨細(xì)胞凋亡率均明顯升高, 骨吸收陷窩數(shù)目、面積明顯減少，其抑制作用隨濃度增加而增強(qiáng)。故ICA的濃度和作用時(shí)間對于骨修復(fù)至關(guān)重要。工藝優(yōu)化的主要考察指標(biāo)是EE，制備完全包封ICA的納米復(fù)合物的緩釋微球是提高EE的關(guān)鍵。此外，復(fù)合微球的制備使用S/O/W溶劑蒸發(fā)法，不同于W/O/W 蒸發(fā)法，S/O/W溶劑蒸發(fā)技術(shù)制備的微球顯示出相對較高的EE，這種技術(shù)已經(jīng)成功地用于制備出包封多種藥物復(fù)合微球[18]?？紤]到ICA為針狀晶體粉末及其在水溶液和有機(jī)溶劑中的有限溶解度，本實(shí)驗(yàn)首先將ICA吸附于GNPs表面，然后使用S/O/W溶劑蒸發(fā)技術(shù)制備微球。PLGA的類型是其成球性最重要的影響因素[19]，出于最佳的成球性、EE與釋放特征，本實(shí)驗(yàn)選用50∶50的PLGA。

復(fù)合微球的制備實(shí)驗(yàn)以PLGA的濃度、PLGA和明膠的質(zhì)量比以及GNPs的投入量為自變量，以微球的粒徑和是否完全包封為因變量。PLGA的濃度設(shè)定為0.25%、0.50%、1.00%和2.00%，明膠的添加質(zhì)量為12、6和3 mg，為提高藥物的EE，保證GNPs的形態(tài)不被破壞，轉(zhuǎn)速設(shè)定為2 000 r·min-1以下，當(dāng)GNPs的質(zhì)量為6 mg時(shí)，PLGA在DCM中的臨界濃度為0.5% ～1.0%；當(dāng)GNPs的質(zhì)量上升至12 mg時(shí)，PLGA在DCM中的臨界濃度升至1.0%～2.0%。當(dāng)PLGA的濃度低于0.25%時(shí)，無完全包封的復(fù)合微球形成。同時(shí)，ICA的投入量和微球DL呈反比。攪拌速率和PVA的濃度未顯示出對DL的影響，所得到的數(shù)據(jù)差異可以被歸類于實(shí)驗(yàn)的操作誤差。本實(shí)驗(yàn)釋放檢測結(jié)果顯示：在臨界范圍內(nèi)制備的緩釋微球，不僅可以提高ICA的DL，同時(shí)大幅提高其載藥量，克服了PLGA微球降解初期的突釋現(xiàn)象，長時(shí)間維持藥物的有效濃度，間接降低了不良反應(yīng)，為骨缺損的表面改性涂層提供了一個(gè)全新的思路。

綜上所述，本研究在優(yōu)化條件下制備了DL較高、粒徑較為均一的 ICA@GNPs-PLGA微球，且經(jīng)過重復(fù)性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后，證明該緩釋體系形態(tài)良好、粒徑分布范圍較窄、可重復(fù)性好；同時(shí)在體外實(shí)驗(yàn)中這種復(fù)合微球克服了前期突釋，釋放時(shí)間超過40 d，本實(shí)驗(yàn)對緩釋體系的理性性質(zhì)進(jìn)了評價(jià)。未來本文作者將利用細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)及動物實(shí)驗(yàn)全面、系統(tǒng)地評價(jià)緩釋體系的生物活性及其臨床應(yīng)用的可行性。

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