電針對(duì)失神經(jīng)大鼠骨骼肌自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響

吳夢(mèng)佳，唐成林，趙丹丹，羅翱，安薈羽，譚程方，邱麗

1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶市400016；2.中醫(yī)藥防治代謝性疾病重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市400016

周圍神經(jīng)損傷后，失神經(jīng)支配的骨骼肌發(fā)生快速萎縮，肌蛋白分解率增加，骨骼肌質(zhì)量迅速下降，極大影響骨骼肌功能的維持和恢復(fù)[1]。失神經(jīng)骨骼肌萎縮發(fā)生時(shí)，自噬相關(guān)基因活性升高[2]。自噬-溶酶體系統(tǒng)通過(guò)調(diào)控骨骼肌細(xì)胞的代謝和穩(wěn)態(tài)，對(duì)維持骨骼肌質(zhì)量的穩(wěn)定發(fā)揮重要作用[3]。臨床研究表明，針灸對(duì)骨骼肌萎縮的治療效果顯著[4]；電針能有效延緩失神經(jīng)大鼠骨骼肌萎縮，但其具體機(jī)制仍有待明確[5]。本課題組前期研究表明，電針能通過(guò)上調(diào)失神經(jīng)肌萎縮大鼠模型中胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)的表達(dá)、下調(diào)肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin)的表達(dá)，促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖[6]；并上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)caspase-3等凋亡相關(guān)因子的表達(dá)[7]，從而延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮。本研究觀察電針對(duì)失坐骨神經(jīng)大鼠腓腸肌中自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene,Atg)表達(dá)的影響，從肌萎縮后自噬活性水平的角度，探討電針延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

8周齡清潔級(jí)健康雄性Sprague-Dawley大鼠21只，體質(zhì)量270～290 g，重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(渝)2012-0002。飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房。

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，將大鼠編1～21號(hào)，使用計(jì)算機(jī)自動(dòng)生成21個(gè)兩位數(shù)隨機(jī)數(shù)字，每個(gè)編號(hào)對(duì)應(yīng)一個(gè)隨機(jī)數(shù)字，將隨機(jī)數(shù)字從小到大依次排列序號(hào)，其中序號(hào)1～7為假手術(shù)組，8～14為模型組，15～21為電針組。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物處置均按照重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2 主要試劑與儀器

Trizol總RNA提取試劑盒、RR037A逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq TMII、ULK1、Atg13、Beclin1、Atg14、Atg7、Atg12、Atg5、Atg16L1、GAPDH引物合成：TAKARA公司。

SDZ-Ⅱ型電子針治療儀：蘇州醫(yī)療用品有限公司。漢醫(yī)牌無(wú)菌針灸針：北京漢醫(yī)醫(yī)療器械中心。柔軟型實(shí)驗(yàn)大鼠固定器：溫州原上草醫(yī)療科技有限公司。AL204型電子天平：瑞士METTLER TOLEDO公司。低溫高速離心機(jī)：日本SIGMA公司。Thermo ND 2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀：上海GENE公司。CFX PCR檢測(cè)系統(tǒng)、T100TMPCR儀：美國(guó)BIO RAD公司。CellSens Standard圖像采集軟件、BX53普通正置顯微鏡：日本OLYMPUS公司。

1.3 造模方法

制備切斷大鼠坐骨神經(jīng)腓腸肌萎縮模型[8]。大鼠4%水合氯醛8 ml/kg腹腔注射麻醉，俯臥固定于手術(shù)臺(tái)，無(wú)菌條件下右后肢手術(shù)區(qū)備皮。于大鼠右后肢坐骨結(jié)節(jié)下緣外側(cè)切口6～8 mm，玻璃分針沿肌肉走向鈍性分離肌肉與筋膜，找到并暴露坐骨神經(jīng)；取中段切斷，造成1.0 mm神經(jīng)缺損。逐層縫合肌肉與皮膚，清潔傷口。

假手術(shù)組只暴露神經(jīng)，不行坐骨神經(jīng)截?cái)嘈g(shù)。

1.4 電針干預(yù)

造模1 d后，用大鼠固定器[9]固定電針組大鼠，選右側(cè)足三里、環(huán)跳穴[10]，使用直徑0.25 mm、長(zhǎng)13 mm針灸針，直刺5～7 mm；接電針儀，正極連接足三里，負(fù)極連接環(huán)跳，連續(xù)波，強(qiáng)度1.0 mA，頻率2 Hz，以大鼠下肢稍震動(dòng)為宜，每次10 min，每天1次，每周6次，連續(xù)干預(yù)8周。

假手術(shù)組和模型組每天同法固定，但不進(jìn)行電針干預(yù)。

1.5 標(biāo)本采集

各組大鼠于造模后8周取材。大鼠4%水合氯醛8 ml/kg腹腔注射麻醉，無(wú)菌條件下完整剝離雙側(cè)腓腸肌，去除多余肌腱頭，PBS冷??；吸干表面殘留液體。術(shù)側(cè)腓腸肌組織分為兩份，一份快速修剪后置4%多聚甲醛中固定，用于形態(tài)學(xué)檢測(cè)；一份錫箔紙包裹，放入液氮罐中速凍，-80℃冰箱保存待測(cè)。

1.6 檢測(cè)方法

1.6.1 腓腸肌濕重比

大體觀察雙側(cè)腓腸肌大小。觀察后迅速完整剝離雙側(cè)腓腸肌，將多余血管及神經(jīng)清除，于電子天平上稱取肌濕重，以健側(cè)作為對(duì)照，計(jì)算腓腸肌濕重比。

1.6.2 腓腸肌纖維截面積及直徑

腓腸肌4%多聚甲醛固定后，蔗糖梯度脫水3 d，OTC包埋，制備厚8 μm冰凍切片。晾干，行HE染色，過(guò)二甲苯溶液2次，每次5 min；梯度乙醇浸泡4次，每次2 min，清水沖洗2 min；蘇木素染色2 min，沖洗；浸于分化液中40 s，沖洗；伊紅染色80 s，沖洗；梯度乙醇浸泡2次，每次2 min；二甲苯溶液浸泡4 min；樹(shù)膠封片，晾干。200倍光學(xué)顯微鏡下觀察切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算腓腸肌纖維截面積和直徑。

1.6.3 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)

腓腸肌組織樣本約50 mg，提取組織上清，將Trizol液加入管中，剪碎組織，充分勻漿，離心，提取總RNA；異丙醇沉淀后離心，75%乙醇清洗3次后晾干，加入無(wú)酶水待檢。清洗超微量核酸蛋白測(cè)定儀探頭3次，記錄總RNA 260/230和260/280值，計(jì)算稀釋比例。-20℃取出SYBR Green，按說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，合成反應(yīng)體系，設(shè)置反應(yīng)條件行逆轉(zhuǎn)錄：37℃15 min，85℃5 s，4℃+∞。加樣，標(biāo)板后上機(jī)行定量聚合酶鏈反應(yīng)。使用CFX Manager 3.1軟件讀取Ct值，計(jì)算2-△△Ct。上下游引物序列見(jiàn)表1。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用(xˉ±s)表示，采用單因素方差分析；方差齊時(shí)，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 腓腸肌濕重比

與假手術(shù)組相比，模型組和電針組術(shù)側(cè)腓腸肌濕重比顯著降低(p＜0.001)，電針組高于模型組(p＜0.05)。見(jiàn)表2。

2.2 形態(tài)學(xué)

假手術(shù)組肌纖維邊緣規(guī)則，形態(tài)正常；模型組肌纖維縮小，邊緣不規(guī)則；電針組較模型組肌纖維大且邊緣較規(guī)則。見(jiàn)圖1。與假手術(shù)組相比，模型組和電針組術(shù)側(cè)腓腸肌纖維截面積和直徑顯著降低(p＜0.001)，電針組顯著高于模型組(p＜0.001)。見(jiàn)表2。

表1 待測(cè)基因引物序列

2.3 聚合酶鏈反應(yīng)

與假手術(shù)組相比，模型組術(shù)側(cè)腓腸肌ULK1、Atg13、 Beclin1、 Atg14、 Atg7、 Atg12、 Atg5 和Atg16L1 mRNA表達(dá)顯著升高(p＜0.001)；與模型組相比，電針組以上mRNA表達(dá)量均下降(p＜0.05)。見(jiàn)表3。

3 討論

根據(jù)靶器官肌肉損傷后的臨床特征，失神經(jīng)骨骼肌萎縮屬傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)“痿癥”范疇，主要表現(xiàn)為肌肉瘦削、酸困且痿軟無(wú)力[11]。據(jù)“治痿獨(dú)取陽(yáng)明”的理論，選取足陽(yáng)明胃經(jīng)合穴足三里穴，以強(qiáng)筋健骨，補(bǔ)益氣血；局部取足少陽(yáng)膽經(jīng)環(huán)跳穴，以通經(jīng)活絡(luò)，便利腰腿。尚畫(huà)雨等[12]發(fā)現(xiàn)，針刺大鼠腓腸肌可有效下調(diào)大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后腓腸肌中Pink1和Parkin的表達(dá)，抑制線粒體自噬過(guò)度激活，減輕骨骼肌損傷，促進(jìn)修復(fù)。提示電針延緩骨骼肌萎縮的治療作用可能與調(diào)節(jié)骨骼肌細(xì)胞自噬活性有關(guān)。

圖1 大鼠術(shù)側(cè)腓腸肌纖維病理學(xué)改變(HE染色，bar=100 μm)

表3 各組大鼠自噬相關(guān)基因表達(dá)比較(2-△△Ct)

自噬-溶酶體系統(tǒng)是控制骨骼肌蛋白質(zhì)代謝的重要途徑之一[13]，在肌肉體積控制及維持細(xì)胞自身穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[14]。自噬過(guò)程大致分為4個(gè)階段：自噬誘導(dǎo)、自噬體形成、自噬溶酶體形成和內(nèi)容物降解；自噬相關(guān)基因參與細(xì)胞自噬的全過(guò)程，發(fā)揮著重要作用[15]。ULK1是酵母Atg1在哺乳動(dòng)物的同源基因，與調(diào)節(jié)成分Atg13共同構(gòu)成復(fù)合物，增強(qiáng)Atg13穩(wěn)定性，在自噬誘導(dǎo)階段起關(guān)鍵作用[16]。Beclin1是酵母Atg6在哺乳動(dòng)物的同源基因，與調(diào)節(jié)成分Atg14等參與小囊泡形成，其表達(dá)強(qiáng)度與自噬活性密切相關(guān)[17]。Atg5和Atg12是影響自噬體泛素樣蛋白修飾的重要基因[18]，其形成的復(fù)合體在自噬體膜的延伸過(guò)程中發(fā)揮重要作用，促使自噬小體不斷形成。Atg7是輔助自噬體伸展擴(kuò)張的重要基因。在自噬體形成期，Atg7通過(guò)水解ATP獲能，進(jìn)而激活A(yù)tg12，在Atg10的催化下，Atg12與Atg5結(jié)合，進(jìn)而募集Atg16L1形成多聚復(fù)合體，有利于自噬體的伸展擴(kuò)張[19]，促進(jìn)自噬活性增強(qiáng)。

李妍等[20]在慢性阻塞性肺疾病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，在萎縮的骨骼肌組織中，F(xiàn)oxO轉(zhuǎn)錄因子及自噬相關(guān)因子Beclin1、Atg5、Bnip3等升高，自噬-溶酶體系統(tǒng)被激活，骨骼肌萎縮加重；敲除小鼠Atg7以抑制自噬，也出現(xiàn)肌力下降、肌肉萎縮，并沒(méi)有出現(xiàn)維持肌肉穩(wěn)態(tài)的結(jié)果[21]；而Laminin-2自噬缺陷小鼠出現(xiàn)肌萎縮和營(yíng)養(yǎng)不良等癥狀，卻是由于自噬過(guò)度激活所致[22]。有研究表明[23]，胰島素缺乏的糖尿病大鼠骨骼肌中哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)受到抑制，F(xiàn)oxO3被激活，導(dǎo)致自噬過(guò)度激活，骨骼肌發(fā)生萎縮，肌肉流失。耐力運(yùn)動(dòng)可以激活mTOR，降低自噬水平，減輕自噬過(guò)度激活，從而減少蛋白質(zhì)等的過(guò)度降解，維持骨骼肌穩(wěn)態(tài)[24]。Liu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，KLHL20可以通過(guò)調(diào)控ULK1和Vps34復(fù)合物的代謝，控制自噬的終結(jié)，防止因過(guò)度自噬引起的肌肉損失。Sato等[26]發(fā)現(xiàn)，賴氨酸可減少C2C12肌管細(xì)胞中肌纖維蛋白的降解，延緩肌肉萎縮，其機(jī)制可能是通過(guò)激活mTOR，抑制自噬溶酶體系統(tǒng)活性的過(guò)表達(dá)。以上研究提示，自噬水平的高低與骨骼肌細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持緊密相關(guān)，不足或過(guò)度的自噬都不利于骨骼肌健康，自噬過(guò)程的關(guān)閉和防止自噬過(guò)度激活，對(duì)保持肌肉結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)，防治肌肉萎縮意義重大。

臨床治療時(shí)，由于不能及時(shí)到找適合的神經(jīng)供體進(jìn)行移植，等待手術(shù)的過(guò)程往往又比較漫長(zhǎng)，不可逆的失神經(jīng)肌萎縮將得以持續(xù)。維持骨骼肌細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，保持其相對(duì)活性，延緩骨骼肌萎縮是進(jìn)行神經(jīng)移植手術(shù)，提高移植后骨骼肌適應(yīng)性的關(guān)鍵。本研究表明，失坐骨神經(jīng)8周后，大鼠腓腸肌中自噬相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，自噬活性增強(qiáng)；電針干預(yù)后自噬活性下降，骨骼肌萎縮減輕。這一結(jié)果與其他研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)手針、運(yùn)動(dòng)、藥物等干預(yù)方式的研究結(jié)果一致[12,24-25]，可為臨床進(jìn)行神經(jīng)移植術(shù)、提高神經(jīng)移植后骨骼肌功能恢復(fù)，爭(zhēng)取寶貴的治療時(shí)間。

自噬作為一種自我調(diào)節(jié)機(jī)制，在機(jī)體中發(fā)揮著“雙刃劍”的作用[27]。針灸具有調(diào)節(jié)陰陽(yáng)平衡的作用。在失神經(jīng)1周和4周時(shí)，電針可通過(guò)上調(diào)自噬相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)坐骨神經(jīng)修復(fù)[28]。因此，在較長(zhǎng)時(shí)間失神經(jīng)過(guò)程中，自噬對(duì)于萎縮骨骼肌的具體影響，以及電針如何對(duì)其進(jìn)行調(diào)控以延緩失神經(jīng)肌萎縮的具體機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究說(shuō)明。

綜上所述，我們推測(cè)，電針延緩大鼠失神經(jīng)骨骼肌萎縮的機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控自噬相關(guān)基因的表達(dá)，影響肌萎縮的自噬活性，抑制自噬水平過(guò)度激活，從而維持肌細(xì)胞穩(wěn)態(tài)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

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