腺病毒介導的“睡美人”轉座子與IL-10共表達對NOD小鼠Th17/Treg細胞平衡的影響

龐春艷,王　慧,王志華,馮秀媛,王永福

(1.包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院風濕免疫科 包頭醫(yī)學院風濕免疫研究所,內蒙古 包頭 014010;2.內蒙古自治區(qū)自體免疫學重點實驗室,內蒙古 包頭 014010)

干燥綜合征(Sj?gren’s syndrome，SS)是一種以淋巴細胞浸潤為特征的自身免疫性疾病，由于外分泌腺分泌減少，臨床上主要表現(xiàn)為口、眼干燥等癥狀，?？衫奂岸鄠€臟器。但目前對于SS確切的發(fā)病機制尚不清楚。非肥胖糖尿病(non-obese diabetes，NOD)小鼠可自發(fā)地出現(xiàn)外分泌腺淋巴細胞的浸潤，血清中可檢測到多種自身抗體和炎性細胞因子，如抗SSA抗體、抗SSB抗體、抗M3R抗體、白細胞介素17(IL-17)和白細胞介素23(IL-23)等，進而出現(xiàn)相應的分泌功能減弱[1]，與人類的SS癥狀極其相似。因此，NOD小鼠是目前公認的SS動物模型。國內外研究[2-3]顯示：SS患者血清中白細胞介素10(IL-10)的表達水平較健康對照者下降，提示SS患者IL-10表達水平較低。房星星等[4]研究人臍帶間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)對SS患者CD4+T細胞增殖的影響發(fā)現(xiàn)：MSCs通過促分泌轉化生長因子β1(TGF-β1)、白細胞介素16(IL-6)和IL-10從而抑制SS患者CD4+T細胞的活化增殖。Heoa等[5]研究發(fā)現(xiàn)：IL-10可以抑制Th17細胞的活化，誘導Treg細胞比例的增加，提示IL-10作為一種抗炎因子，對自身免疫性疾病起重要的治療作用。因此，IL-10可能是治療SS的靶點。

“睡美人”(sleeping beauty，SB)轉座系統(tǒng)屬于Tcl/mariner轉座子家族，是第一個應用于高等哺乳動物細胞相關研究的轉座子，是目前所知的在脊椎動物中轉座效率最高的轉座系統(tǒng)。SB轉座系統(tǒng)在轉基因、基因治療和基因標簽等方面均具有十分廣闊的應用前景[6]。本研究將IL-10基因和轉座子序列整合到腺病毒載體以及含有轉座酶的腺病毒載體共同感染C57BL6小鼠脾細胞，將攜帶腺病毒載體的脾細胞種植到NOD小鼠皮下，觀察種植脾細胞后NOD小鼠脾細胞中CD4+IL-10+、CD4+IFN-γ+、Th17和Treg的變化以及Th1/Th2和Th17/Treg的平衡，為IL-10對SS的治療機制研究提供新的思路。

1　材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑和儀器NOD小鼠購自南京大學-南京生物醫(yī)藥研究院，動物合格證號：201705875。兔抗小鼠的APC標記的IL-10、PE標記的IFN-γ、PE標記的IL-17A、FITC標記的CD4、PE 標記的CD25和APC標記的FOXP3一抗購自美國Abcam公司，Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG購自美國Oregon公司，ELSIA試劑盒購自武漢新啟迪生物科技有限公司。流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2含有IL-10基因的腺病毒載體的構建化學合成轉座子、IL-10和轉座酶的序列，轉座子和IL-10序列插入同一腺病毒穿梭質粒，IL-10序列位于轉座子序列的中間，轉座酶插入另一個腺病毒穿梭質粒，將上述2個腺病毒穿梭質粒分別與包裝質粒共轉染HEK293細胞，通過Cre/loxP重組酶系統(tǒng)的作用實現(xiàn)重組，產生重組腺病毒。成功構建含有IL-10基因的腺病毒載體和轉座酶的腺病毒載體。同時構建不含IL-10只含有轉座子的腺病毒載體和無轉座酶的腺病毒載體作為陰性對照。上述腺病毒載體由上海吉凱基因公司構建。經測序發(fā)現(xiàn)插入的序列準確無誤，每個病毒的滴度均為：1×1011PFU·mL-1。

1.3腺病毒載體感染C57BL6小鼠脾細胞實驗分為對照組、空載體組和治療組。含有IL-10基因和轉座子的腺病毒載體與含有轉座酶的腺病毒載體共同感染治療組中的C57BL6小鼠脾細胞；只含有轉座子的腺病毒載體和無轉座酶的陰性腺病毒載體共同感染空載體組的C57BL6小鼠脾細胞；對照組C57BL6小鼠脾細胞不做任何處理。將上述3組細胞處理48 h后收集，PBS洗滌2次，采用Trizol提取RNA，RT-PCR法檢測各組小鼠脾細胞中IL-10 mRNA表達水平，計算2-ΔΔCt，每組3個復空，重復5次。ΔCt=目的基因Ct值-內參基因Ct值，ΔΔCt=實驗組Ct值-對照組Ct值。

1.4NOD小鼠皮下種植C57BL6小鼠脾細胞將上述3組細胞處理48 h后收集，PBS洗滌2次，100 μL PBS重懸細胞沉淀，分別注射于對照組、空載體組和治療組NOD小鼠右后腿的腘窩皮下，每組6只小鼠，每周1次，共6次。

1.5ELISA法檢測NOD小鼠血清中IL-10表達水平注射后4周處死NOD小鼠，心臟采血，離心分離血清，-80℃保存，ELISA法檢測NOD小鼠血清中IL-10表達水平。步驟如下：分別將100 μL標本和不同濃度的標準品加入孔中，37℃孵育90 min，洗板3次；加抗體工作液100 μL，37℃孵育60 min，洗板3次；加酶結合物工作液100 μL，37℃孵育30 min，洗板5次；然后加100 μLTMB顯色液，37℃孵育10～20 min；最后加100 μL終止液，450 nm檢測吸光度(A)值。根據(jù)標準品的濃度值和A值繪制標準曲線，再根據(jù)標準曲線計算血清中IL-10表達水平。

1.6NOD小鼠脾細胞中CD4+IL-10+、CD4+IFN-γ+、Th17和Treg細胞比例注射后4周處死NOD小鼠，無菌條件下取NOD小鼠脾臟，PBS洗滌3次，注射器研磨，細胞篩過濾，1 500 r·min-1離心10 min，紅細胞裂解液裂解10 min，1 200 r·min-1離心6 min，RPMI-1640懸細胞沉淀。將細胞懸液移至細胞培養(yǎng)皿中，加5 mL含10%FCS的完全培養(yǎng)基RPMI-1640，5%CO2、37℃培養(yǎng)。加PMA、ionomycin和monensin培養(yǎng)4 h，收集細胞，100 μL的Flow Staining Buffer 懸細胞，每一個檢測項目分6管，1管不加任何抗體，另外5管加0.125 μg anti-mouse CD4抗體，檢測Treg時再加0.06 μg 的CD25抗體，4℃避光孵育30 min；加預冷的Flow Cytometry Staining Buffer 1 000 r·min-1離心5 min，加1 mL新鮮配制的Fixation/Permeabilization工作液，4℃避光孵育30 min；Permeabilization buffer洗滌細胞2次，在已加抗體的其中4管中分別加0.5 μg的anti-mouse FoxP3、anti-mouse IL-17A、anti-mouse IL-10和anti-mouse IFN gamma抗體，4℃避光孵育30 min；Permeabilization buffer洗滌細胞2次，F(xiàn)low Cytometry Staining Buffer懸細胞沉淀，流式細胞儀檢測。

2　結　果

2.1C57BL6小鼠脾細胞中IL-10 mRNA表達水平腺病毒載體共同感染C57BL6小鼠脾細胞48 h，治療組脾細胞中IL-10 mRNA的2-ΔΔct為24.10±9.96，空載體組為2.18±2.53，對照組為1.00±0.00；治療組IL-10 mRNA表達水平，高于對照組和空載體組(F=72.71，P<0.01)。

2.2各組NOD小鼠血清中IL-10表達水平注射結束后4周處死NOD小鼠，對照組、空載體組和治療組IL-10表達水平分別為(173.04±103.14)、(175.00±222.21)和(559.07±200.02)ng·L-1，治療組NOD小鼠血清中IL-10表達水平明顯高于對照組和空載體組(F=8.89，P=0.003)。

2.3各組NOD小鼠脾細胞中CD4+IL-10+細胞和CD4+IFN-γ+細胞比例治療組CD4+IL-10+細胞比例明顯高于對照組和空載體組(F=72.09，P<0.05)。CD4+IFN-γ+細胞比例3組間比較差異無統(tǒng)計學意義(F=2.72，P>0.05)。治療組中IFN-γ+/IL-10+細胞比值明顯低于對照組和空載體組(F=23.50，P<0.05)。見表1。

2.2各組NOD小鼠脾細胞中Th17細胞和Treg細胞比例治療組NOD小鼠脾細胞中Th17比例(12.33±0.71)明顯低于對照組(16.40±2.19)和空載體組(15.93±1.29)(F=6.39，P<0.05)；治療組Treg細胞比例(2.13±0.25)明顯高于對照組(1.33±0.25)和空載體組(1.40±0.10)(F=12.98，P<0.05)。見圖1。

表1各組NOD小鼠脾細胞中CD4+IL-10+和CD4+IFN-γ+細胞比例及IFN-γ+/IL-10+細胞比值

GroupCD4+IL?10+CD4+IFN?γ+IFN?γ+/IL?10+Control6．03±0．6114．77±1．122．48±0．43Emptyvector6．63±0．8715．27±0．712．57±0．44Therapy17．63±2．11?△13．30±1．30?△0．76±0．14?△

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with empty vector group.

圖1　各組NOD小鼠脾細胞中Th17細胞(A)和Treg細胞(B)比例

2.3各組NOD小鼠脾細胞中Th17/Treg比值治療組Th17/Treg細胞比值為5.82±0.34，與對照組(12.39±0.92)和空載體組(11.46±1.71)比較明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(F=29.33，P<0.05)。

3　討　論

SS是一種常見的自身免疫性疾病，常有口干、眼干等癥狀。研究[7-8]發(fā)現(xiàn)：IL-10是一種抗炎因子，在炎癥性疾病和自身免疫性疾病中具有重要的保護作用。Verhenne 等[9]將SB100X系統(tǒng)尾靜脈注射ADAMTS13-/-小鼠發(fā)現(xiàn)：ADAMTS13可以持續(xù)高表達25周，穩(wěn)定表達ADAMTS13的小鼠未出現(xiàn)嚴重的血小板減少或器官損傷，提示SB轉座子介導的治療方法可作為血小板減少性紫癜的基因治療方法，說明SB轉座子系統(tǒng)可作為治療SS的一種手段。

Inoue 等[10]研究發(fā)現(xiàn)：白藜蘆醇可以增加NOD小鼠唾液腺中IL-10的表達，從而對SS的唾液腺功能的失調起到治療作用。因此，本研究將含有IL-10和SB轉座子系統(tǒng)感染C57BL6小鼠脾細胞，再將這些脾細胞注射到NOD小鼠的右后腿的腋窩下，體內外檢測均發(fā)現(xiàn)IL-10表達水平明顯升高，提示SB轉座子系統(tǒng)不論在體外還是體內均可以高效表達IL-10，從而為IL-10治療SS的作用機制研究提供理論依據(jù)。

Th1和Th2細胞及其比值的失衡在SS的發(fā)病中起重要的作用。Wu等[11]研究白芍總苷(TGP)治療SS的分子機制結果發(fā)現(xiàn)：將SS的動物模型小鼠分為對照組、羥氯喹(HCQ)組、TGP組和聯(lián)合(TGP+ HCQ)組，對照組IFN-γ、IL-4、Fas和FasL水平明顯高于其他3組；此外，與HCQ組比較，聯(lián)合組上述4種因子表達水平降低。與對照組比較，TGP組和聯(lián)合組IFN-γ和IL-4比值下降。上述結果表明：TGP可以通過影響Th1/Th2細胞因子平衡，同時降低IFN-γ、IL-4、Fas和FasL表達水平，從而起到治療SS的作用。本研究結果顯示：含有IL-10的SB轉座子系統(tǒng)可以使NOD小鼠脾細胞中CD4+IL-10+細胞比例明顯升高，而CD4+IFN-γ+細胞略有下降，IFN-γ+/IL-10+比值明顯下降，提示含有IL-10 的SB轉座子系統(tǒng)可以平衡Th1和Th2細胞的比值，進而對SS起到治療作用。

Th17和Treg細胞及其分泌的細胞因子在自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用。Nanke等[12]檢測了15例SS患者唾液腺組織中IFN-γ+細胞和IL-17+細胞比例的結果發(fā)現(xiàn)：SS患者唾液腺組織中可以檢測到上述細胞的表達，提示Th1/Th17在SS的病理過程中起重要的作用。多項研究[13-14]表明：SS患者淚液中IL-17表達水平升高，與淚膜破裂時間(tear film breakup time，TBUT)和基礎淚液分泌實驗(Schirmer Ⅰ test)有密切關聯(lián)，提示IL-17參與了具有干眼癥的SS患者的發(fā)病過程。Lin等[15]采用唾液腺蛋白免疫野生型小鼠可出現(xiàn)SS的典型癥狀，在唾液腺的淋巴細胞病灶中可檢測Th17細胞的增加，免疫IL-17基因敲除的小鼠則不會出現(xiàn)SS的癥狀，過繼免疫Th17細胞后IL-17基因敲除的小鼠則會出現(xiàn)SS的典型癥狀，唾液的分泌明顯下降，血清中出現(xiàn)自身抗體，進而出現(xiàn)明顯的炎癥反應和組織損傷。Szodoray等[16]檢測了51例未分化結締組織病(undifferentiated connective tissue disease，UCTD)患者外周血Th17和Treg細胞分布的結果發(fā)現(xiàn)：與對照組比較，UCTD組Th17細胞增加，若最終發(fā)展為系統(tǒng)性自身免疫性疾病(systemic autoimmune diseases，SAIDs)時，Th17細胞的比例進一步增加。從對照到UCTD患者Th17/Treg比值逐漸升高，如發(fā)展為SAID患者將會出現(xiàn)最高值。Th17/Treg的失衡可能有助于疾病進展，因此Th17/Treg可以作為評估預后的指標。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)：環(huán)孢素(Cys A)能抑制Th17細胞的表達，提示Cys A可以治療SS和其他自身免疫性疾病。本研究結果顯示：含有IL-10的SB轉座子系統(tǒng)可以降低NOD小鼠脾細胞中Th17細胞比例，升高Treg細胞比例，明顯降低Th17/Treg比值，提示含有IL-10 的SB轉座子系統(tǒng)可以通過調節(jié)Th17和Treg細胞比例及其平衡，從而對SS起到一定的治療作用。

綜上所述，通過SB轉座子系統(tǒng)在體內體外均可以高表達IL-10。IL-10高表達后NOD小鼠脾細胞中CD4+IL-10+細胞比例明顯升高，CD4+IFN-γ+細胞下降，IFN-γ+/IL-10+比值明顯下降，Th17細胞比例下降，Treg細胞比例上升，Th1/Th2和Th17/Treg比值明顯下降，提示含有IL-10 的SB轉座子系統(tǒng)可以通過調節(jié)Th1、Th2、Th17和Treg細胞比例以及逆轉Th1/Th2和Th17/Treg平衡對SS起到一定的治療作用。

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