人抑癌基因p53與PTEN的CRISPR-Cas9導(dǎo)向RNA靶點(diǎn)篩選與效率驗(yàn)證

許文舒，胡　正，楊永廣，王曉丹

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)院/免疫學(xué)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130061)

與正常細(xì)胞比較，癌細(xì)胞無(wú)限增殖、轉(zhuǎn)化并易轉(zhuǎn)移的特征嚴(yán)重威脅人體的健康與生存。而在癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與產(chǎn)生過(guò)程中，往往伴隨著原癌基因或抑癌基因的突變或異常。腫瘤抑制基因p53是抑癌基因家族中至關(guān)重要的一員，惡性腫瘤中半數(shù)以上可檢測(cè)到該基因突變，其編碼的正常P53蛋白作為檢驗(yàn)點(diǎn)調(diào)控細(xì)胞周期，監(jiān)察細(xì)胞狀態(tài)，進(jìn)而在細(xì)胞基因損傷或變異時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、修復(fù)及凋亡的發(fā)生。p53已廣泛應(yīng)用于結(jié)直腸癌、胃癌和肝癌等常見惡性腫瘤的形成機(jī)制探索及診療中[1-2]。抑癌基因PTEN的突變同樣會(huì)導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生。該基因編碼的磷酸酶蛋白PTEN的作用與P53相似，能夠通過(guò)細(xì)胞周期對(duì)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)控，防止細(xì)胞生長(zhǎng)分裂過(guò)速，同時(shí)發(fā)揮抑制細(xì)胞遷移及血管生發(fā)等功能以減緩癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與擴(kuò)散[3]。因此，在原代細(xì)胞中如能同時(shí)對(duì)p53與PTEN這對(duì)關(guān)鍵抑癌基因進(jìn)行敲除性突變將會(huì)有效誘導(dǎo)原代細(xì)胞癌變。規(guī)律性成簇的間隔短回文重復(fù)序列結(jié)合核酸酶系統(tǒng)(CRISPR-Cas9)是一種細(xì)菌和古生菌中抵御外源病毒或質(zhì)粒入侵的獲得性免疫系統(tǒng)。來(lái)源于外源病毒或質(zhì)粒序列片段的導(dǎo)向RNA(single-guide RNA，sgRNA)可介導(dǎo)Cas9特異性識(shí)別相應(yīng)病原DNA分子并進(jìn)行雙鏈切割，保護(hù)細(xì)菌及古生菌自身。2013年，人們開始利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)的這一特性在哺乳動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)了特定靶基因的定點(diǎn)編輯，開啟了基因編輯的新紀(jì)元[4-7]。

利用基因編輯途徑構(gòu)建的腫瘤動(dòng)物模型與其他腫瘤誘導(dǎo)模型相比更接近正常病程的發(fā)生與發(fā)展，為藥物及治療方法的探索提供了更為適合的研究對(duì)象[8-11]。此前已有報(bào)道通過(guò)尾靜脈高壓注射將表達(dá)小鼠p53和PTEN的sgRNA與Cas9質(zhì)粒注射至小鼠體內(nèi)，成功誘導(dǎo)小鼠肝臟原位腫瘤發(fā)生[12-13]。本研究設(shè)計(jì)靶向人p53及PTEN基因的sgRNA序列，并在體外檢測(cè)其誘導(dǎo)相應(yīng)基因特異位點(diǎn)突變的效果，為將原代細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及在重建人肝臟的人源化小鼠中建立人自發(fā)肝臟腫瘤模型提供腫瘤誘導(dǎo)工具。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑和儀器

Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞和pEASY-Blunt zero cloning kit(中國(guó)北京全式金公司)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和Opti-MEM (美國(guó)Gibco公司)，SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(中國(guó)上海 生工公司)，Annealing Buffer(中國(guó)上海 碧云天公司)，轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司)，基因提取試劑盒(美國(guó) Axygen公司)，PCR所需試劑(日本TaKaRa公司)，200 bp Marker(中國(guó)北京Tiangen公司)，凝膠回收試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)，CRISPR-Cas9 載體pL-CRISPR.EFS.GFP (美國(guó)Addgene公司)。FasrtDigest Esp3I kit和微型離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)，微量移液器(美國(guó)RAININ公司)，PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO RAD公司)。

1.2p53/PTEN sgRNA-pL-CRISPR.EFS.GFP質(zhì)粒構(gòu)建

1.2.1獲得用于構(gòu)建sgRNA表達(dá)質(zhì)粒的引物將靶基因外顯子序列輸入在線工具(http://tools.genome-engineering.org)，結(jié)合所得靶序列在外顯子中的位置及其可能存在的脫靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)，初選出2組PTEN 靶序列：PTEN-1，5′-TTATCCAAACATTATTGCTA-3′；PTEN-2，5′-ACCGCCAAATTTAATTGCAG-3′。其褪火引物分別為 PTEN sg1 Forward:5′-CACCGTTATCCAAACATTATTGCTA-3′，PTEN sg1 Reverse:5′ -AAACTAGCAATAATGTTTGGA-

TAAC-3′；PTEN sg2 Forward: 5′-CACCGACCGCCAAA TTTAATTGCAG-3′， PTEN sg2 Reverse: 5′-AAACCTGCAATTAAATTTGGCGGTC-3′2組p53靶序列如下：p53-1，5′-TCGACGCTAGGATCTGACTG-3′；p53-2，5′-CGTCGAGCCCCCTCTGAGTC-3′。其褪火引物分別為 p53 sg1 Forward:5′-CACCGTCGACGC-

TAGGATCTGACTG-3′， p53 sg1 Reverse:5′-AAACCAGTCAGATCCTAGCGTCGAC-3′； p53 sg2 Forward: 5′-CACCGCGTCGAGCCCCCTCTGAGTC-3′，p53 sg2 Reverse: 5′-AAACGACTCAGAGGGGGCTCGACGC-3′。

1.2.2獲取sgRNA插入片段并將其與CRISPR質(zhì)粒載體連接將sgRNA引物經(jīng)褪火-稀釋-連接至Esp3Ⅰ酶切并膠回收的pL-CRISPR.EFS.GFP質(zhì)粒載體上。褪火：20 μL褪火體系包含 正義鏈引物 5 μL(200 μmol·L-1)，反義鏈引物5 μL(200 μmol·L-1)，Annealing Buffer 2 μL，ddH2O 8 μL。褪火步驟：95℃，4 min；0.1℃·s-1， -1.5℃每個(gè)循環(huán)，48個(gè)循環(huán)；22℃、∞。稀釋：取2 μL褪火產(chǎn)物，加98 μL ddH2O混勻；再取2 μL與20 μL Annealing Buffer和178 μL ddH2O混勻。連接：20 μL連接反應(yīng)體系包含10× T4 ligase buffer 2 μL，Esp3Ⅰ酶切回收的CRISPR載體 10 ng，T4 ligase 1 μL，褪火產(chǎn)物 1 μL(5 nmol·L-1)，ddH2O 補(bǔ)足20 μL?；靹蚝?6℃連接過(guò)夜。

1.2.3連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化加連接產(chǎn)物于50 μL Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞(在感受態(tài)細(xì)胞剛剛解凍時(shí)加入連接產(chǎn)物)中，輕彈混勻，冰浴20～30 min。42℃水浴熱激30 s，立即置于冰上2 min；加600 μL常溫的無(wú)抗性LB培養(yǎng)基，200 r·min-1、37℃培養(yǎng)1 h；菌液1 500× g離心1 min，棄掉上清部分，保留100～150 μL，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板(Amp抗性)，37℃ 培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.4提取并鑒定sgRNA-Cas9共表達(dá)質(zhì)粒取3 mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，8 000× g 離心2 min 收集菌體，棄盡培養(yǎng)基；在沉淀中加入250 μL Buffer P1，徹底懸浮菌體；加入250 μL Buffer P2，立即溫和顛倒EP管5～10次混勻。室溫靜置2～4 min；加入350 μL Buffer P3 立即溫和顛倒EP管5～10次混勻；12 000× g 離心5～10 min。將上清液移入吸附柱，8 000× g 離心30 s，倒掉收集管中液體；加入500 μL Buffer DW1， 9 000× g離心30 s，倒掉收集管中液體；加入500 μL Wash Solution ，9 000× g離心30 s，倒掉收集管中液體；重復(fù)上一步驟；空吸附柱于9 000× g離心1 min；將吸附柱放入一個(gè)干凈的1.5 mL EP管中，在吸附膜中央加入30～60 μL ddH2O，室溫靜置1 min后，離心1 min，-20℃保存管中DNA溶液。通過(guò)DNA測(cè)序鑒定sgRNA是否成功連接進(jìn)入質(zhì)粒載體，選擇連接正確質(zhì)粒大量提取，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

1.3sgRNA-Cas9共表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染

于6孔板中培養(yǎng)293T細(xì)胞，待其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且每孔細(xì)胞覆蓋率至80%左右時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并于實(shí)驗(yàn)前一天換無(wú)雙抗DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜；用微量移液器吸取0.3 mL Opti-MEM 與5 μL Lipofectamine 2000于1.5 mL EP管中混勻，另取0.3 mL Opti-MEM與2 μg sgRNA 質(zhì)粒于另一1.5 mL EP管中混勻，二者于室溫下靜置5 min后加入同一EP管混勻再在室溫下靜置20 min；小心吸去6孔板中293T細(xì)胞原有的培養(yǎng)基，貼壁輕輕加入上一步的混合液，并于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h；6 h后，吸出6孔板中液體并加2 mL DMEM完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)；24 h后采用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白(green fluoresence protein，GFP)表達(dá)情況并拍照，GPF陽(yáng)性細(xì)胞即為成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞；將培養(yǎng)基吸出后進(jìn)行細(xì)胞分選，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分選前后GFP陽(yáng)性細(xì)胞在總細(xì)胞中所占比例，將分選獲得的GFP陽(yáng)性細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞擴(kuò)增到一定數(shù)量后部分凍存，剩余細(xì)胞提基因組DNA。

1.4基因組DNA提取

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組[野生型(wild type, WT)細(xì)胞]和實(shí)驗(yàn)組。分別提取2組細(xì)胞的基因組DNA：用2 mL EP管收集含2×106個(gè)細(xì)胞的懸浮液，2 000× g離心5 min，棄盡上清，并用350 μL PBS重懸；加0.8 μL RNase A，漩渦震蕩15 s，室溫靜置1 min；加入150 μL Buffer C-L和8 μL Proteinase K，立即漩渦振蕩1 min混合均勻，短暫離心后，將EP管置于56℃水浴10 min；加入350 μL Buffer P-D，漩渦振蕩30 s混合均勻，12 000× g離心10 min；將DNA制備管置于2 mL EP管中，將上一步的混合液上清移至制備管中，12 000× g離心1 min；棄濾液，將制備管置回到原來(lái)的2 mL EP管中，加入500 μL Buffer W1，12 000× g離心1 min；棄濾液，將制備管置回到原來(lái)的2 mL EP管中，加入700 μL Buffer W2，12 000× g離心1 min，以同樣的方法，用700 μL Buffer W2再洗滌1次；棄濾液，將制備管置回原來(lái)的2 mL EP管中，12 000× g離心1 min；將DNA制備管置于另一潔凈的1.5 mL EP管中，在制備管膜中央加100 μL去離子水，室溫靜置1 min，12 000× g離心1 min洗脫DNA。產(chǎn)物-20℃保存，并作為下一步的PCR模板。

1.5包含突變位點(diǎn)的基因組片段PCR擴(kuò)增

50 μL PCR體系：5×buffer 10 μL，dNTP 4 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，Primestar 1 μL，模板 3 μL，ddH2O 30 μL。 其中PTEN-1靶點(diǎn)效率檢測(cè)上游引物： 5′-GCCAGCTCTTAAATCTGACTTC-3′，下游引物：5′-CTGAAGTCCATTAGGTACGGT-3′，PCR產(chǎn)物理論長(zhǎng)度為667 bp；PTEN-2靶點(diǎn)效率檢測(cè)上游引物：5′-GAAAAAGGTGATCGTTGGCT-3′，下游引物：5′-GAAAAAGGTGATCGTTGGCT-3′，PCR產(chǎn)物理論長(zhǎng)度為947 bp；p53-1， 2靶點(diǎn)效率檢測(cè)上游引物：5′-GAAGAGAGAATGTGAA-3′，下游引物：5′-CATTCTGGGAGCTTCATCTG-3′，PCR產(chǎn)物理論長(zhǎng)度為612 bp。PCR反應(yīng)條件： 98℃、30 s，98℃、15 s，60℃、10 s，72℃、1 min 10 s，34個(gè)循環(huán)后72℃、10 min。PCR結(jié)束后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，110 V、30 min，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察PCR產(chǎn)物片段條帶。

1.6膠回收

用干凈的手術(shù)刀片從瓊脂糖凝膠中切下DNA片段，注意去除多余的凝膠塊；稱質(zhì)量后每100 μg凝膠中加入300 μL緩沖液QG，50℃加熱約10 min，直至凝膠完全溶解；向樣品中加入與凝膠等體積的異丙醇并混合；將樣品加到收集柱中，再放到收集管內(nèi)，17 900× g 離心1 min；棄濾液，加500 μL QG， 17 900× g 離心1 min；棄濾液，加750 μL 緩沖液PE，17 900× g 離心1 min；棄濾液并17 900× g 空轉(zhuǎn)離心1 min；將收集柱放入干凈的1.5 mL EP管中，加30 μL ddH2O，室溫靜置1 min，17 900× g 洗脫離心1 min；濾液-20℃保存。

1.7待測(cè)序回收產(chǎn)物克隆與突變效率檢測(cè)

5 μL反應(yīng)體系：PCR Product 20 ng，pEASY-Blunt Zero Cloning Vector 1 μL，ddH2O補(bǔ)足5 μL，25℃反應(yīng)30 min(PCR儀控溫)。利用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，單克隆培養(yǎng)8～16 h后挑單克隆，每個(gè)單克隆加3 mL Amp抗性LB培養(yǎng)基200 r·min-1、37℃培養(yǎng)過(guò)夜，并對(duì)菌液進(jìn)行DNA測(cè)序。以未經(jīng)轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞的基因序列為標(biāo)準(zhǔn)序列，通過(guò)統(tǒng)計(jì)測(cè)序結(jié)果中突變序列數(shù)量與全部送檢樣品數(shù)量比率來(lái)確定sgRNA誘導(dǎo)基因突變的效率。

2　結(jié)　果

2.1p53/PTEN sgRNA靶點(diǎn)

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢p53及PTEN基因的各個(gè)亞型mRNA，選擇各基因mRNA亞型剪輯的共同外顯子區(qū)域，將該區(qū)域序列輸入在線工具(http://tools.genome-engineering.org)獲得推薦靶點(diǎn)及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)，選擇針對(duì)p53及PTEN基因的CRISPR-Cas9 sgRNA靶點(diǎn)各2個(gè)：p53-1、p53-2、PTEN-1和PTEN-2。見表1。

表1p53/PTEN基因的sgRNA靶點(diǎn)位置和評(píng)分

TargetnameTargetlocusScoreNumberoftargetsitesPTEN?1PTENexon241　346(14areingenes)PTEN?2PTENexon474　104(8areingenes)p53?1p53exon291　33(2areingenes)p53?2p53exon275　79(15areingenes)

2.2共表達(dá)sgRNA與Cas9-P2A-GFP的CRISPR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

利用Lipofectamine 2000將共表達(dá)sgRNA與Cas9-P2A-GFP的CRISPR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞內(nèi)，24～48 h內(nèi)通過(guò)熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)分析均發(fā)現(xiàn)了3%GFP表達(dá)，證明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，并通過(guò)流式分選對(duì)表達(dá)GFP轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞進(jìn)行純化。見圖1和2(插頁(yè)二)。與分選前的熒光比率(4%)比較，分選后熒光比率升高至82%(P<0.05)，成功富集了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功的293T細(xì)胞。

圖1　質(zhì)粒轉(zhuǎn)染流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果

2.3待檢測(cè)序列的純化

采用PCR法對(duì)含有突變區(qū)域的基因片段進(jìn)行大量擴(kuò)增，并利用電泳膠回收的方式對(duì)PCR產(chǎn)物片段進(jìn)行純化，避免非特異性擴(kuò)增的片段對(duì)下一步測(cè)序產(chǎn)生干擾，其中p53擴(kuò)增片段理論長(zhǎng)度均為612 bp，而包含PTEN-1突變位點(diǎn)的擴(kuò)增片段理論長(zhǎng)度為667 bp，包含PTEN-2突變位點(diǎn)的擴(kuò)增片段理論長(zhǎng)度為947 bp。凝膠電泳結(jié)果顯示：成功獲得了預(yù)期大小的擴(kuò)增片段。見圖3。

2.4基因突變情況的驗(yàn)證

將膠回收產(chǎn)物與空載體進(jìn)行連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序，將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組野生型基因序列進(jìn)行對(duì)比，確定sgRNA質(zhì)粒能否對(duì)基因進(jìn)行成功編輯及編輯效率。見圖4。通過(guò)計(jì)算測(cè)序結(jié)果中突變序列數(shù)量與全部送檢數(shù)量比率，可以得出靶序列p53-1、p53-2和PTEN-2誘導(dǎo)的突變效率分別為54.5%、45.5%和33.3%。

A : p53 sgRNA plasmid transfected cells. M: 200 bp marker; Lane 1: p53 wt group; Lane 2: p53-1 sgRNA plasmid transfected group; Lane 3: p53-2 sgRNA plasmid transfected group. B: PTEN sgRNA plasmid transfected cells. M: 200 bp marker; Lane 1: PTEN-2 sgRNA plasmid transfected group; Lane 2: PTEN-1 sgRNA plasmid transfected group; Lane 3: PTEN-2 wt group; Lane 4: PTEN-1 wt group.

圖3 PCR產(chǎn)物電泳圖

Fig.3Electrophoregram of PCR products

A: PTEN-2 sgRNA; B: p53-1 sgRNA; C: p53-2 sgRNA. Wt: Wild type.╈ indicated the mutated sequences.

2.5實(shí)驗(yàn)流程模式圖

對(duì)實(shí)驗(yàn)整體設(shè)計(jì)思路及流程進(jìn)行總結(jié)(圖5)，將實(shí)驗(yàn)分為兩大部分，上游sgRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)與克隆構(gòu)建作為步驟1(sgRNA設(shè)計(jì)與質(zhì)粒構(gòu)建)，下游細(xì)胞操作與基因編輯功能驗(yàn)證部分作為步驟2(質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與細(xì)胞分選及基因編輯效率分析)。

圖5　基因編輯效率的獲取方案示意圖

3　討　論

構(gòu)建誘發(fā)式腫瘤模型的傳統(tǒng)方法主要分為物理方法(如射線輻照)、化學(xué)方法(化學(xué)致癌物)和生物學(xué)方法(病毒感染、腫瘤細(xì)胞接種等)。但其中大部分方法效率較低、時(shí)程較長(zhǎng)，且難以模擬正常情況下人體自發(fā)形成腫瘤、免疫系統(tǒng)隨之產(chǎn)生應(yīng)答的相互作用過(guò)程。

基因編輯技術(shù)是一種通過(guò)程式化的重組核酸酶對(duì)DNA序列進(jìn)行改造的基因操作技術(shù)，通過(guò)核酸內(nèi)切酶對(duì)序列的靶向定位，對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行識(shí)別與切割，產(chǎn)生雙鏈斷裂，在機(jī)體DNA損傷的非同源重組修復(fù)過(guò)程中，有很高概率發(fā)生核苷酸的插入或缺失，當(dāng)插入或刪除堿基數(shù)不為3的整數(shù)倍時(shí)，將導(dǎo)致修復(fù)后的基因發(fā)生移碼突變，引起基因功能喪失，獲得基因敲除的效果[14-15]。

目前，較為主流的基因編輯技術(shù)主要包括ZFN技術(shù)、TALEN技術(shù)及近年來(lái)發(fā)展迅猛的CRISPR-Cas9技術(shù)。CRISPR-Cas9系統(tǒng)的主要功能元件包括sgRNA和Cas9核酸內(nèi)切酶。與前2種技術(shù)相比，CRISPR-Cas9簡(jiǎn)單、高效，且可以通過(guò)導(dǎo)入多個(gè)sgRNA的方法同時(shí)進(jìn)行多靶點(diǎn)的編輯，因此本文作者選擇CRISPR-Cas9技術(shù)進(jìn)行p53與PTEN抑癌基因的編輯，以便應(yīng)用于后期這2個(gè)基因在原代細(xì)胞乃至動(dòng)物模型中的同時(shí)編輯性敲除[16-17]。

腫瘤的發(fā)生開端往往始于體內(nèi)細(xì)胞增殖異常。究其根源，抑癌基因被抑制或突變是其中的重要因素。p53和PTEN是人體抑癌基因家族中至關(guān)重要的成員，廣泛表達(dá)于全身不同組織器官，在阻滯細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方面有重要作用。其作用方式是通過(guò)編碼表達(dá)相關(guān)蛋白，或者直接參與代謝，或者通過(guò)影響信號(hào)通路等過(guò)程調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理代謝途徑，達(dá)到抑制腫瘤發(fā)生的作用。在腫瘤形成后p53和PTEN還會(huì)進(jìn)一步阻止細(xì)胞遷移及血管生成，最終達(dá)到阻礙腫瘤發(fā)展的目的。因而當(dāng)這2個(gè)基因同時(shí)缺失或抑制時(shí)，可以高效地誘導(dǎo)細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化[18-21]。本研究針對(duì)這2個(gè)基因設(shè)計(jì)并選擇了sgRNA對(duì)其進(jìn)行特異性編輯，以期獲得p53和PTEN協(xié)同性功能缺失型突變乃至移碼突變型敲除，為在細(xì)胞水平及活體水平建立腫瘤誘導(dǎo)模型提供工具[22-23]。

本研究以選擇p53及PTEN存在的多個(gè)亞型的共同外顯子為原則進(jìn)行軟件分析，選擇基于脫靶位點(diǎn)的評(píng)分?jǐn)?shù)較高的sgRNA靶點(diǎn)。在sgRNA設(shè)計(jì)選擇過(guò)程中，由于基因組DNA在生物體內(nèi)的復(fù)雜折疊狀態(tài)以及核小體蛋白復(fù)合物的遮蔽，軟件基于脫靶位點(diǎn)的評(píng)分高低并不能代表靶點(diǎn)在生物體內(nèi)的實(shí)際切割效率，因而需要進(jìn)行前期體外工作來(lái)確定所選擇的靶點(diǎn)能夠介導(dǎo)Cas9執(zhí)行基因編輯的實(shí)際效率。這也是本研究的主要工作內(nèi)容。

具體操作中，切割pL-CRISPR.EFS.GFP質(zhì)粒使其線性化，該質(zhì)粒的sgRNA克隆位點(diǎn)兩側(cè)為一對(duì)Esp3Ⅰ內(nèi)切酶，該酶切割位點(diǎn)在其識(shí)別位點(diǎn)的下游因而成對(duì)使用時(shí)可以產(chǎn)生不易導(dǎo)致質(zhì)粒自連的黏性末端，通過(guò)合成sgRNA序列引物并褪火，可以獲得具有同樣黏性末端的sgRNA序列DNA雙鏈并連接，挑取克隆測(cè)序，選擇正確插入sgRNA的pL-CRISPR.EFS.GFP質(zhì)粒。隨后采用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000把測(cè)序鑒定過(guò)的p53/PTEN sgRNA-Cas9系統(tǒng)導(dǎo)入293T細(xì)胞，利用Cas9質(zhì)粒表達(dá)GFP的特性進(jìn)行分選富集，獲得成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取基因組，并以包含突變區(qū)域的序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)片段純化后通過(guò)測(cè)序方式與對(duì)照組野生型序列進(jìn)行對(duì)比來(lái)確定所選sgRNA靶點(diǎn)對(duì)基因靶向編輯的效果。

對(duì)于CRISPR-Cas9系統(tǒng)，基因組上靶序列毗鄰序列需為NGG，即前間區(qū)序列毗鄰基序PAM，而Cas9的理論切割位點(diǎn)位于PAM前3位堿基對(duì)間。根據(jù)序列對(duì)比結(jié)果分析，野生型對(duì)照組靶位點(diǎn)PAM周圍序列與NCBI網(wǎng)站基因庫(kù)提供的標(biāo)準(zhǔn)序列一致，而p53-1、p53-2和PTEN-2實(shí)驗(yàn)組靶位點(diǎn)PAM周圍序列在預(yù)期切割位點(diǎn)(PAM-3位)出現(xiàn)了較大量的突變，說(shuō)明它們能夠有效介導(dǎo)Cas9進(jìn)行p53及PTEN基因的位點(diǎn)特異性編輯，同時(shí)發(fā)現(xiàn)堿基缺失占突變的大部分，只有少數(shù)發(fā)生了堿基插入。

通過(guò)以上一系列體外實(shí)驗(yàn)，本文作者確定了能介導(dǎo)Cas9對(duì)p53和PTEN基因進(jìn)行有效編輯的sgRNA序列并建立了方案，通過(guò)分選初步富集發(fā)生了基因編輯的細(xì)胞，為進(jìn)一步研究p53/PTEN基因突變細(xì)胞成瘤性奠定了基礎(chǔ)。有效sgRNA序列的確定也為在原代細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及人源化鼠中人原位腫瘤模型的構(gòu)建完成了部分前期工作。

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