ELISA法測定雞肉和蝦肉中阿維菌素類藥物的殘留

程 茹，吳玉娥，陳吉香，謝體波，李 平，何方洋，張 凱，吳紫潔，鐘新敏，袁光宇

(貴州勤邦食品安全科學技術有限公司，貴州貴陽 550009)

阿維菌素類藥物是由放線菌產生的一組大環(huán)內酯類抗生素，其對線蟲、體外節(jié)肢動物有較強的驅殺作用，是目前應用最廣泛的抗寄生蟲類藥物[1-5]。但是此類藥物的脂溶性較高，且具有神經毒性和發(fā)育毒素，在動物體內經過長時間的停留，會對動物機體產生巨大傷害，因此，其被WHO列為高毒性化合物[6]。中國、美國、歐盟、食品法典委員會等均制定了阿維菌素類藥物的最高殘留限量，便于更好地加強此類藥物的殘留監(jiān)測，以保障我國食品安全。

阿維菌素類藥物是帶雙糖支鏈的大環(huán)內酯類化合物，其分子量大，極難被氣化，因而無法應用氣相色譜檢測其物質含量[7-9]。目前主要的試驗手段包括液相色譜-紫外檢測法(HPLC-UV)[10]、液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLD)[11]、免疫親和色譜技術(IAC)[12-13]、液相色譜-串聯(lián)質譜法(HPLC-MS/MS)[14]、超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(UPLC-MS/MS)[15]及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[16]等。筆者采用建立的ELISA法檢測雞肉和蝦肉樣本中的阿維菌素類藥物含量，此法分析時間短、可操作性強，并與高效液相色譜-熒光檢測法進行比對驗證，以驗證貴州勤邦食品安全科學技術有限公司研制的阿維菌素類藥物酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測水平是否達到國家標準，從而為動物源食品中阿維菌素類藥物的快速檢測提供符合要求的檢測手段。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本與試劑。雞肉、蝦肉鮮肉(購自貴陽小河沃爾瑪超市)，其中雞肉取雞胸脯肉、蝦肉取蝦身中間部位；阿維菌素類藥物試劑盒(貴州勤邦食品安全科學技術有限公司自主研發(fā))，其中含有96孔酶標板、標準品×6瓶(0、0.5、1.5、4.5、13.5、40.5 μg/L，1 mL/瓶)、高濃度標準品(1 μg/mL，1 mL/瓶)、酶標二抗、抗體工作液、底物A液、底物B液、終止液、20×濃縮洗滌液、2×濃縮復溶液；阿維菌素標準品，純度≥95%，美國Sigma公司；乙腈、正己烷(分析純，成都金山化學試劑有限公司)。

1.1.2儀器與設備。高速電動勻漿機(FTH-Ⅱ型，浙江中天機械廠)；恒溫振蕩器(CWZ-96B，杭州雅極儀器制造有限公司)；高速離心機(GS39-3B，上海先鋒北利設備有限公司)；渦旋儀(ST-902型，江蘇南京市奧華制造儀器廠)；分析天平(BLC-210.5型，德國Sartorius公司)；超聲波振蕩清洗器(GW SONIC-M4，深圳固特超聲責任有限公司)；微量移液器(單道20～200、100～1 000 μL，多道250 μL，美國Thermo公司)；高效液相色譜(配熒光檢測器，LC-3000，美國安捷倫公司)。

1.2方法

1.2.1酶聯(lián)免疫法試驗檢測原理。采用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附劑法(ELISA)測定樣品中的阿維菌素類藥物，通過在酶標板微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，則樣本中殘留的阿維菌素類藥物和酶標板微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗阿維菌素類藥物的抗體，加入酶標二抗后，用TMB(3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺)底物顯色，樣本測定的吸光度與其所含殘留物阿維菌素類藥物的含量呈負相關，根據樣本測定的吸光度，進一步通過標準曲線公式計算樣本所對應的濃度，再乘以其對應的稀釋倍數，即可計算出樣本中阿維菌素類藥物的殘留量。

1.2.2樣品前處理。

1.2.2.1溶液的配制。

(1)復溶工作液。用去離子水將2×濃縮復溶液按1∶1體積比進行稀釋(1份2×濃縮復溶液+1份去離子水)，用于茶葉和蔬菜樣本的稀釋。復溶工作液在4 ℃環(huán)境可保存1個月。

(2)洗滌工作液。用去離子水將20×濃縮洗滌液按1∶19體積比進行稀釋(1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水)，用于酶標板的洗滌。洗滌工作液在4 ℃環(huán)境可保存1個月。

1.2.2.2樣本預處理。取2支50 mL經清洗、干燥、滅菌的聚苯乙烯離心管，各精確稱取已經破碎均質處理的雞肉、蝦肉組織樣本(3.00±0.05)g，依次加入9 mL乙腈、3 mL正己烷，在恒溫振蕩器中振蕩10 min，再以3 000 r/min的轉速，15 ℃下，離心5 min。精確移取1 mL下層液于10 mL潔凈干燥的玻璃試管中，將其置于50～60 ℃水浴氮氣流中吹干，再加入1 mL復溶工作液，用渦旋儀渦動60 s，超聲波溶解10 min，再繼續(xù)用渦旋儀渦動60 s。移取100 μL溶解后的樣本液，加入100 μL復溶工作液，用渦旋儀渦動30 s，混勻，取20 μL用于分析。

1.2.3樣本中阿維菌素類藥物的測定。試驗前，需保證所有試驗所用試劑回溫至20～25 ℃，且不起泡。從試劑盒中取出微孔板，將樣本和阿維菌素藥物的標準品對應微孔按序進行編號，各做3個平行，標記各自對應位置。一次加入阿維菌素藥物標準品和樣品各20 μL到對應的微孔中，再繼續(xù)加入抗體工作液80 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后在37 ℃避光靜置30 min。移走蓋板膜，吸水紙吸干各孔中的液體，繼而在各孔中加入250 μL洗滌工作液，每間隔10 s清洗1次，重復操作5次左右，直至清洗干凈，最后用吸水紙拍干。

再以每孔100 μL的量加入酶標二抗，輕輕振蕩均勻，蓋板膜蓋板后在37 ℃避光靜置30 min，取出重復洗板工作。依次在各孔中加入底物液A液和B液各50 μL，混勻后繼續(xù)用蓋板膜蓋板，在37 ℃避光環(huán)境進行顯色反應15 min，后在各孔中加入終止液50 μL后混勻，用酶標儀在波長450 nm處檢測，5 min內完成測定過程，讀取每孔OD測定值。

1.2.4樣品中阿維菌素類藥物濃度的計算。

1.2.4.1百分吸光率。即為標準品或樣品的平均吸光度(B)除以空白溶液的平均吸光度(B0)，再乘以100%，表達公式如下：

百分吸光率=B/B0×100%

1.2.4.2標準曲線的繪制與蝦肉樣本阿維菌素類藥物濃度的計算。分別對0、0.5、1.5、4.5、13.5、40.5 μg/L 6個濃度梯度的標準液進行測定，以標準品百分吸光率測定值為縱坐標，阿維菌素類藥物標準品濃度的對數為橫坐標，繪制阿維菌素類藥物的標準曲線，計算回歸方程及相關系數，根據線性方程計算IC50。

將樣品的百分吸光率代入制作好的標準曲線中，可從標準曲線上讀出樣品所對應濃度，乘以其對應被稀釋倍數，即可計算出樣品中阿維菌素類藥物的實際濃度。

1.2.5阿維菌素類藥物酶聯(lián)免疫法測定試劑盒指標檢測方法。分別對試劑盒的靈敏度、特異性、精密度、準確度進行試驗，并與儀器分析進行比較。

1.2.5.1靈敏度。評價免疫法試驗反應靈敏度常用IC50值和最低檢測限表示，IC50值即為零標準溶液吸光度值的50%處對應的藥物濃度，兩者數值的大小與試劑盒的靈敏程度成反比。樣品采集地區(qū)、種類、預處理方法等因素與最低限檢測有較強的關聯(lián)性，而IC50則不受樣本本身的影響，值相對不變。兩者結合，可用于試驗所用試劑盒靈敏度指標的評價。

分別檢測20組空白雞肉、蝦肉樣品，計算其所含阿維菌素類藥物的含量，檢測限為LOD=S+3SD(S為阿維菌素類藥物的濃度平均值，SD為標準差)，根據下面公式計算試劑盒檢測實際樣品的最低檢測限。

式中，X為試驗重復測定空白樣品的平均值；n為試驗測定樣品數量。

1.2.5.2特異性。特異性用交叉反應率表示，其是衡量抗體與各抗原決定簇結合能力強弱的指標，試驗用一定濃度范圍的阿維菌素類藥物類似物取代阿維菌素類藥物標準溶液，根據標準曲線公式，計算各藥物交叉反應率，交叉反應率越低，抗體特異性越好。交叉反應率=引起50%抑制的阿維菌素濃度/引起50%抑制的阿維菌素類似物濃度×100%。

1.2.5.3精密度、準確度。衡量測定方法對多研究樣品重復測定數據的一致程度的指標用精密度表示，其是鑒定試劑盒品質最為基本的參數；準確度是試驗測定值與真實值間符合性程度的指標，這一指標大小是通過樣品回收率計算所得。

在檢測結果為陰性的雞肉、蝦肉樣本各添加5、10和20 μg/kg的阿維菌素類藥物，各設6個平行，根據試劑盒設計方法進行測定操作，計算樣品的回收率。

1.2.5.4試劑盒與儀器檢測結果比較。分別對試劑盒和儀器檢測結果進行靈敏度、精密度、準確度的對比。試劑盒檢測方法根據試劑盒說明書步驟進行操作，儀器檢測分析則參考《農業(yè)部781號公告-5-2006 動物源食品中阿維菌素類藥物殘留量的測定 高效液相色譜法》(動物源性食品中阿維菌素類藥物的檢測限為2 μg/kg)進行操作。

2 結果與分析

2.1標準曲線以阿維菌素類藥物標準品濃度的對數為橫坐標，標準品百分吸光率為縱坐標，繪制標準曲線如圖1所示。以阿維菌素類藥物標準品濃度的對數(log)為橫坐標，抑制率ln[B/(B0-B)]為縱坐標建立雙對數直線擬合曲線如圖2所示，得標準曲線回歸方程為：y=-2.124 8x+0.402 4(R2=0.998 6)，說明試劑盒線性關系良好。

圖1 標準曲線Fig.1 Standard curve

圖2 標準曲線方程Fig.2 Standard curve equation

2.2試劑盒靈敏度由表1可知，空白雞肉和蝦肉樣品的最低檢測限分別為0.76、0.89 μg/kg；試驗測定得出的標準曲線的IC50為1.8～3.5 μg/L，平均值為2.8 μg/L。綜合以上2個數據可以得出，該試劑盒靈敏度高。

表1 空白樣本測定結果統(tǒng)計 Table 1 Measurement results statistics of blank sample μg/kg

2.3試劑盒特異性試驗測定結果得各藥物的交叉反應率依次為阿維菌素100%、伊維菌素45%、埃比菌素90%、多拉菌素<10%，可見各藥物的交叉反應率均不大于100%，表明抗體的特異性均較高。

2.4試劑盒準確度與精密度從表2可知，阿維菌素在雞肉、蝦肉樣品中的加樣品回收率為92.7%～98.6%，其批內、批間變異系數均小于10%，表明該款試劑盒符合且高于國家對試劑盒的備案標準。

2.5與儀器方法的比較

2.5.1靈敏度。準備20份隨機抽取的市場在售的雞肉、蝦肉樣本，2種分析方法測定結果見表3，以2 μg/kg為陽性判定線，當樣品實際檢測結果低于這一判定線，則以“—”表示，高于或等于時則以實際測定值表示。從表3的檢測結果中可得，2種手段所得檢測結果相近，從11號、15號樣品的檢測結果驗證，試劑盒的檢測限較儀器更低，更易檢測出阿維菌素類藥物低殘留的樣品。由此可知，該試劑盒法的檢測符合國家檢測標準且優(yōu)于儀器檢測。

表2 阿維菌素準確度和精密度

2.5.2精密度和準確度。分別按照高效液相色譜和自制試劑盒檢測提供的方法，以5 μg/kg濃度對空白雞肉、蝦肉進行添加回收試驗，比較儀器檢測方法和自制試劑盒檢測方法的平均回收率和變異系數。自制試劑盒檢測方法中，將添加樣品在3塊不同酶標板上測定，做4個平行，計算變異系數。

由表4可知，雞肉樣品中HPLC-FLD的平均回收率為95.2%，變異系數為8.7%；ELISA的平均回收率為95.7%～98.5%，批內、批間變異系數均小于10.0%。蝦肉樣品中HPLC-FLD的平均回收率為95.6%，變異系數為6.1%；ELISA的平均回收率在92.8%～98.3%，批內、批間變異系數均小于10.0%。結果表明自研試劑盒適于實際樣品的阿維菌素類藥物含量的快速精準檢測。

3 結論

采用間接競爭ELISA法對雞肉和蝦肉中阿維菌素類藥物的殘留量進行檢測，并與高效液相色譜法進行比對。結果表明，自主研發(fā)的阿維菌素類藥物ELISA檢測試劑盒靈敏度高，特異性好，準確度與精密度均滿足我國獸藥殘留分析的要求。該方法與儀器檢測結果一致，但其檢測成本低、耗時短、操作時間短，能大大減少操作誤差和工作強度，可滿足動物源性食品中阿維菌素類藥物的現(xiàn)場批量快速檢測需求。

表3自研試劑盒與儀器方法靈敏度比較

Table 3 Compare of sensitivity of the experimental kit and the instrument method μg/kg

表4 精密度和準確度吻合情況檢測結果Table 4 The consistent detection results of precision and accuracy %

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