CFW熒光染色法在甲真菌病診斷中的應(yīng)用研究

岳學(xué)蘋(píng) 石秀艷 陳偉 萬(wàn)喆 李若瑜 王愛(ài)平 李清

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院皮膚性病科，北京 100050；2.北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科 北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心，北京 100034)

甲真菌病 (onychomycosis)是由皮膚癬菌、酵母菌和其他霉菌所致的甲疾病。流行率[1]在歐洲、東亞、北美分別達(dá)到23%、20%和14%。傳統(tǒng)的診斷方法包括10%KOH (potassium hydroxide)溶液濕片法鏡檢和真菌培養(yǎng)。KOH法[2-5]雖然快速、經(jīng)濟(jì)、高效，陽(yáng)性率也較高，但鏡下視野難以辨別真菌和角質(zhì)細(xì)胞，且查找費(fèi)時(shí)，對(duì)技術(shù)員的技術(shù)水平要求較高。真菌培養(yǎng)雖然特異性高，且可以鑒定菌種，但陽(yáng)性率較低。其他檢查方法包括甲碎片或病甲活檢組織的PAS染色[2,6]、PCR[3]和熒光染色[7-9]等。但PAS和PCR在臨床的普及率更低。熒光染色法非常簡(jiǎn)單快速，常用的熒光試劑為CFW (Calcofluor white)，以往報(bào)道多應(yīng)用于真菌性角膜炎[10-11]的診斷，陽(yáng)性率較高。個(gè)別報(bào)道將其應(yīng)用在甲真菌病的診斷中[7-8]，且該方法目前已逐步在臨床推廣應(yīng)用。本研究采用新開(kāi)發(fā)上市的CFW熒光試劑，通過(guò)與KOH法、真菌培養(yǎng)對(duì)比，探討CFW熒光染色法在診斷甲真菌病方面是否有優(yōu)越性，并比較其鏡下特點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

選擇2016年3月1日～7月1日就診于北京天壇醫(yī)院和北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科門(mén)診的擬診為甲真菌病的患者。本實(shí)驗(yàn)獲得北京天壇醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)前患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑和儀器

CFW熒光液 (立特晰，合肥華今生物科技有限公司，主要成分KOH+CFW+Evens blue)。熒光顯微鏡 (Olympus，CX23LEDRFSIC，340～360 nm紫外光源，普通光源)。ImageAnalysis軟件。

1.3 方法

病甲先拍照，同一病甲同時(shí)取3份甲下或甲表面碎屑，分別進(jìn)行KOH濕片法、真菌培養(yǎng)、CFW熒光染色法檢測(cè)真菌。并記錄KOH法和CFW法的制片時(shí)間和第一次找到真菌的時(shí)間。進(jìn)行CFW染色時(shí)，碎屑放置在載玻片上，滴1滴CFW熒光液，0.5 min后蓋上蓋玻片，必要時(shí)濾去多余染液，用酒精燈加熱數(shù)秒，然后應(yīng)用熒光光源觀察。對(duì)同一患者CFW染色下，同一視野分別在熒光和普通光源下拍照，比較CFW和KOH鏡下的特點(diǎn)和區(qū)別。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過(guò)SPSS V21 (IBM SPSS Statistics,USA)軟件統(tǒng)計(jì)三種方法的真菌檢測(cè)陽(yáng)性率，應(yīng)用McNemar檢驗(yàn)分別比較CFW和KOH、CFW和培養(yǎng)的陽(yáng)性率。另外，以KOH法作為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算CFW法的敏感性、特異性，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值 (positive predictive value,PPV)和陰性預(yù)測(cè)值 (negative predictive value,NPV)。

2 結(jié) 果

入組100例臨床擬診的甲真菌病患者共100例病甲標(biāo)本，男56例，女44例；年齡3～86歲；指甲26例，趾甲74例。100例樣本中，3種方法中至少有一種陽(yáng)性的69例。每一種檢查方法的陽(yáng)性率分別為CFW 64% (64/100)，KOH 63% (63/100)，培養(yǎng)31% (31/100)(見(jiàn)圖1)。三種方法全部陽(yáng)性29% (29/100)，全部陰性31% (31/100)。KOH陽(yáng)性而CFW陰性5例，反之，KOH陰性而CFW陽(yáng)性6例。CFW法與KOH法的陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，CFW與真菌培養(yǎng)陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)。以KOH法為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算得出CFW的敏感性、特異性、PPV和NPV分別為92.06%、83.78%、90.3%和86.11%。

在制片時(shí)間上，KOH法為2.5 min，最先觀察到菌絲時(shí)間上為1～5 min。CFW法分別為0.5 min和1～2 min。CFW法顯微鏡下所見(jiàn)菌絲呈藍(lán)色，背景角質(zhì)細(xì)胞淡染，二者對(duì)比明顯，但由于很多菌絲位于不同平面，鏡下成像清晰度一般。KOH法鏡下菌絲呈高折光性，平行排列。顏色上與背景的角質(zhì)細(xì)胞很難區(qū)分，鏡下成像清晰度更差。圖2顯示了CFW染色下同一顯微鏡視野不同光源的結(jié)果。二者均可觀察到長(zhǎng)短不等的菌絲，分隔、分支明顯，或筆直或纏繞或折疊或呈串珠狀排列。部分可以觀察到假菌絲和孢子，但CFW法紫外光源下觀察到的菌絲或孢子明顯比KOH下清晰，容易辨認(rèn)。

3 討 論

甲真菌病常用的診斷方法包括KOH濕片法真菌鏡檢和真菌培養(yǎng)。以往文獻(xiàn)的報(bào)道[2-5]顯示在韓國(guó)、希臘、伊朗、阿根廷對(duì)臨床懷疑甲真菌病的患者KOH鏡檢的陽(yáng)性率分別為55.9% (93例)、15.1% (418例)、56.4% (140例)和61% (5 961例)；真菌培養(yǎng)的陽(yáng)性率分別為29.4%、10.5%、25%和45.3%。本研究顯示KOH和培養(yǎng)的陽(yáng)性率分別為63%和31%，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果類似[2，4,8]，培養(yǎng)結(jié)果略低于文獻(xiàn)報(bào)道[5]。

本研究在這兩種檢測(cè)方法之外，增加了CFW熒光染色法，陽(yáng)性率為63%，與KOH法類似，但與培養(yǎng)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果類似[7-8]。Bonifaz等[7]比較了KOH、培養(yǎng)和CFW的陽(yáng)性率分別為66.67%、33.33%和57.58%。Weinberg等[8]評(píng)估了應(yīng)用KOH、真菌培養(yǎng)、PAS和CFW共4種方法檢測(cè)105個(gè)懷疑甲真菌病患者的陽(yáng)性率，結(jié)果顯示，共93例至少一種方法陽(yáng)性，分別為KOH 60%、PAS 74%、CFW 72%、培養(yǎng)48%。

圖1擬診甲真菌病患者3種不同診斷方法的陽(yáng)性率和陰性率圖23個(gè)甲真菌病患者 (A，B，C)CFW染色下同一顯微鏡視野在普通光源 (A1，B1，C1)和紫外光源 (A2，B2，C2)下菌絲的對(duì)比結(jié)果。顯示CFW下紫外光源下的菌絲或孢子明顯比普通光源下更清晰、容易識(shí)別 (A,B.×200;C.×400)

Fig.1Positive and negative results of three different diagnostic methods in patients with suspected onychomycosisFig.2The microscopic images of the same field under normal light (A1,B1,C1) and ultraviolet light (A2,B2,C2) in CFW stain with three different onychomycosis (A,B,C).The hyphae and spores were more clear and obvious in ultraviolet light (A,B.×200; C.×400)

本研究以KOH法為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算得出CFW法的敏感性、特異性、PPV和NPV分別為92.06%、83.78%、90.3%和86.11%。Haldane等[12]報(bào)道CFW法在淺表真菌感染中的敏感性為92%、特異性95%、PPV 74%、NPV 99%，與我們的結(jié)果類似。但Haldane等以培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，在培養(yǎng)陽(yáng)性病例中，確定CFW的敏感性和特異性，而我們以KOH法為金標(biāo)準(zhǔn)，二者計(jì)算方法不同。

本研究的結(jié)果顯示，從制片時(shí)間上，CFW染色需0.5 min，KOH法需要2.5 min左右。而識(shí)別真菌效率上，CFW法大多在1～2 min能迅速找到真菌，KOH卻需要1～5 min。因此CFW染色法簡(jiǎn)單、方便、快速，鏡下容易快速識(shí)別真菌。以往的CFW熒光染色法報(bào)道中，Gupta等[9]需要15～20 min；Bonifaz等[7]應(yīng)用CFW時(shí)需要先后滴加多種溶媒、固定、靜置10 min才能檢測(cè)；Zhang等[11]滴KOH，蓋蓋玻片后，需要在邊緣滴加1滴CFW，用濾紙從另一邊緣吸引染料，并靜置2 min后觀察。這些都增加了制片時(shí)間，且操作的便捷性較差。本研究的熒光試劑同時(shí)混合了KOH+CFW+EB，染色0.5 min后即可觀察。相比上述方法大大縮短制片時(shí)間。鏡下觀察時(shí)，即使KOH對(duì)角質(zhì)細(xì)胞溶解不佳，由于CFW對(duì)真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的高度敏感性和結(jié)合特異性，也可迅速準(zhǔn)確地找到真菌，且真菌與角質(zhì)細(xì)胞很容易區(qū)分；而KOH下真菌與角質(zhì)細(xì)胞顏色接近，有時(shí)溶解欠佳時(shí)，很難區(qū)分。CFW染色下同一視野不同光源下的結(jié)果，也證明了CFW下的真菌比KOH下更清楚，更易識(shí)別，大大加速了真菌的識(shí)別速度。所以，CFW法可以明顯提高真菌識(shí)別率，縮短制片和診斷時(shí)間，不易漏診，這是CFW染色法的最大優(yōu)勢(shì)。

因此，本研究中，盡管CFW熒光染色法與KOH濕片法相比并未明顯提高診斷陽(yáng)性率，但CFW熒光染色法仍是一種制片簡(jiǎn)單、方便、快速，真菌識(shí)別率高的診斷方法，可以提高實(shí)驗(yàn)室的診斷準(zhǔn)確性和效率。

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