妊娠高血壓綜合征患者胎盤組織中HIF-1α和HSP70的表達(dá)及其意義

藍(lán)永洪，饒朗毓，楊　智，黃明媚，牛海艷，齊亞靈

(1. 海南醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571199；2. 海南醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，海南 ?？?571199；3. 海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科，海南 ?？?570102；4. 海南醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，海南 ?？?571199)

妊娠高血壓綜合征(pregnancy-induced hypertension syndrome,PIH)簡(jiǎn)稱妊高征，是妊娠期特有的疾病。在我國(guó)妊高征的發(fā)生率為9.4%～10.4%，國(guó)外為7%～12%[1]。妊高征嚴(yán)重影響母嬰健康，是孕產(chǎn)婦和圍生兒并發(fā)其他疾病或死亡的主要原因[2-3]。目前認(rèn)為妊高征的病因是滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮蛻膜過(guò)淺，造成子宮螺旋小動(dòng)脈血管重鑄障礙，導(dǎo)致胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞缺血缺氧，產(chǎn)生大量的血管活性物質(zhì)進(jìn)入母體循環(huán)，損傷母體血管內(nèi)皮細(xì)胞，最終導(dǎo)致孕婦發(fā)生高血壓、水腫及蛋白尿等臨床表現(xiàn)[4-5]。缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是機(jī)體在缺氧情況下被激活的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定方面有重要的意義。HIF-1α在缺氧情況下不僅能夠調(diào)節(jié)低氧相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，而且參與低氧反應(yīng)的信號(hào)傳遞過(guò)程[6]。熱休克蛋白 70(heat shock protein 70,HSP70)是熱休克蛋白家族中含量最多、表達(dá)最高的應(yīng)激蛋白之一，普遍存在于哺乳類動(dòng)物、植物和微生物內(nèi)，是生物進(jìn)化中高度保守的多肽蛋白，人體組織在病理情況下(缺氧、缺血、損傷和感染等)可導(dǎo)致 HSP70 的過(guò)表達(dá)[7]。研究[8-9]顯示：HSP70 的表達(dá)具有 HIF-1α 依賴性；在低氧條件下，HIF-1α 通過(guò)調(diào)節(jié)熱休克因子1的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而提高 HSP70的表達(dá)水平[10]。關(guān)于妊高征患者胎盤組織中HIF-1α和HSP70表達(dá)均有相關(guān)的研究[11-12]，但有關(guān)兩者表達(dá)關(guān)系及其臨床意義少見報(bào)道，因此本研究通過(guò)收集妊高征患者的胎盤組織，將其制成石蠟切片，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)HIF-1α和HSP70的表達(dá)情況，分析二者的表達(dá)關(guān)系，探討其在妊高征中的臨床意義。

1　資料與方法

1.1 研究對(duì)象收集2015年1月-2016年6月海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科的40例胎盤組織標(biāo)本，其中妊高征患者22例(妊高征組)，年齡為26～44歲，孕周35～39周；正常孕婦18例(對(duì)照組)，年齡為23～37歲，孕周37～41周。妊高征的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考謝幸等[4]主編的《婦產(chǎn)科學(xué)》(第8版) ，所有病例均排除內(nèi)科并發(fā)癥及其他產(chǎn)科并發(fā)癥。均為單胎。

1.2主要試劑和儀器兔單克隆抗體HIF-1α和HSP70購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑PV-6001(山羊抗兔IgG/HRP聚合物)和DAB顯色試劑盒均為購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。組織脫水機(jī)(STP120)和石蠟包埋機(jī)(Histocentre 3) 均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，手動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(RM2235)購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

1.3切片制備所有研究對(duì)象產(chǎn)后取1.5 cm×1.0 cm×0.5 cm胎盤組織，避開鈣化、出血和梗死區(qū)，用4℃生理鹽水沖洗血污，置于10% 的中性甲醛中固定 24 h，常規(guī)脫水、包埋，制成5 μm的石蠟切片，用黏附載玻片進(jìn)行撈片，置于56℃干燥箱烤片。

1.4免疫組織化學(xué)方法二甲苯脫蠟2次，100%、90%和80%乙醇梯度水化，蒸餾水浸泡，PBS浸泡，微波修復(fù)抗原20 min，自然冷卻后置于3%H2O2溶液以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，PBS洗3次，加正常山羊血清封閉10 min，滴加兔單克隆抗體(HIF-1α或HSP70)置濕盒內(nèi)4℃中孵育過(guò)夜，PBS洗3次，滴加PV-6001孵育20 min，PBS洗3次，DAB顯色，鏡下觀察顯色結(jié)果，適時(shí)終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，80%、90%、100%乙醇梯度脫水，晾干、二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.5結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)HIF-1α陽(yáng)性為滋養(yǎng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色的顆粒，HSP70陽(yáng)性為滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色的顆粒。顯微鏡高倍鏡(×400)下隨機(jī)取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100細(xì)胞，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分，其中染色強(qiáng)度：未著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞百分比：≤5%為0分，6%～25%為1分， 26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。兩者分值相乘作為每一例的積分，積分≤3分為陰性(-)，>3分為陽(yáng)性(+)[13]。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2組研究對(duì)象胎盤組織中HIF-1α和HSP70陽(yáng)性表達(dá)率比較采用χ2檢驗(yàn)，HIF-1α和HSP70表達(dá)的相關(guān)關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1一般情況與對(duì)照組比較，妊高征組患者的孕周減少，收縮壓和舒張壓上升，胎兒質(zhì)量下降(P<0.05)，而年齡和胎盤質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)。見表1。

表1對(duì)照組和妊高征組研究對(duì)象的一般情況

GroupnAge(year)Gestationalage(week)Systolicpressure(P/mmHg)Diastolicpressure(P/mmHg)Birthweight(m/g)Placentalweight(m/g)Control1831．8±4．338．7±1．0114．6±8．872．9±4．23116．4±556．2525．0±98．1PIH2234．3±5．237．0±1．0163．2±19．397．4±15．72414．2±678．3465．7±113．7t1．6245．1119．8636．4203．5250．385P0．1130．0010．0010．0010．0010．090

2.22組研究對(duì)象胎盤組織中HIF-1α和HSP70的表達(dá)HIF-1α陽(yáng)性染色呈棕黃色顆粒，表達(dá)于滋養(yǎng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，主要表達(dá)于細(xì)胞核；HSP70陽(yáng)性染色呈棕黃色顆粒，表達(dá)于滋養(yǎng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。見圖1(插頁(yè)七)。

2.32組研究對(duì)象胎盤組織中HIF-1α和HSP70的陽(yáng)性表達(dá)率及二者相關(guān)性妊高征組患者和對(duì)照組孕婦胎盤組織HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率分別為81.8%和38.9%； HSP70陽(yáng)性表達(dá)率分別為95.5%和55.6%。妊高征組患者胎盤組織HIF-1α和HSP70的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于對(duì)照組(χ2=7.785,P<0.05;χ2=6.599,P<0.05)。見表2和3。妊高征組患者胎盤組織中HIF-1α和HSP70的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.671,P=0.001)。見表4。

表2對(duì)照組和妊高征組研究對(duì)象胎盤組織中HIF-1α表達(dá)

Tab.2Expressions of HIF-1α in placenta tissue of subjects in control group and PIH group[n(η/%)]

*P<0.05 compared with control group.

表3對(duì)照組和妊高征組研究對(duì)象胎盤組織中HSP70表達(dá)

Tab.3Expressions of HSP70 in placenta tissue of subjects in control group and PIH group[n(η/%)]

*P<0.05 compared with control group.

表4妊高征組患者胎盤組織中HIF-1α和HSP70表達(dá)的相關(guān)性

Tab.4 Correlation between HIF-1α and HSP70 expressions in placenta tissue of patients in PIH group[n(η/%)]

r= 0.671,P=0.001.

3　討　論

HIF-1廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體體內(nèi)，是一種與缺氧密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子[14]。有文獻(xiàn)[15]顯示：HIF-1以異源二聚體為主要的存在形式，由α亞基(HIF-1α)和β亞基(HIF-1β)構(gòu)成。HIF-1α和HIF-1β同屬于Bhlh-PAS轉(zhuǎn)錄因子家族，其中HIF-1α具有多個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域，可直接或間接與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物反應(yīng)影響基因轉(zhuǎn)錄，是HIF-1轉(zhuǎn)錄活性的主要調(diào)節(jié)單位[16-17]，在妊高征中HIF-1α可多途徑影響滋養(yǎng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞功能，使胎盤、蛻膜生理性血管重鑄障礙; 并妨礙內(nèi)皮細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞損傷的再修復(fù)，加劇妊高征的病情進(jìn)展。熱休克蛋白(HSP)是生物受到環(huán)境中某些因素刺激時(shí)發(fā)生應(yīng)激反映而合成的蛋白質(zhì)，是一類廣泛存在于生物體內(nèi)高度保守的蛋白質(zhì)[18]。HSP70是在熱誘導(dǎo)下合成的一組具有高度保守性的蛋白質(zhì)，具有分子伴侶和細(xì)胞保護(hù)等功能[19]，妊高征患者胎盤缺血缺氧，導(dǎo)致活性氧的生成增加，HSP70能夠保護(hù)細(xì)胞，防止應(yīng)激因子所致的蛋白質(zhì)損傷，啟動(dòng)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，發(fā)揮抗損傷的應(yīng)激保護(hù)效應(yīng)。本研究采用免疫組織化學(xué)法對(duì)胎盤組織中HIF-1α和HSP70蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：妊高征患者胎盤組織中HIF-1α和HSP70的表達(dá)明顯升高，這與其他的研究[11-12]結(jié)果一致，同時(shí)HIF-1α和HSP70的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。說(shuō)明妊高征患者胎盤組織缺氧導(dǎo)致HIF-1α呈高表達(dá)，能夠改善局部組織對(duì)缺氧的耐受，但可以增強(qiáng)內(nèi)皮素-1的表達(dá)活性，引起血管痙攣，導(dǎo)致血壓升高，還能調(diào)控p53[20]、 Bcl-2[21]和VEGF[22]的表達(dá)，從而引起滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡和血管內(nèi)皮損傷，刺激 HSP70的產(chǎn)生，起到抗細(xì)胞凋亡和保護(hù)血管內(nèi)皮的作用，在妊高征的發(fā)生過(guò)程可以抵抗缺氧引起的氧化應(yīng)激一系列反應(yīng)，但其兩者的作用機(jī)制以及在妊高征中起到的具體作用需進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Lydakis C,Beevers M,Beevers DG,et al. The prevalence of pre-eclampsia and obstetric outcome in pregnancies of normotensive and hypertensive women attending a hospital specialist clinic [J]. Int J Clin Pract,2001,55(6): 361-367.

[2] Hiett AK,Brown HL,Britton KA.Outcome of infants delivered between 24 and 28 weeks’ gestation in women with severe pre-eclampsia [J].J Matern Fetal Med,2001,10(5): 301-304.

[3] Bansal YP.Pre-eclampsia/eclampsia: a profile from Pumwani Maternity Hospital,Nairobi,Kenya [J].East Afr Med J,1985,62(10):691-698.

[4] 謝幸,茍文麗.婦產(chǎn)科學(xué)[M].8版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:64-66.

[5] 朱丹,劉玉萍,蔡知天,等.多普勒超聲檢測(cè)妊高征患者母體循環(huán)血流動(dòng)力學(xué)對(duì)圍產(chǎn)兒結(jié)局的診斷價(jià)值[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2005,31(3):442-445.

[6] Bracken CP,Whitelaw ML,Peet DJ.The hypoxia-inducible factors: key transcriptional regulators of hypoxic responses [J].Cell Mol Life Sci,2003,60(7):1376-1393.

[7] Silver JT,Noble EG.Regulation of survival gene hsp70 [J].Cell Stress Chaperones,2012,17(1):1-9.

[8] Yeh CH,Hsu SP,Yang CC,et al. Hypoxic preconditioning reinforces HIF-alpha-dependent HSP70 signaling to reduce ischemic renal failure-induced renal tubular apoptosis and autophagy [J].Life Sci,2010,86(3/4): 115-123.

[9] Huang WJ,Xia LM,Zhu F,et al.Transcriptional upregulation of HSP70-2 by HIF-1 in cancer cells in response to hypoxia [J].Int J Cancer,2009,124(2): 298-305.

[10]Baird NA,Turnbull DW,Johnson EA.Induction of the heat shock pathway during hypoxia requires regulation of heat shock factor hypoxia-inducible factor-1[J].J Biol Chem,2006,281(50): 38675-38681.

[11]王瑩,陶潛,魯曉燕,等.妊娠高血壓綜合征孕婦胎盤組織中血紅素氧合酶-1缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)及臨床意義[J].山西醫(yī)藥雜志,2017,46(18): 2242-2244.

[12]林培紅,胡繼芬.子癇前期患者胎盤組織中HSP70和NF-κB的表達(dá)及意義[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2016,13(2):61-64.

[13]高新雅,張偉杰,崔黎,等.TM4SF1在乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2017,43(6): 1186-1192.

[14]Wenger RH,Gassman M.Oxygen(es) and the hypoxia induced factor-1 [J].Biol Chem,1997,378(7): 609-616.

[15]云芬,賈永峰,韓昭,等.HIF-2α在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及其與微血管密度、Ki67和GST-π的關(guān)系[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2016,42(5):954-957.

[16]Schumacker PT.Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) [J].Crit Care Med,2005,33(12 Suppl): S423-S425.

[17]李芳,關(guān)文霞,任飛,等.Sirt-1和Hif-1α在慢性阻塞性肺疾病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)及其意義[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2015,41(2):356-361.

[18]Deniset JF,Pierce GN.Heat Shock Proteins: Mediators of Atherosclerotic Development [J].Curr Drug Targets,2015,16(8):816-826.

[19]Bruemmer-Smith S,Stüber F,Schroeder S.Protective functions of intracellular heat-shock protein (HSP) 70-expression in patients with severe sepsis [J].Intensive Care Med,2001,27(12):1835-1841.

[20]肖娜,高艷,敖祥生,等.膠質(zhì)瘤p53、PTEN和IDH與HIF-1α的相關(guān)性[J].生命科學(xué),2017,29(8): 753-757.

[21]鮑合剛,肖亮,孟剛,等.涎腺腺樣囊性癌中HIF-1α和BCL-2的表達(dá)及意義[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2017(7):728-732.

[22]王淑貞,王秋紅.HIF-1α和VEGF在子宮內(nèi)膜癌中的臨床表達(dá)及相關(guān)性[J].實(shí)用癌癥雜志,2017,32(4):536-538.